王維佳 李萌鑫

摘要 介紹當(dāng)下流行的基因編輯技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀以及在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的具體應(yīng)用，對(duì)于種子性狀改良與市場(chǎng)價(jià)值進(jìn)行文獻(xiàn)梳理，試圖說明基因編輯在農(nóng)業(yè)育種上的發(fā)展趨勢(shì)，除了TALEN（transcription activatorlike effector nucleases）和ZFN（zinc finger nuclease）這兩類常用的基因編輯工具外，CRISPR-Cas9（CRISPR-associated protein 9）是目前最為流行的工具，目前已經(jīng)通過 CRISPR/Cas9 改變多項(xiàng)農(nóng)作物性狀，如花色調(diào)控、延長(zhǎng)櫥架壽命、抗殺草劑、提升抗逆境能力、增加抗病性等。由于利用CRISPR/Cas9創(chuàng)造的作物通過孟德爾遺傳分離后，不含其他生物的外源基因，因此不受基因改造法規(guī)的限制，成為科學(xué)界研究與開發(fā)的最新利器。我國(guó)一向高度重視并取得一系列成果，但是對(duì)于最新基因編輯技術(shù)的文獻(xiàn)梳理相對(duì)較少，該研究主要貢獻(xiàn)是結(jié)合最新資料闡述基因編輯技術(shù)在農(nóng)業(yè)育種領(lǐng)域的應(yīng)用，為我國(guó)發(fā)展基因編輯技術(shù)提供文獻(xiàn)參考。

關(guān)鍵詞 基因編輯技術(shù);CRISPR/Cas9;農(nóng)業(yè)育種

中圖分類號(hào) Q943.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2020）03-0018-08

Abstract We introduced the current development of gene editing technology and its specific application in the field of agriculture， combed the literature of seed character improvement and market value， and tried to explain the development trend of gene editing in agricultural breeding.In addition to the commonly used gene editing tools such as TALEN and ZFN， CRISPR/Cas9 is currently the most popular tool， and has now changed a number of crop traits through CRISPR/Cas9， such as flower color regulation， extend shelf life， antiherbicide， improve resistance to stress， increase disease resistance， etc.Since the crops created by CRISPR/Cas9 are isolated through Mendel inheritance and do not contain exogenous genes of other organisms， they are not restricted by genetic modification regulations and have become the latest sharp tool in scientific research and development.China has always attached great importance to and achieved a series of results， but the literature on the latest gene editing technology is relatively less combed. The main contribution of this paper is to combine the latest data to explain the application of gene editing technology in the field of agricultural breeding， and provide literature references for the development of gene editing technology in China.

Key words Gene editing technology;CRISPR/Cas9;Agricultural breeding

隨著全球人口數(shù)量增加，極端氣候所造成糧食作物生產(chǎn)面臨頻繁的生物與非生物不可抗力的干擾，對(duì)于農(nóng)業(yè)育種技術(shù)的改良顯得尤為重要?；蚓庉嫾夹g(shù)在近幾年來發(fā)展迅速，此技術(shù)可針對(duì)選定的基因目標(biāo)區(qū)域序列進(jìn)行編輯，經(jīng)過編輯后的目標(biāo)序列可產(chǎn)生缺失、插入或置換等形式的突變，這些變異形式都具有可遺傳性。目前基因編輯技術(shù)中CRISPR/Cas9系統(tǒng)已經(jīng)應(yīng)用于許多植物上，該研究將介紹此技術(shù)應(yīng)用于農(nóng)業(yè)育種的現(xiàn)狀，其中包含主要糧食作物水稻、小麥與玉米等。依照不同作物的性狀，基因編輯不僅能準(zhǔn)確地對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行誘變，而且可有效地同時(shí)針對(duì)多個(gè)目標(biāo)基因或運(yùn)用于多倍體基因組使序列產(chǎn)生變異。將基因編輯技術(shù)應(yīng)用于作物上可協(xié)助創(chuàng)造出更多耐逆境的品種，為解決全球糧食安全問題提供新思路。

