胡經(jīng)緯，曾 禎，李明星*，李 璇，胡衛(wèi)中

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科，四川 瀘州 646000；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 四川省人民醫(yī)院心血管超聲及心功能科，四川 成都 610072)

失血性休克(hemorrhagic shock, HS)指短時間內(nèi)有效循環(huán)血量大量丟失或大量減少，組織器官血液灌注不足。腎臟作為少有側(cè)支循環(huán)的高灌注臟器，依靠血流灌注壓力和血液流動來維持濾過與重吸收之間的平衡，HS時血壓過低超過腎臟自我調(diào)節(jié)能力可致腎小球濾過率(glomerular filtration rate, GFR)降低，腎功能受損。腎臟微循環(huán)灌注改變在急性腎損傷(acute kidney injury, AKI)發(fā)展中扮演重要角色。早期有效監(jiān)測腎臟血流動力學(xué)變化，能早期診斷、及早干預(yù)、最大程度減輕腎損傷、促進腎功能恢復(fù)。本研究超聲造影(contrast-enhanced ultrasound， CEUS)運用定量分析技術(shù)實時觀察大鼠腎臟血流灌注、特別是腎皮質(zhì)的微循環(huán)灌注變化，以期為臨床早期、有效干預(yù)和治療HS提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康成年雄性SD大鼠24只[體質(zhì)量(300±50)g，成都達碩實驗動物有限公司提供]，于恒溫動物房(25℃)適應(yīng)性喂養(yǎng)3天，自由攝入食水，術(shù)前6 h停飼、停水。隨機將大鼠分為假手術(shù)組(Sham組)、輕度HS組(T1組)、中度HS組(T2組)及重度HS組(T3組)，每組6只。

1.2 HS模型建立 腹腔注射肝素鈉溶液(10 mg/kg體質(zhì)量)進行全身肝素化，15 min后以10%水合氯醛行腹腔麻醉(2 ml/kg體質(zhì)量，規(guī)格10 ml：1 g)，備皮后保定于手術(shù)臺上。于頸部偏左側(cè)做一縱形切口，鈍性分離左側(cè)頸總動脈，置入24G留置針并固定。連通多導(dǎo)生物轉(zhuǎn)化器并實時監(jiān)測平均動脈壓(mean arterial pressure， MAP)，記為MAP0。同法于左側(cè)股總動脈及靜脈內(nèi)分別置入24G留置針，經(jīng)左側(cè)股總動脈迅速放血，MAP下降達到70% MAP0時記為MAP1。經(jīng)左側(cè)股總動脈少量放血，或左側(cè)股總靜脈少量補液(晶體∶膠體=2∶1)，維持MAP160 min，標(biāo)志T1組模型建造成功。以同樣方法制備T2組(50%MAP0)、T3組(40%MAP0)動物模型。對Sham組僅行全身肝素化、腹腔麻醉、血管插管及監(jiān)測MAP0操作。

1.3 儀器與方法 采用Siemens ACUSON S3000超聲診斷儀，9L-4變頻線陣探頭，參數(shù)：深度3.5 cm、頻率4.0 MHz、機械指數(shù)0.05。以SonoVue(上海Bracco公司)為超聲造影劑，將5.0 ml生理鹽水注入瓶內(nèi)用力振蕩，配置成六氟化硫微泡混懸液。模型建造成功后穩(wěn)定10 min，行右腎CEUS。經(jīng)左側(cè)股總靜脈置管團注造影劑(0.4 ml/kg體質(zhì)量)，隨后迅速注入0.4 ml生理鹽水進行沖管。采集右腎最大縱切面CEUS圖像，連續(xù)觀察3 min 。使用機載內(nèi)置分析軟件(auto tracking contrast quantification, ACQ)進行定量分析，ROI設(shè)置為0.05 mm2圓形取樣框，放置在同一深度、與聲束垂直的腎皮質(zhì)區(qū)外層。繪制時間-強度曲線(time-intensity curve， TIC)，經(jīng)軟件計算得出相關(guān)定量參數(shù)，包括峰值濃度(Peak)、達峰時間(time to peak, TTP)、AUC及平均通過時間(mean transition time, MTT)，并進行組間分析。

1.4 腎功能檢查 造影結(jié)束后經(jīng)左側(cè)股總靜脈取靜脈血2～3 ml，室溫離心(4 000 r/min，5 min)后取上層血清，檢測大鼠腎功血肌酐(creatinine, Crea)及尿素氮(urea nitrogen, Urea)。

