陳 睿,鐘茂程,楊燕紅,陳旭波

(麗水學院生態(tài)學院,浙江麗水 323000)

花葉滇苦菜(Sonchusasper(L.)Hill)隸屬于菊科苦苣菜屬一年生草本植物[1]。原產(chǎn)歐洲和地中海,在中國列為一般入侵植物[2]?；ㄈ~滇苦菜具有清熱解毒、消腫排膿、涼血化瘓、消食和胃、清肺止咳、益肝利尿的功效,臨床用于治療急性痢疾、腸炎、痔瘡腫痛等癥[3-4]。

黃酮類化合物在菊科苦苣菜屬中普遍存在?；舯虋櫟萚5]利用高效液相色譜,比較了苣荬菜、苦苣菜、長裂苦苣菜、南苦苣菜、花葉滇苦菜全草的黃酮含量(涉及槲皮素、木犀草素和芹菜素),推斷黃酮含量較高的前3種植物藥效可能高于后2種。另外,該屬植物總黃酮在保肝[6]、抗氧化[7-8]方面的生物活性均得到了證實。目前,未見花葉滇苦菜地上和地下部分總黃酮提取工藝與生物活性的研究報道。微波輔助提取法是近年來發(fā)展起來的一種高效提取活性物質(zhì)的方法,具有縮短提取時間、降低能耗等優(yōu)勢,對提取設備要求低,更易于實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化[9-11]?；ㄈ~滇苦菜作為入侵植物,資源非常豐富,而該屬植物黃酮提取工藝的研究主要集中在苦苣菜和苣荬菜,很少涉及到花葉滇苦菜[5],因此,本文以花葉滇苦菜地上部分和地下部位為研究對象,研究其總黃酮的提取工藝,在此基礎上,探究其總黃酮提取液乙酸乙酯萃取物的抑菌活性,為該資源的合理開發(fā)利用打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花葉滇苦菜 野外采集,分地上部分(莖葉)和地下部分(根),室外(約25 ℃)陰干至恒重,分別用打粉機打粉,過40目篩,備用;所有供試菌種 由麗水學院醫(yī)學與健康學院提供;蘆丁(HPLC≥98%) 北京世紀奧科生物技術有限公司；硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇 均為分析純,天津市大茂化學試劑廠；亞硝酸鈉 浙江省蘭溪市化工試劑廠。

UV752N紫外可見分光光度計 上海精科實驗儀表有限公司;SHZ-95B真空泵 上海鷹迪儀器設備有限公司;Grant SUB Aqua 12 Plus水浴鍋 Grant Instruments(Cambridge)Ltd;Galanz P70F20CN3P-SR(WO)型微波爐 廣東格蘭仕微波生活電器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 花葉滇苦菜總黃酮的提取及乙酸乙酯萃取物的制備 微波輔助參考王趙改等[10]的方法,取花葉滇苦菜不同部位粉末5 g,放入直徑為9 cm 的玻璃培養(yǎng)皿中,用蒸餾水濕潤均勻。靜置一段時間后放入功率可調(diào)的微波爐中進行預處理。將預處理好的樣品放入錐形瓶中,加入一定濃度的乙醇溶液恒溫水浴提取一段時間,抽濾除渣,得黃酮提取液,總黃酮得率待測。

將黃酮提取液用乙酸乙酯萃取3次,取乙酸乙酯萃取相,用旋轉蒸發(fā)儀回收乙酸乙酯,得到乙酸乙酯萃取物。

1.2.2 花葉滇苦菜總黃酮的測定 總黃酮含量測定采用硝酸鋁顯色法[12]。用紫外-可見分光光度計于510 nm處測吸光度,根據(jù)回歸方程,計算總黃酮濃度。

其中:a為稀釋倍數(shù);v為提取液體積,mL;c為提取液總黃酮的濃度,mg/mL;w為花葉滇苦菜不同部位粉末質(zhì)量,5 g。

1.2.3 花葉滇苦菜總黃酮提取條件單因素實驗 以總黃酮得率為指標,選擇以下8個因素進行單因素實驗。分別是汽化劑用量、浸潤時間、微波功率、微波時間、乙醇濃度、料液比、水浴溫度、水浴時間。