1 新興基因編輯技術(shù)現(xiàn)狀

近年來新興基因編輯技術(shù)如CRISPR系統(tǒng)、TALENs、ZFN、ODM等（表1），通過誘發(fā)突變輔助育種，誘導(dǎo)生物不表現(xiàn)特定基因片段等方法達(dá)成目的。ZFN是1996年發(fā)現(xiàn)可以辨認(rèn)基因特定位置并截切的酵素，其特點(diǎn)是定點(diǎn)核酸酶（site directed nuclease，SDN），具有辨識(shí)特定核酸序列及使雙股DNA斷裂的功能，利用這種技術(shù)概念為基礎(chǔ)[1]，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)ODM、TALENs及CRISPR等技術(shù)都可以使特定序列產(chǎn)生斷裂，繼而誘發(fā)細(xì)胞中DNA自我修復(fù)機(jī)制造成改變[2-3]。而不同于基因改造所造成的不確定性狀，基因編輯技術(shù)可使用“非人為轉(zhuǎn)入外源基因”方式改良傳統(tǒng)育種技術(shù)，降低新品種開發(fā)成本與提高效率，相比傳統(tǒng)誘變技術(shù)更快、更精準(zhǔn)地掌握特定性狀，在培育新品種時(shí)可大大提高效率。

已知的3種最受歡迎的基因編輯技術(shù)CRISPR、TALENs、ZFN，應(yīng)用最多的還是生物工程領(lǐng)域（圖1），但是，最近幾年在農(nóng)作物與經(jīng)濟(jì)類作物中的應(yīng)用逐年增加并日趨成熟。自 CRISPR-Cas9 技術(shù)發(fā)展以來，基因編輯改良植物性狀是主要通過 CRISPR-Cas9 產(chǎn)生的雙鏈斷裂來誘導(dǎo)突變而實(shí)現(xiàn)的。

2 基因編輯技術(shù)在農(nóng)作物領(lǐng)域的應(yīng)用

基因編輯技術(shù)具體分為3種典型的工具：ZFN、TALEN和CRISPR，而其中CRISPR由于操作簡(jiǎn)便、通用性強(qiáng)，引起學(xué)界廣泛關(guān)注并獲得巨大發(fā)展。2012年，美國(guó)加州大學(xué)伯克利分校正式提出利用CRISPR-Cas系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)基因編輯[2] 。

2.1 具體技術(shù)分析

2.1.1 CRISPR。

目前CRISPR應(yīng)用作物除模式植物阿拉伯芥和煙草外，還包括大宗作物，如水稻、小麥，以上2種作物以開發(fā)新抗病或耐逆境品種為主要研究方向，如抗白粉病小麥、抗白葉枯病水稻等，其他作物還包括玉米、高粱、番茄、地錢、柑橘、大豆等，目前已有提高waxy corn支鏈淀粉（amylopectin）含量的基因編輯品種上市，除一般作物外，CRISPR還應(yīng)用在真菌類上，如抗褐化的蘑菇，目前有許多廠商正積極開發(fā)相關(guān)作物，并已有相關(guān)產(chǎn)品通過認(rèn)定準(zhǔn)備上市。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020年

2.1.2 TALENs。

TALENs應(yīng)用的作物除了植物阿拉伯芥及煙草外，還包括水稻、番茄、小麥、大豆和馬鈴薯等，在水稻部分還開發(fā)出抗白葉枯病水稻，在番茄部分則是進(jìn)行生長(zhǎng)激素調(diào)控的研究，而馬鈴薯也有降低褐變速率及減少丙烯酰胺（acrylamide）產(chǎn)生的品種上市。

2.1.3 ZFN。

ZFN-1模式以植物煙草為主，另外也有使用抗除草劑ALS（acetolactate synthase）基因突變或帶有篩選目標(biāo)的基因GUS（bet aglucuronidase gene）或GFP（green fluorescent protein）植株;ZFN-2應(yīng)用于模式植物阿拉伯芥及帶有突變基因GUS植株。

