劉 佩,謝佳璇,秦 棟,劉化禹,馬小雯,張 妍,霍俊偉

(1.東北農業(yè)大學寒地小漿果開發(fā)利用國家地方聯(lián)合工程研究中心,黑龍江哈爾濱 150030;2.東北農業(yè)大學園藝園林學院,黑龍江哈爾濱 150030)

近年來,由于慢性病發(fā)病率和死亡率的不斷上升,以及臨床口服藥物潛在的副作用,將植物中的生物活性物質作為天然產物來預防和輔助治療慢性疾病,受到了人們的廣泛關注[1]。

多酚作為果實中重要的次生代謝物質[2],被稱為“第七類營養(yǎng)素”[3],具有多種生理活性作用。如葡萄、李子中的酚類物質對肥胖誘導的血脂異常等代謝紊亂的病癥有較好的預防作用,還可抗血小板凝結、調節(jié)雌激素等[4-5]。花青素是多酚類物質的重要組成部分[6]。據(jù)報道[7],富含花青素的水果如桑葚、藍莓等,均對癌癥、腫瘤和心腦血管疾病有預防作用[8],具有降血糖、抗氧化的生理活性,還可提高生物體免疫力[9]?？寡趸钚允强拱⒖顾ダ系壬锕δ艿幕A,研究果實抗氧化活性對人們的健康有重要意義[10]。果實的抗氧化性主要是由果實的酚類物質抑制氧化的表現(xiàn)[11]。蔓越莓中黃酮醇類對DPPH自由基的清除能力較強[12]。Duan等[13]提出黑枸杞中的花青素可有效地增加自由基的清除率。

α-淀粉酶抑制劑通過抑制α-淀粉酶的活性,使糖尿病患者的血糖降到理想狀態(tài)[14]。目前報道的天然植物降糖藥物已有數(shù)百種[15],它們可避免口服藥物(如阿卡波糖、伏格列波糖等)對人體的副作用[16]。王周在45種果蔬中發(fā)現(xiàn)獼猴桃、芹菜提取物對α-淀粉酶的抑制活性最強[17]。Liu等[18]的研究表明,葡萄籽的阿卡波糖當量值(5710 μmol AE/g)是阿卡波糖(1550 μmol AE/g)的4倍,具有優(yōu)于阿卡波糖的抗α-淀粉酶活性。此外,研究發(fā)現(xiàn)一些植物生理活性物質,如黃酮類、多糖和生物堿等,也可以抑制α-淀粉酶活性,達到降低血糖的效果[19]。如枸杞多糖、黃芪多糖、龍眼皮的原花青素都能顯著抑制α-淀粉酶[20-21]。

寒地果樹果實富含糖酸、礦質元素、氨基酸以及多種酚類物質,在預防慢性疾病和維持人體健康方面有較好的作用[3,22]。K?hk?nen等[23]研究發(fā)現(xiàn),黑穗醋栗和歐洲越橘果實的總酚含量顯著高于蘋果。周劭桓等[24]的研究表明,歐洲越橘、黑加侖、紅豆越橘、紅樹莓、花揪等果實含有大量多酚,具有很好的抗氧化性。軟棗獼猴桃、黑果腺肋花楸、草原櫻桃、白穗醋栗、蔓越莓作為優(yōu)良的寒地特色果樹[25],對其次生代謝物質以及生理活性的研究較少。因此，本試驗對軟棗獼猴桃、黑果腺肋花楸、草原櫻桃、白穗醋栗、蔓越莓五種果樹的總酚含量、總花色苷含量、抗氧化活性及抗α-淀粉酶活性進行測定及比較和評價,以期為寒地果樹資源的進一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白穗醋栗、軟棗獼猴桃、草原櫻桃、黑果腺肋花楸和蔓越莓果實 均采自東北農業(yè)大學的寒地小漿果種質資源圃，于2018年6～9月采摘結果枝條中部完全成熟的果實。玉米淀粉、福林酚(Folin-Ciocalteu)試劑、沒食子酸標品 純度99%,上海源葉生物科技有限公司;Trolox(6-羥基-2,5,7,8-四甲基氯代甲烷-2-羧酸)、DPPH(2,2-二苯基-1-苦基肼)、熒光素鈉、ABTS(2,2′-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽)、AAPH(2,2′-偶氮二(2-甲基丙脒)二鹽酸鹽)、FeCl3·6H2O、FeSO4·7H2O、TPTZ(2,4,6-三三嗪基-s-三嗪) 北京博奧拓達科技有限公司;阿卡波糖、α-淀粉酶 Sigma公司。

帝肯infinite M200酶標儀 上海道尚生物科技有限公司;賽默飛世爾LL30000凍干機 深圳市華德維康科技有限公司;TGL-20bR高速冷凍離心機 廣州滬瑞明儀器有限公司;柯祁UV1700紫外-可見分光光度計 上海元析儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 果實預處理 將采集到的果實,用凍干機凍干后研磨成粉,于-20 ℃保存;取10 g果實凍干粉,按照1∶10的料液比加入濃度為80%的甲醇,于搖床中200 r/min室溫振蕩2 h,4 ℃離心(8000 r/min,10 min),取上清,得到多酚提取液,用于本試驗所有指標的測定。

1.2.2 總酚的測定 使用Folin-Ciocalteu法[26]測定果實的總酚含量(TPC)。構建沒食子酸的校準曲線(y=5.3815x+0.0003,R2=0.9991)。果實的TPC表示為每100 g干重果實的沒食子酸(GAE)當量(mg)。

1.2.3 總花色苷的測定 根據(jù)pH示差法[27]分別測量果實的總花色苷含量(TAC)。借助方程式(1)(2)計算果實的TAC。結果表示為每100 g干重果實的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷(C3G)當量(mg)。