1.2.3.1 地上部分提取單因素實驗 固定微波功率420 W、微波時間60 s、乙醇濃度70%、料液比1∶30 g/mL、水浴溫度60 ℃、水浴時間30 min、浸潤時間5 min,考察不同汽化劑用量(0、2.5、7.5、15.0、20.0 mL)對總黃酮得率的影響;固定汽化劑用量2.5 mL、微波功率420 W、微波時間60 s、乙醇濃度70%、料液比1∶30 g/mL、水浴溫度60 ℃、水浴時間30 min,考察不同浸潤時間(2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、60.0 min)對總黃酮得率的影響;固定微波時間60 s、乙醇濃度70%、料液比1∶30 g/mL、水浴溫度60 ℃、水浴時間30 min,浸潤時間5 min、汽化劑用量2.5 mL,考察不同微波功率(350、420、490、560、630、700 W)對總黃酮得率的影響;固定乙醇濃度70%、料液比1∶30 g/mL、水浴溫度60 ℃、水浴時間30 min,浸潤時間5 min、汽化劑用量2.5 mL、微波功率420 W,考察不同微波時間(0、30、60、90、120、150 s)對總黃酮得率的影響;固定料液比1∶30 g/mL、水浴溫度60 ℃、水浴時間30 min,浸潤時間5 min、汽化劑用量2.5 mL、微波功率420 W、微波時間90 s,考察不同乙醇濃度(30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%)對總黃酮得率的影響;固定水浴溫度60 ℃、水浴時間30 min,浸潤時間5 min、汽化劑用量2.5 mL、微波功率420 W、微波時間90 s、乙醇濃度60%,考察不同料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL)對總黃酮得率的影響;固定水浴時間30 min,浸潤時間5 min、汽化劑用量2.5 mL、微波功率420 W、微波時間90 s、乙醇濃度60%、料液比1∶30 g/mL,考察不同水浴溫度(40、50、60、70、80 ℃)對總黃酮得率的影響;固定浸潤時間5 min、汽化劑用量2.5 mL、微波功率420 W、微波時間90 s、乙醇濃度60%、料液比1∶30 g/mL、水浴溫度70 ℃,考察不同水浴時間(30、60、90、120、150、180 min)對總黃酮得率的影響。

1.2.3.2 地下部分提取單因素實驗 固定浸潤時間5 min、微波功率420 W、微波時間90 s、乙醇濃度60%、料液比1∶30 g/mL、水浴溫度70 ℃、水浴時間30 min,考察不同汽化劑用量(0、2.5、7.5、15.0、20.0 mL)對總黃酮得率的影響;固定微波時間90 s、乙醇濃度60%、料液比1∶30 g/mL、水浴溫度70 ℃、水浴時間30 min,汽化劑用量0 mL,考察不同微波功率(350、420、490、560、630、700 W)對總黃酮得率的影響;固定乙醇濃度60%、料液比1∶30 g/mL、水浴溫度70 ℃、水浴時間30 min,汽化劑用量0 mL、微波功率420 W,考察不同微波時間(0、30、60、90、120、150 s)對總黃酮得率的影響;固定料液比1∶30 g/mL、水浴溫度70 ℃、水浴時間30 min,汽化劑用量0 mL、微波功率420 W、微波時間90 s,考察不同乙醇濃度(30%、40%、50%、60%、70%、80%)對總黃酮得率的影響(選擇的梯度已經(jīng)有明顯的變化趨勢,與地上部分濃度選擇略有差異);固定水浴溫度70 ℃、水浴時間30 min,汽化劑用量0 mL、微波功率420 W、微波時間90 s、乙醇濃度60%,考察不同料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL)對總黃酮得率的影響;固定水浴時間30 min,汽化劑用量0 mL、微波功率420 W、微波時間90 s、乙醇濃度60%、料液比1∶30 g/mL,考察不同水浴溫度(40、50、60、70、80、90 ℃)對總黃酮得率的影響;固定汽化劑用量0 mL、微波功率420 W、微波時間90 s、乙醇濃度60%、料液比1∶30 g/mL、水浴溫度70 ℃,考察不同水浴時間(30、60、90、120、150、180 min)對總黃酮得率的影響。

表1 正交實驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

考慮到地下部分單因素實驗中最佳汽化劑用量為0,因此去除對浸潤時間的優(yōu)化。

1.2.4 花葉滇苦菜總黃酮提取正交試驗 根據(jù)單因素實驗結果設計因素水平,以總黃酮得率為響應值,進行8因素3水平(地上部分)和7因素3水平(地下部分)實驗設計。實驗因素和水平見表1?？紤]到地下部分單因素實驗中最佳汽化劑用量為0,因此去除浸潤時間的優(yōu)化。