目前基因編輯技術(shù)的應(yīng)用系統(tǒng)包含同源性重組（homologous recombination，HR）、重組酶（recombinase）基因置入、寡核苷酸（oligonucleotide）標(biāo)靶突變及核酸酶（nuclease）標(biāo)靶突變等（表2）。近期研究趨向于開發(fā)應(yīng)用核酸酶系統(tǒng)，主要包含ZFN、TALENs、MGN及CRISPR/Cas技術(shù)平臺(tái)。但就便利性、操作性及效率性來看，CRISPR/Cas系統(tǒng)成為近幾年脫穎而出的技術(shù)平臺(tái)，除了專利發(fā)明的數(shù)量增加外，其投入成本也相對(duì)較低，其中2013年建立的在線CRISPR數(shù)據(jù)庫更是提升了此平臺(tái)的使用性及普及性，在近期內(nèi)也累積了相當(dāng)多的與之相關(guān)的研究成果，同時(shí)也有部分產(chǎn)品被開發(fā)應(yīng)用，如陶氏杜邦（Dow Du Pont）通過CRISPR/Cas技術(shù)平臺(tái)開發(fā)新型改良后的糯玉米（waxy corn）品種，產(chǎn)量問題得以解決，并已取得美國(guó)農(nóng)業(yè)部動(dòng)植物健康檢驗(yàn)局（USDAs Animal and Plant Inspection Service）的批準(zhǔn)，目前已進(jìn)入田間試驗(yàn)階段并有望在市場(chǎng)銷售。

2.2 CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)應(yīng)用現(xiàn)狀

CRISPR/Cas9技術(shù)是目前應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)。CRISPR系統(tǒng)可分為3種類型，第一類型與第三類型的CRISPR系統(tǒng)需要復(fù)雜的Cas蛋白質(zhì)復(fù)合體與crRNA結(jié)合，才能辨識(shí)并剪切目標(biāo)片段;第二類型的CISPR系統(tǒng)，也就是CRISPR/Cas9，只需要Cas9蛋白質(zhì)和crRNA與反式活化CRISPR來源RNA（trans-activating crRNA，tracrRNA）形成復(fù)合體，即可辨識(shí)并剪切目標(biāo)片段[4-6]。2012年將crRNA與trac rRNA合為一條sgRNA（single guide RNA），減少CRISPR/Cas9系統(tǒng)建構(gòu)的復(fù)雜度，經(jīng)測(cè)試，仍具有辨識(shí)并剪切效果，使CRISPR/Cas9系統(tǒng)成為近幾年來最熱門的基因編輯工具[2-3];而我國(guó)2013年初，率先利用CRISPR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)真核細(xì)胞基因組的編輯[7]。

CRISPR/Cas9技術(shù)在動(dòng)物研究領(lǐng)域得以蓬勃發(fā)展。植物細(xì)胞因具有細(xì)胞壁，Cas蛋白質(zhì)與sgRNA，無法通過動(dòng)物細(xì)胞用的顯微注射法（microinjection）或電穿孔法（electroporation）送入細(xì)胞，必須將Cas9與sgRNA構(gòu)筑于DNA載體，再以農(nóng)桿菌媒介編輯法（agrobacteriummediated transformation）或基因槍法（particle bombardment）送入植物基因組中，使Cas9與sgRNA編輯植物基因組中的目標(biāo)序列。應(yīng)用CRISPR/Cas9于植物的報(bào)導(dǎo)最早出現(xiàn)在2013年[8-9]。2013—2015年CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物領(lǐng)域初步使用，直至2015年之后才開始出現(xiàn)明確應(yīng)用CRISPR/Cas9于作物育種的報(bào)導(dǎo)。CRISPR/Cas9系統(tǒng)初期研究中，多以阿拉伯芥（Arabidopsis thaliana）、邊沁煙草（Nicotiana benthamiana）、水稻（Oryza sativa）、高粱（Sorghum bicolor）、小麥（Triticum aestivum）等植物為主。少部分的研究使用甜橙（Citrus sinensis L.“Valencia”）[10-11]、番茄（Solanum lycopersicum）[12]等園藝作物為CRISPR/Cas9系統(tǒng)的材料。初期的研究多采用農(nóng)桿菌滲入法（agroinfiltration）或PEG媒介原生質(zhì)體轉(zhuǎn)型法（PEG-mediated protoplasts transformation），使CRISPR/Cas9產(chǎn)生的基因組編輯發(fā)生于T0世代。Feng等[13]以CRISPR/Cas9使12個(gè)阿拉伯芥的基因發(fā)生突變，突變的基因可遺傳至T3世代。Hsu[14]以CRISPR/Cas9編輯水稻的11個(gè)特定基因，這些由CRISPR/Cas9誘發(fā)的T0世代突變基因，可遺傳至T1世代。以CRISPR/Cas9編輯后的基因遵守孟德爾遺傳定律，可遺傳至植物子代，因此CRISPR/Cas9適合應(yīng)用于作物育種與探索植物基因的功能。