1.5 病理學(xué)檢查 經(jīng)左側(cè)股總靜脈注入空氣3～4 ml處死大鼠，迅速取大鼠右腎組織固定于10%中性甲醛，脫水24 h以上，石蠟包埋切片行HE染色，鏡下觀察病理改變。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 23.0統(tǒng)計分析軟件。各參數(shù)以±s表示，組間比較使用單因素方差分析，兩兩比較使用LSD法。運用Pearson相關(guān)分析評價CEUS各指標(biāo)與大鼠生化指標(biāo)之間的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CEUS表現(xiàn) Sham組(圖1A)可見造影劑迅速充盈到腎臟血管內(nèi)，按腎動脈、腎皮質(zhì)、腎髓質(zhì)依次充盈增強，呈明顯“樹枝狀”分布；達到TTP后造影劑開始緩慢廓清，按腎髓質(zhì)、腎皮質(zhì)、腎靜脈順序退出腎臟。T1組(圖1B)造影劑進入腎臟時間較Sham組稍延遲。T2(圖1C)、T3組(圖1D)可見造影劑進入腎臟速度明顯減慢，腎皮質(zhì)增強明亮度較T1組明顯降低；T3組造影增強灰暗，腎內(nèi)動脈分支“樹枝狀”明顯變細(xì)。

2.2 各組TIC定量分析比較 T1組TTP、AUC、MTT較Sham組增加(P均<0.05)；T2組TTP、MTT較Sham組和T1組增加(P均<0.05)，AUC較Sham組增加(P<0.05)；T3組TTP、AUC、MTT較其余3組增加(P均<0.05)，Peak較Sham組、T1組增加(P均<0.05)。見表1。

2.3 各組生化結(jié)果比較 Crea在Sham組、T1、T2和T3組依次升高，除外T1組與Sham組，其余各組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，T1組和T3組Urea較Sham組增加(P均<0.05)。見表2。

2.4 相關(guān)性分析 4組Crea與TTP、AUC、MTT 均呈顯著正相關(guān)(r=0.789、0.790、0.800，P均<0.001)。

2.5 病理結(jié)果 大體觀察，Sham組腎臟紅潤，T1腎臟較Sham組肉眼觀無明顯改變；T2組切面腎皮質(zhì)較Sham組蒼白，髓質(zhì)顏色加深；T3組腎臟水腫黑紅色，切

表1 各組大鼠腎皮質(zhì)TIC曲線參數(shù)比較(±s)

表1 各組大鼠腎皮質(zhì)TIC曲線參數(shù)比較(±s)

組別Peak(dB)TTP(s)AUC(dB·s)MTT(s)Sham組47.83±3.3515.71±1.972 578.83±87.5939.20±4.01T1組48.87±2.0925.50±5.54?4 051.49±714.54?61.01±10.13?T2組51.52±8.1233.51±3.56?#5 442.08±1292.99?76.84±9.48?#T3組59.02±2.30?#41.94±3.46?#▲9 920.77±582.24?#▲122.34±8.07?#▲F值5.74032.63368.17077.126P值<0.05<0.001<0.001<0.001

注：*：與Sham組比較，P<0.05；#：與T1組比較，P<0.05；▲與T2組比較，P<0.05

圖1 各組大鼠超聲造影圖 A.Sham組； B.T1組； C.T2組； D.T3組

圖2 各組大鼠腎臟病理圖(HE，×200) A.Sham組； B.T1 組； C.T2 組； D.T3 組

面皮質(zhì)腫脹、蒼白更為嚴(yán)重，髓質(zhì)呈暗紅色。光鏡下Sham組(圖2A)腎小管、腎小球結(jié)構(gòu)未見明顯病理學(xué)改變；T1、T2、T3組腎小球未見明顯收縮、硬化改變，腎小管內(nèi)未見明顯鑄型結(jié)構(gòu)。T1組(圖2B)腎小管上皮細(xì)胞腫脹不明顯，未見明顯炎性細(xì)胞浸潤；T2組(圖2C)腎小管上皮細(xì)胞腫脹較T1組明顯，間質(zhì)內(nèi)偶見少量炎性細(xì)胞浸潤；T3組(圖2D)腎小管上皮細(xì)胞明顯腫脹，部分呈“氣球樣”改變，可見炎性細(xì)胞浸潤。T1、T2、T3組均未見明顯細(xì)胞凋亡。

表2 各組大鼠Urea、Crea比較(±s)

表2 各組大鼠Urea、Crea比較(±s)

組別Urea(mmol/L)Crea(μmol/L)Sham組7.02±0.4941.85±16.10T1組10.57±1.06?43.38±8.49T2組8.13±1.2357.57±4.98?#T3組10.23±3.61?72.25±12.17?#▲F值3.0039.358P值0.059<0.001

注：*：與Sham組比較，P<0.05；#：與T1組比較，P<0.05；▲：與T2組比較，P<0.05

3 討論

HS是急診和重癥監(jiān)護常見病癥，機體有效循環(huán)血量大量丟失會迅速引起全身性低血壓，引發(fā)機體組織器官低灌注。腎臟灌注量約占心排量的20%，HS時首先受到影響。腎臟結(jié)構(gòu)復(fù)雜，功能涉及排泄代謝廢物及對機體調(diào)節(jié)滲透壓和酸堿平衡，很大程度上受腎臟血流灌注改變的影響；腎血流量(renal blood flow, RBF)90%供應(yīng)腎皮質(zhì)，準(zhǔn)確測量腎皮質(zhì)血流灌注變化可為評價腎功能改變提供依據(jù)[1-2]。