1.2.5 花葉滇苦菜總黃酮提取液乙酸乙酯萃取物的抑菌活性測定 抑菌實驗參考標準參照CLSI標準[13],測定總黃酮提取液乙酸乙酯萃取物對銅綠假單胞菌(ATCC9027)及其耐藥菌(PA1)、金黃色葡萄球菌(ATCC29213)及其耐藥菌(SA1)、大腸桿菌(ATCC25922)的抑菌活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

正交表設計及極差分析由Minitab18完成;方差分析由Spss 16.0完成。

2 結果與分析

2.1 黃酮標準曲線制作

由圖1可知,黃酮標準曲線方程為y=9.1875x+0.0094,R2=0.9987,線性關系良好。

圖1 黃酮標準曲線Fig.1 Standard curve of flavonoids

2.2 總黃酮提取工藝單因素實驗結果

由圖2可知,地上部分汽化劑用量為2.5 mL時,黃酮得率達到了最佳。而地下部分最佳汽化劑用量為0 mL,可能是因為汽化劑用量的增加,使粉末收到的單位微波能量下降,微波效果降低[14]。由圖3可知,當浸潤時間超過5 min時,黃酮得率逐漸下降,因此,最佳浸潤時間為5 min。由于地下部分的最佳汽化劑量為0 mL,因此浸潤時間不考慮。由圖4可知,微波功率為420 W時,黃酮得率達到最大,因此地上和地下部分的最佳功率均為420 W。由圖5可知,微波時間對總黃酮的得率均有一定的影響,最佳時間為90 s。微波功率和微波時間的進一步增加會對黃酮產(chǎn)生破壞作用,從而降低其得率[15]。由圖6可知,當乙醇濃度超過60%時,黃酮得率隨著濃度升高逐漸降低,因此地上和地下部分的最佳乙醇濃度為60%時。黃酮得率在高濃度乙醇條件下反而降低,這與高濃度乙醇自身的揮發(fā)性以及高濃度乙醇會溶解色素、脂溶性等物質(zhì)密切相關[16]。由圖7可知,當料液比為1∶30 g/mL時,黃酮得率達到最佳。由圖8可知,隨著溫度的升高黃酮得率逐漸升高,但是當水浴溫度超過70 ℃以后,得率逐漸下降,這與高溫會破壞黃酮有關[17]。因此,水浴溫度70 ℃為最優(yōu)條件。由圖9可知,隨著水浴時間的延長,黃酮得率反而降低,方差分析顯示,30 min時的黃酮得率與90、120、150、180 min時的黃酮得率均存在顯著差異(F=17.499,P<0.05)。前期微波預處理已經(jīng)使花葉滇苦菜的細胞壁充分被破壞,在水浴30 min時,大量黃酮類物質(zhì)被溶出,并且達到平衡,水浴時間的進一步增加反而會使黃酮中的一些熱敏性物質(zhì)遭到破壞,乙醇揮發(fā)也增加,進而影響黃酮得率[18]。因此,在微波條件下,水浴時間30 min是提取的最佳時間。而0～30 min水浴時間內(nèi)的黃酮得率變化有待于進一步試驗。

圖2 汽化劑用量對總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of vaporization solvent mass on flavonoid yield

圖3 浸潤時間對總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of wetted time on flavonoid yield

圖4 微波功率對總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of microwave power on flavonoid yield

圖5 微波時間對總黃酮得率的影響 Fig.5 Effect of microwave time on flavonoid yield

圖6 乙醇濃度對黃酮得率的影響Fig.6 Effect of ethanol concentration on flavonoid yield

圖7 料液比對總黃酮得率的影響Fig.7 Effect of ratios of material to water on flavonoid yield

圖8 水浴溫度對總黃酮得率的影響Fig.8 Effect of water bath temperature on flavonoid yield

圖9 水浴時間對總黃酮得率的影響Fig.9 Effect of water bath time on flavonoid yield

2.3 正交試驗結果

2.3.1 地上部分總黃酮提取正交優(yōu)化結果及驗證實驗 在正交試驗3中,當汽化劑用量0 mL,微波輻射時間為120 s,浸潤時間為10 min,微波功率為350 W,乙醇濃度為60%,水浴提取溫度70 ℃,水浴提取料液比1∶40 g/mL,水浴提取時間為60 min時,花葉滇苦菜地上部分的黃酮得率為38.328 mg/g,為正交最優(yōu)值。極差分析結果顯示,對黃酮得率的影響大小順序為:浸潤時間>乙醇濃度>水浴溫度>微波功率>水浴時間>汽化劑用量>微波時間>料液比(見表2)。