2.2.1 改變花色。

花青素（anthocyanin）為構(gòu)成花卉色彩的色素之一。通過CRISPR/Cas9默化煙草（Nicotianatabacum）與夏堇（Torenia fournieri Linden）的黃烷酮3-羥化酶（flavanone3-hydroxylase，F(xiàn)3H）基因，能使煙草與夏堇的花呈現(xiàn)白色[15]，與Zuker等[16]以RNA干擾（RNA interference，RNAi）使康乃馨（Dianthus caryophyllus L.）的F3H基因默化的結(jié)果相符。

2.2.2 提高抗逆境能力。

ARGOS基因?yàn)橹参镆蚁﹤鲗?dǎo)途徑的負(fù)調(diào)節(jié)因子，為了降低編輯玉米對(duì)乙烯的敏感度，通過轉(zhuǎn)移玉米（Zeamays）的UBIQUITIN1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的ARGOS8基因，在玉米中過量表達(dá)ARGOS8基因，結(jié)果在干旱逆境下，對(duì)比對(duì)乙烯不敏感的玉米的谷粒產(chǎn)量，比非基因編輯的玉米高[17]。通過419種玉米自交系篩選出內(nèi)生ARGOS8 mRNA產(chǎn)量高的玉米品系，但所有自交系的玉米內(nèi)生ARGOS8 mRNA產(chǎn)量都低于編輯UBIQUITIN1∷ARGOS8的玉米。該團(tuán)隊(duì)利用CRISPR/Cas9，將玉米內(nèi)生ARGOS8的啟動(dòng)子，以同源重組修復(fù)的方法，置換為玉米中可連續(xù)表現(xiàn)的GOS2啟動(dòng)子，增加ARGOS8的mRNA表現(xiàn)量。結(jié)果顯示，在開花階段出現(xiàn)缺水逆境時(shí)，GOS2∷ARGOS8玉米的谷粒產(chǎn)量比野生型玉米的谷粒產(chǎn)量高[18]。

2.2.3 延長(zhǎng)壽命與改善品質(zhì)。

番茄的RIN（RIPENIN GINHIBITOR）基因會(huì)促使番茄果實(shí)后熟，誘導(dǎo)內(nèi)源乙烯增生、增加茄紅素（lycopene）的生成量、降解葉綠素（chlorophyll），縮短番茄果實(shí)的保質(zhì)期[19]。野生型番茄的果實(shí)在轉(zhuǎn)紅階段（breaker stage）后5 d呈現(xiàn)橘紅色，然而通過CRISPR/Cas9使RIN基因突變的番茄果實(shí)只呈現(xiàn)黃色。顯示利用CRISPR/Cas9可以使果實(shí)后熟相關(guān)基因默化，延長(zhǎng)果實(shí)保質(zhì)期[20]。美國(guó)賓州州立大學(xué)的物病理學(xué)家楊亦農(nóng)利用CRISPR/Cas9敲除蘑菇（Agaricus bisporus）其中一個(gè)多酚氧化酶（poly phenol oxidase，PPO）基因的功能，使該種PPO活性降低30%，達(dá)到推遲蘑菇褐化速度的目的。杜邦先鋒國(guó)際種子公司（Du Pont Pioneer）利用CRISPR/Cas9將糯玉米（waxy corn）（Zeamays L.sinensis Kulesh）內(nèi)生的Wx1基因敲除。Wx1基因可轉(zhuǎn)譯出胚乳淀粉粒結(jié)合性淀粉合成酵素（endosperms granulebound starchsynthase），使糯玉米產(chǎn)生較多的直鏈淀粉（longchain poly saccharide）。敲除Wx1基因的糯玉米只產(chǎn)生支鏈淀粉（branched poly saccharide amylopectin），排除直鏈淀粉膠化的情形。