臨床常用于評估腎臟血流灌注情況的影像學(xué)方法包括增強CT(contrast-enhanced computed tomography， CECT)、磁共振灌注成像(perfusion weighted imaging， PWI)、核素灌注成像(nuclear medicine imaging， NMI)及CEUS，但傳統(tǒng)影像學(xué)方法用于腎病患者有其特定局限性和禁忌證[3]。部分腎功能不良患者無法耐受碘對比劑和釓對比劑的腎毒性；且CECT、NMI均有輻射，使其應(yīng)用受限[4-5]。

CEUS可動態(tài)監(jiān)測宏觀血流和微循環(huán)變化[6]。超聲造影劑微泡被限制在血池中，不滲入血管間質(zhì)，也不被腎小球濾過和腎小管重吸收[7]；其微泡直徑1～5 μm，是理想的紅細(xì)胞示蹤劑，能進入幾乎所有毛細(xì)血管，可使血管微結(jié)構(gòu)可視化，達到監(jiān)測毛細(xì)血管微循環(huán)水平血流動力學(xué)變化的目的；其惰性氣體核心不被代謝，氣泡溶解后數(shù)分鐘內(nèi)隨呼吸排出，不通過腎臟排泄，無腎毒性。本實驗建立大鼠HS模型，采用CEUS監(jiān)測大鼠腎皮質(zhì)微循環(huán)灌注變化，探討以CEUS評估不同程度HS大鼠腎皮質(zhì)血流灌注變化的可行性[8-9]。

本研究結(jié)果顯示，隨休克程度加重，TTP、MTT時間延長，AUC增加(P均<0.05)，與羅志建等[10]、LI等[11]的結(jié)果一致。TTP指ROI內(nèi)出現(xiàn)造影劑到達到峰值強度的時間，反映造影劑灌注速度；MTT是造影劑開始增強到峰值濃度下降一半的時間，反映其廓清速度。AUC為TIC下面積，反映一定時間內(nèi)ROI內(nèi)造影劑累積。發(fā)生休克時，全身性低血壓導(dǎo)致炎性介質(zhì)滲出，引起血管內(nèi)皮活化、損傷，多種因素共同作用，最終導(dǎo)致腎皮質(zhì)內(nèi)微循環(huán)灌注降低，表現(xiàn)為灌注和廓清速度降低，TIC定向表現(xiàn)為TTP、MTT延長；釋放的炎性細(xì)胞可吞噬造影劑微泡，導(dǎo)致造影劑廓清減慢，而被吞噬微泡仍保留聲學(xué)活性，表現(xiàn)為AUC增加[12]。本研究中Peak值在Sham組、T1、T2和T3組依次升高，但僅T3組與Sham組、T3組與T1組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，可能因為Peak代表ROI內(nèi)造影劑含量達到峰值時的濃度，為瞬間指標(biāo)，無明顯累積效應(yīng)，不能很好地反映腎皮質(zhì)微循環(huán)灌注變化。

腎臟最重要的功能之一是濾過和排泄血液中的含氮廢物，Crea升高可作為腎功能下降的指標(biāo)。本研究各HS組Crea值相比Sham組均升高，其中T1組與Sham組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示隨著休克程度加重，腎臟血流灌注下降，腎功能損傷進一步加重，與超聲造影參數(shù)TTP、AUC、MTT的走向及統(tǒng)計學(xué)結(jié)果一致，證明CEUS能反映HS所致腎功能改變。既往研究[13]顯示，Crea下降可在數(shù)小時至數(shù)日內(nèi)發(fā)生。但Crea作為腎小球濾過率的替代標(biāo)記物相對不準(zhǔn)確，而CEUS有望通過監(jiān)測腎皮質(zhì)微循環(huán)灌注變化間接評估腎損傷。

本研究中采用TIC參數(shù)評估腎功能損傷程度，所獲結(jié)果與生化指標(biāo)Crea結(jié)果存在高度一致性，TTP、AUC、MTT與Crea均呈顯著正相關(guān)，隨缺血再灌注腎功能損傷程度增加而增高，而MTT與Crea相關(guān)性最高。

超聲造影劑無腎毒性[8,14]，可安全用于腎功能受損患者。CEUS具有實時性、便攜性和可重復(fù)性，且能降低對金屬和運動偽影的敏感性。利用CEUS可在數(shù)分鐘內(nèi)確定器官不同區(qū)域組織血流量，提供關(guān)于腎血流動力學(xué)及腎血流區(qū)域變化的信息。

本實驗具有以下不足：①動物樣本量相對較少；②基于麻醉并全身肝素化建造實驗動物模型，與實際臨床情況有所出入。

綜上所述，CEUS各參數(shù)可為觀察大鼠腎臟損傷早期腎皮質(zhì)血流灌注變化提供可靠信息，TTP、AUC、MTT可作為評價早期腎損傷的敏感指標(biāo)。