表2 花葉滇苦菜地上部分正交試驗結果Table 2 Orthogonal test results of Sonchus asper aerial parts

以各因素下均值最高的作為該因素的水平,得到一個組合,即浸潤時間10 min、氣化劑用量7.5 mL、微波功率350 W、微波時間120 s、乙醇濃度70%、料液比1∶30 g/mL、水浴溫度80 ℃、水浴時間60 min,在此條件下進行驗證實驗。此條件下黃酮提取率為36.937 mg/g。因此,取正交試驗3條件為最優(yōu)工藝。

2.3.2 地下部分總黃酮提取正交優(yōu)化結果及驗證實驗 地下部分正交實驗中,當汽化劑用量0 mL,微波功率為490 W,微波時間為120 s,乙醇濃度為70%,料液比為1∶40 g/mL,水浴溫度80 ℃,水浴時間為90 min時,其黃酮得率為7.111 mg/g,由極差分析可知,在對黃酮得率影響大小順序為汽化劑用量>微波時間>水浴溫度>料液比>乙醇濃度>微波功率>水浴時間(見表3)。

以各因素下均值最高的作為該因素的水平,得到一個組合,即汽化劑用量0 mL、微波功率490 W、微波時間90 s、乙醇濃度70%、料液比1∶30 g/mL、水浴溫度80 ℃、水浴時間90 min,在此條件下進行驗證實驗。此條件下黃酮得率為7.232 mg/g。因此,該工藝條件為最優(yōu)工藝。

表3 花葉滇苦菜地下部分正交試驗結果Table 3 Orthogonal test results of Sonchus asper underground parts

表5 不同濃度下花葉滇苦菜地下/地上部分總黃酮提取液乙酸乙酯萃取物的抑菌活性Table 5 Antimicrobial activity of ethyl acetate extracts of total flavonoids extract from underground and aerial parts of Sonchus asper

2.3.3 與傳統(tǒng)提取方法的比較 由表4可知,花葉滇苦菜地上部分正交處理的黃酮得率為38.328 mg/g,比單因素實驗的最優(yōu)組合要高出7.652%;經(jīng)過微波處理后(正交處理)的黃酮得率比傳統(tǒng)水浴提取提高了12.415%。而花葉滇苦菜地下部分微波輔助的黃酮得率相較于傳統(tǒng)的水浴提取提高了118.028%。

表4 微波處理法與傳統(tǒng)提取法的比較Table 4 Comparison of microwave processing and traditional extraction

2.4 花葉滇苦菜總黃酮提取液乙酸乙酯萃取物的抑菌活性

抑菌結果顯示,地上部分乙酸乙酯萃取物的活性較好,對金黃色葡萄球菌耐藥菌的MIC為4.0 mg/mL,優(yōu)于地下部分的8.0 mg/mL。當乙酸乙酯萃取物的濃度為16.0 mg/mL以下時,對其它3種細菌均沒有抑制效果。

3 討論與結論

本研究比較了去除微波輻射預處理前后的總黃酮得率,結果表明,在微波輻射預處理下,地上部分總黃酮得率提高了12.415%,地下部分總黃酮得率提高了118.028%。另外,地下部分提取水浴時間僅需要30 min,進一步證實了經(jīng)過微波輻射預處理提高了后續(xù)提取的效率[10]。研究表明花葉滇苦菜中的黃酮類物質(zhì)含量較苦苣菜低[5],安卓等[7]利用超高壓法提取苦苣菜中的總黃酮,得率僅為5.753 mg/g,其結果遠低于本研究微波輻射預處理提取得率38.328 mg/g(地上部分)和7.232 mg/g(地下部分),進一步證明了微波輻射預處理的優(yōu)越性,逐漸成為一種理想的植物活性物質(zhì)提取方法[19]。

在微波預處理提取的因素中,汽化劑用量對不同部位的總黃酮得率影響存在差異,其中地下部分的汽化劑用量為20 mL時,其黃酮得率處于極低的水平,可能是用量過多吸收了絕大部分微波。較高的微波功率和較長的時間均能對總黃酮產(chǎn)生破壞,從而影響其提取率。上述結論與王趙改等[10]的研究結論一致。

花葉滇苦菜總黃酮提取液乙酸乙酯萃取物對金黃色葡萄球菌及其耐藥菌抑菌效果較強,其MIC值不超過8 mg/mL。抑菌效果遠優(yōu)于杭白菊乙酸乙酯提取物(60 mg/mL)[20]、飛機草總黃酮提取物(15.6 mg/mL)[21]和油樟葉總黃酮(16 mg/mL)[22]的抑菌效果。今后,有望在分離、純化抑菌活性成分等方面做進一步研究。