2.2.4 抗除草劑。

硫酰尿素類除草劑（sulfonylurea herbicides）能抑制植物的乙酰乳酸合成酵素（aceto lactate synthase，ALS），導(dǎo)致屬于支鏈氨基酸的纈氨酸（valine）、白氨酸（leucine）、異白氨酸（isoleucine）無法合成。將阿拉伯芥與大豆（Glycine max）ALS基因上特定位點(diǎn)的脯氨酸（proline）改為絲氨酸（serine），可使植株對(duì)硫酰尿素類除草劑Chlorsulfuron具有抗性[1，21]。利用CRISPR/Cas9使玉米的ALS2基因產(chǎn)生DSB，將第165個(gè)脯氨酸改為絲氨酸的ALS2單股模板以同源重組修復(fù)的方式進(jìn)入玉米基因組，對(duì)玉米噴灑100 mg/L Chlorsulfuron 21 d后，仍可正常生長(zhǎng)[22-23]，同時(shí)Sun[22]以相同的方式編輯水稻的ALS基因，將水稻ALS基因第548個(gè)及627個(gè)氨基酸密碼子分別由色氨酸（tryptophan）及絲氨酸改為白氨酸與異白氨酸，利用CRISPR/Cas9使改變過的單股ALS基因置換水稻內(nèi)生的ALS基因，可惜沒有成功。進(jìn)一步將改變過的ALS基因與sgRNA及Cas9構(gòu)筑于同一DNA載體上，通過基因槍編輯法與農(nóng)桿菌編輯法將此構(gòu)筑送入水稻愈傷組織，再于含除草劑雙草醚的培養(yǎng)基上篩選，成功獲得抗雙草醚的水稻植株[22-23]。

2.2.5 抗真菌性。

DMR6（downy mildew resistant6）基因解碼為2-oxoglutarateFe（Ⅱ）oxygenase。阿拉伯芥突變體dmr6中，抗病相關(guān)基因與水楊酸（salicylic acid）的含量均顯著提高，使露菌病菌、假單胞桿菌（Pseudomonas syringae）、番椒疫病菌（Phytophthora capsici）較不易感染阿拉伯芥[23]。以CRISPR/Cas9使番茄的DMR6（SlDMR6）基因產(chǎn)生5個(gè)與7個(gè)核苷酸缺失，引起移碼突變，造成DMR6轉(zhuǎn)譯的蛋白質(zhì)失去功能[24]。經(jīng)病原菌接種試驗(yàn)后顯示，由CRISPR/Cas9產(chǎn)生的dmr6番茄突變株對(duì)假單胞桿菌及番椒疫病菌具有抗性，突變株與野生型番茄的株高無顯著差異。

稻熱?。╮ice blast）由稻熱病菌（Magnaporthe oryzae）引起。稻熱病會(huì)使水稻產(chǎn)量減少，造成稻農(nóng)受到嚴(yán)重的損失。OsERF922基因突變會(huì)使水稻抗稻熱病的相關(guān)基因表現(xiàn)量提高，使水稻不容易感染稻熱病。以RNAi技術(shù)默化水稻OsERF922基因，可以增加水稻對(duì)稻熱病的抗病性[25]。通過CRISPR/Cas9 默化水稻的OsERF922基因也能增強(qiáng)水稻對(duì)稻熱病的抗病性。將以CRISPR/Cas9獲得的抗稻熱病水稻自交，使突變的OsERF922基因與帶有Cas9/sgRNA的T-DNA（transfer DNA）分離，獲得只帶有OsERF922突變基因的T2世代抗稻熱病水稻。T2世代抗稻熱病水稻的株高、結(jié)實(shí)率及種子千粒重等農(nóng)藝性狀與野生型的水稻間無顯著差異[11-13，25]。顯示經(jīng)CRISPR/Cas9 只編輯植物的目標(biāo)基因，并不影響植物的其他基因。

2.2.6 抗病性。

以農(nóng)桿菌滲入法將番茄黃化卷葉病毒（tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）復(fù)制起始點(diǎn)（origin of replication）的sgRNA表現(xiàn)于編輯Cas9內(nèi)切酶（Cas9 endonuclease）基因的邊沁煙草，再接種TYLCV。TYLCV的基因組DNA于植株內(nèi)的累積量受到CRISPR/Cas9系統(tǒng)的干擾而有效地減少[26]。為觀察CRISPR/Cas9系統(tǒng)表現(xiàn)活性，將菜豆黃矮病毒（bean yellow dwarf virus，BeYDV）載體中的移動(dòng)蛋白（movement protein）與外鞘蛋白（coat protein）基因，以綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因取代，并與有Cas9及BeYDVsgRNA的構(gòu)筑共同編輯野生型邊沁煙草對(duì)比[27]。BeYDV病毒載體受到Cas9與sgRNA表現(xiàn)影響，病毒載體所表達(dá)的GFP訊號(hào)強(qiáng)度減弱，顯示CRISPR/Cas9技術(shù)可有效干擾植物病毒的基因。植物的真核轉(zhuǎn)譯作用起始因子4E（eukaryotic translation initiation factors，eIF4E）可與mRNA的5′端帽（5′-terminal cap）作用，參與mRNA轉(zhuǎn)譯[28]。eIF4E與馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）的病毒蛋白基因組結(jié)合（viral protein genomelinked，VPg）蛋白，可協(xié)助Potyvirus完成病毒的生命周期。編輯Cas9與eIF4E亞型（eIF（iso）4E）的sgRNA至阿拉伯芥，使eIF（iso）4E突變。eIF（iso）4E阿拉伯芥編輯株經(jīng)自交分離后，獲得純型合子且非基因編輯的eIF（iso）4E阿拉伯芥突變株T2世代。經(jīng)接種蕪菁嵌紋病毒（Turnip mosaic virus）后，eIF（iso）4E突變株表現(xiàn)抗病性[29]。Chandrasekaran等[30]、Caj等[31]也以 CRISPR/Cas9 技術(shù)使黃瓜（Cucumis sativus L.）的eIF4E突變，再經(jīng)由雜交而獲得純型合子且非基因編輯的T3世代eIF4E黃瓜突變株。病毒接種試驗(yàn)顯示，eIF4E黃瓜突變株對(duì)黃瓜黃脈病毒（Cucumber vein yellowing virus）、矮南瓜黃化嵌紋病毒（Zucchini yellow mosaic virus）及木瓜輪點(diǎn)病毒-西瓜型（Papayar ingspot virus-watermelon strain）具有抗病性。

CRISPR/Cas9、ZFN與TALEN等技術(shù)的發(fā)展使編輯特定基因更為容易，已應(yīng)用在農(nóng)作物抗病、延長(zhǎng)水果保質(zhì)期、改變花卉色彩等農(nóng)業(yè)性狀的改良[32-34]。CRISPR/Cas9可以取代RNAi及基因編輯技術(shù)，默化特定基因，再通過孟德爾遺傳，使得到的植株中Cas9和sgRNA等編輯基因，在子代與編輯后的基因分離，可視為非基因編輯植物。通過CRISPR/Cas9技術(shù)，可以同時(shí)編輯多個(gè)目標(biāo)基因，而不改變作物原本的優(yōu)良性狀[35-37]。綜合以上幾種優(yōu)勢(shì)，CRISPR/Cas9將廣泛應(yīng)用于作物育種[4，38-39]。

3 農(nóng)業(yè)基因編輯技術(shù)發(fā)展趨勢(shì)

基因技術(shù)應(yīng)用的目的是提高農(nóng)作物生存率與生產(chǎn)率，農(nóng)業(yè)基因技術(shù)在近幾年獲得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，近幾年極端氣候、疾病和害蟲的概率大大增加，與之相對(duì)的發(fā)展中國(guó)家面臨人口增長(zhǎng)而糧食和農(nóng)業(yè)用地逐漸減少的現(xiàn)實(shí)。通過基因技術(shù)改善農(nóng)作物的基因性狀，促進(jìn)品種迭代加速和適應(yīng)環(huán)境能力的提升在目前農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)領(lǐng)域被廣泛關(guān)注。

可以看出，基因編輯技術(shù)在植物作物中的應(yīng)用逐漸增加，市場(chǎng)規(guī)模逐漸擴(kuò)大。為了滿足需求的增加，基因編輯技術(shù)在作物中應(yīng)用的比重也在上升[26，40]（表3）。

為了更加詳細(xì)了解基因編輯技術(shù)在農(nóng)作物領(lǐng)域的應(yīng)用，表4利用國(guó)際專利數(shù)據(jù)庫-Derwent Innovation（DI）整理與匯總2007年1—12月這10年的發(fā)明專利情況，涵蓋了35 491件發(fā)明（DWPI專利組），并以德溫特世界專利索引（Derwent World Patent Index（DWPI）Manual Code）技術(shù)分類號(hào)進(jìn)行技術(shù)趨勢(shì)分析，探討目前國(guó)際基因技術(shù)整體的趨勢(shì)[41-42]。

在這些經(jīng)濟(jì)物種上的與之相對(duì)應(yīng)的基因技術(shù)平臺(tái)仍是以雜交（hybrid/cross breed）、人工授粉/精（artificial pollination/insemination）及遺傳選型交配（genetic assertive mating/inbreeding）等傳統(tǒng)育種方式的專利發(fā)明數(shù)據(jù)量最多，但育種技術(shù)在歷經(jīng)10年的遺傳基因工程及分子生物技術(shù)的精進(jìn)以及技術(shù)改良后，也逐漸發(fā)生變化，并且形成一定趨勢(shì)。從技術(shù)發(fā)展多元化角度看，除了前期傳統(tǒng)育種技術(shù)外，之后的基因定序技術(shù)、基因探勘技術(shù)使得近幾年育種技術(shù)的發(fā)明更多元化[43]，其中包括植物農(nóng)桿菌基因編輯技術(shù)、分子篩選/標(biāo)志技術(shù)、核酸干擾或是沉默基因等技術(shù)的發(fā)展，都是從遺傳性狀改變或基因調(diào)控方面去作育種改良。從數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)近期（2014年后）在產(chǎn)業(yè)上被專家們認(rèn)定是基因編輯（genome editing）技術(shù)的ZFN、TALENs、CRISPR/Cas的發(fā)明數(shù)量有明顯增加的趨勢(shì)，尤其是CRISPR技術(shù)平臺(tái)在2016年的發(fā)明量達(dá)108件，也凸顯了此技術(shù)平臺(tái)在品種改良技術(shù)中的創(chuàng)造性（表5）。雖然巨核酸酶（mega nucleases，MGN）、寡核苷酸（oligo nucleotide）標(biāo)靶突變及重組酶（recombinase）基因置入等技術(shù)平臺(tái)在農(nóng)業(yè)基因技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域上有所增長(zhǎng)，但是和已經(jīng)逐漸成熟的技術(shù)平臺(tái)相比還具有很大的上升空間。

就近期針對(duì)發(fā)明及運(yùn)用基因編輯技術(shù)平臺(tái)的專利權(quán)人來看，美國(guó)陶氏杜邦（Dow DuPont）的發(fā)明量高達(dá)67件，多數(shù)集中在運(yùn)用ZFNs及CRISPR/Cas9技術(shù);其次為先正達(dá)（Syngenta），發(fā)明數(shù)量44件，多運(yùn)用在CRISPR/Cas9技術(shù)平臺(tái);而雷杰納?。≧egeneron）藥廠居第3位，有26件發(fā)明量?？梢园l(fā)現(xiàn)專注在此技術(shù)開發(fā)的專利權(quán)人大多為植物作物或是種子種苗的國(guó)際廠商。除此之外，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院（CAAS China）也有22件的發(fā)明量，且以CRISPR/Cas9技術(shù)平臺(tái)的發(fā)明最多。

在技術(shù)CRISPR/Cas9研發(fā)方面，美國(guó)保持著優(yōu)勢(shì)地位，我國(guó)科研機(jī)構(gòu)在CRISPR/Cas9平臺(tái)建設(shè)方面也取得了一定成績(jī)（圖2）。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院聯(lián)合國(guó)際水稻研究所完成了全球3 000份水稻DNA的重測(cè)序工作，為研究水稻靶向基因、指導(dǎo)水稻育種提供了重要技術(shù)支持[44]。

基因技術(shù)包括很多，按照產(chǎn)值可以分為DNA/RNA sequencing、Genotyping、 Marker-assisted、selection、Gene expression profiling、GMO/trait purity、DNA extraction/purification。由表2可見產(chǎn)值比例較高的集中在核酸的序列分析、遺傳基因的分型及基因分子標(biāo)識(shí)的篩選等技術(shù)項(xiàng)目，且各產(chǎn)值分別達(dá) 18.770億、18.233億及16.899億美元（表5）。預(yù)計(jì)到2021年全球各基因技術(shù)的市場(chǎng)產(chǎn)值可達(dá)135.588億美元，此產(chǎn)業(yè)市場(chǎng)的復(fù)合增長(zhǎng)率（CAGR %）高達(dá)7.8 %。

近年來國(guó)際市場(chǎng)在面對(duì)因?yàn)闃O端氣候逐漸增加的同時(shí)出現(xiàn)糧食安全危機(jī)的市場(chǎng)環(huán)境下，推動(dòng)科技進(jìn)步和技術(shù)更新，從市場(chǎng)規(guī)模的增長(zhǎng)可以看出基因技術(shù)的重要程度。

從圖2可以看出，基因技術(shù)的應(yīng)用趨向于植物作物，并且多用于油料作物、谷類作物和豆類作物。其中水稻（rice）是重點(diǎn)基因編輯對(duì)象，說明為了應(yīng)對(duì)全球糧食危機(jī)，應(yīng)重點(diǎn)發(fā)展糧食作物的基因編輯技術(shù)。

4 小結(jié)與展望

為了應(yīng)對(duì)未來糧食需求與極端氣候，基因編輯技術(shù)應(yīng)用于農(nóng)業(yè)市場(chǎng)的主要目的是物種改良，使新品種產(chǎn)能提高、繁育率增加及儲(chǔ)藏時(shí)間延長(zhǎng)等，功能性地改善農(nóng)作物的具體性狀以提高產(chǎn)量。從近期專利發(fā)明的數(shù)量以及相關(guān)文獻(xiàn)的分析整理方面可以看出國(guó)際種子種苗企業(yè)對(duì)于基因編輯技術(shù)平臺(tái)的高度重視。CRISPR/Cas9、ZFN與TALEN等技術(shù)的發(fā)展使編輯特定基因更為容易，這些技術(shù)目前主要應(yīng)用在農(nóng)作物抗病、延長(zhǎng)果園產(chǎn)品櫥架壽命、改變花卉色彩等農(nóng)業(yè)性狀的改良方面。CRISPR/Cas9可以取代RNAi及轉(zhuǎn)基因技術(shù)，默化特定基因，再通過孟德爾遺傳，使得到的植株中Cas9和sgRNA等基因在子代與編輯后的基因分離，可視為非轉(zhuǎn)基因植物。通過CRISPR/Cas9技術(shù)，基本可以同時(shí)編輯多個(gè)目標(biāo)基因，而不改變作物原本的優(yōu)良性狀。綜合以上幾種優(yōu)勢(shì)，CRISPR/Cas9將廣泛應(yīng)用于作物育種。目前我國(guó)相關(guān)研究還比較薄弱，除了投入研究資源外，還應(yīng)該積極地與其他具有基因編輯技術(shù)研發(fā)能力的小型生物實(shí)驗(yàn)室或研究單位共同合作，加速運(yùn)用技術(shù)平臺(tái)所開發(fā)的作物產(chǎn)品推廣進(jìn)程，增加市場(chǎng)糧食供應(yīng)量。當(dāng)然，技術(shù)與產(chǎn)品從開發(fā)到推廣是個(gè)漫長(zhǎng)的過程，在植物作物基因改變的情況下仍存在著諸多問題，但是科技發(fā)展刻不容緩，如何在環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)與研發(fā)投入間取得效益的平衡也是將來需要克服的問題。

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