A=(A510 nm-A700 nm)pH1.0-(A510 nm-A700 nm)pH4.5

式(1)

式(2)

其中:A為吸光度;MW為C3G的分子量(449.2);DF為稀釋倍數(shù);ε為摩爾吸光系數(shù)(26900)。

1.2.4 果實提取物的抗氧化能力

1.2.4.1 DPPH測定 參考Brand-Williams[28]的方法測定。用0.1～0.8 mmol/L的Trolox繪制校準曲線(y=0.1608x-10.928,R2=0.9969),樣品的抗氧化能力表示為每g干重果實的Trolox當量(μmoL),下同。

1.2.4.2 ABTS測定 參考Roberta等[29]的方法測定。用0.05～0.5 mmol/L的Trolox繪制校準曲線(y=0.718x+0.6676,R2=0.9994)。

1.2.4.3 FRAP測定 參考Nayak等[30]的方法,略作修改。將FRAP試劑(150 μL)加熱至37 ℃后與10 μL稀釋的樣品以及30 μL去離子水快速混合,并在593 nm處測定反應30 min時的吸光值。使用濃度0.1～1.0 mmol/L的FeSO4·7H2O制備的標準曲線(y=0.0003x+0.0186,R2=0.9922)。

1.2.4.4 ORAC測定 參考Huang等[31]的方法,并加以改動。將20 μL稀釋的樣品或Trolox與160 μL熒光素溶液(8.16×10-5mmol/L)混合在96孔板中,再加入20 μL的AIBI溶液(153 mmol/L)以淬滅熒光。在37 ℃下測量2 h內每分鐘的熒光。用0.01～0.2 mmol/L的Trolox制作標準曲線(y=0.0249x+24.717,R2=0.9946)。

1.2.5 果實提取物對α-淀粉酶的抑制活性 參考Liu等[18]的高通量淀粉濁度法,以阿卡波糖作為陽性對照,將0.5 g玉米淀粉溶解在磷酸緩沖液(0.1 mol/L,pH=6.9)中,然后在400 ℃下攪拌2.5 min左右至半透明狀。將20 μL稀釋的樣品或阿卡波糖或PBS溶液(作為對照)與20 μL 0.2 mg/mL的豬胰α-淀粉酶于96孔板中充分混合后,加入60 μL糊化的玉米淀粉溶液,并在660 nm下讀取2 h內混合物的吸光度,繪圖,得到不同果實對α-淀粉酶活性抑制的動力學曲線。

式中:AUC樣為抑制曲線下的面積和AUC對照表示對照曲線下面積,IC50為可定義為在產生50%酶活性抑制的抑制劑濃度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 21.0進行ANOVA方差分析及Person相關性分析。所有試驗均重復3次,數(shù)據(jù)結果表示為“平均值±SD”。

2 結果與分析

2.1 不同果實的總酚、總花色苷含量及比較分析

不同果實中的總酚和總花色苷含量差別較大,見表1。黑果腺肋花楸的總酚和總花色苷含量均顯著高于白穗醋栗、草原櫻桃、軟棗獼猴桃和蔓越莓(P<0.05),分別為66.43 mg GAE/100 g和46.45 mg C3G/100 g,約為它們的1.4～5倍;草原櫻桃總酚含量、總花色苷含量均較高,為27.43 GAE/100 g和17.56 mg C3G/100 g。Hakkionen等[32]對比了多種植物的總酚含量,結果表明黑果腺肋花楸的總酚含量最高。有關研究顯示,花青素及其糖苷類化合物為黑果腺肋花楸果實中單體多酚的主要組分(56.7%～75.2%)[33],這與本文研究結果一致?？梢?黑果腺肋花楸具有豐富的酚類物質。同時,白穗醋栗中的總酚含量(46.21 mg GAE/100 g)僅次于黑果腺肋花楸,但總花色苷含量卻是五種樹種中最低的,僅為0.15 mg CSG/100 g。據(jù)Contessa等[34]報道,在與黑莓、草莓和軟棗獼猴桃等17種水果比較中,白穗醋栗表現(xiàn)出高的總酚含量(362.15 mg GAE/100 g),低的花色苷含量(0.93 mg C3G/100 g),這也與本文研究結果一致。結合植物形態(tài)學可知,白穗醋栗成熟果實的果皮果皮顏色較淺,因此其花色苷含量較低。M??tt?等[35]的研究指出其酚類含量較高可能是由于羥基肉桂酸衍生物(咖啡酸己糖衍生物、對香豆素酸4-O-葡萄糖苷、己糖、阿魏酸己糖和阿魏酸己糖衍生物)和黃酮醇苷類(蘆丁、槲皮素3-O-葡萄糖)所致,同時還發(fā)現(xiàn)原花青素和酚酸才是白穗醋栗中主要的酚類化合物。

表1 5種果實提取物的總酚含量(TPC)、總花色苷含量(TAC)(n=3)Table 1 Total phenolic content and total anthocyanin content of methanol extracts from five fruits

2.2 不同果實的抗氧化活性分析

不同果實的抗氧化活性有所不同,結果見表2。果實多酚對DPPH·和ABTS+·的清除能力由強至弱依次為:白穗醋栗>黑果腺肋花楸>草原櫻桃>蔓越莓>軟棗獼猴桃;白穗醋栗果實多酚對DPPH·、ABTS+·能力最強,分別為414.46和2662.74 μmol/TEg,顯著高于其他果實(P<0.05)。Contessa等[34]的研究發(fā)現(xiàn)白穗醋栗表現(xiàn)出高于軟棗獼猴桃、藍莓、黑莓等漿果的抗氧化能力,是良好的抗氧化劑來源[34]。果實多酚對鐵離子還原能力(FRAP)由強至弱依次為:黑果腺肋花楸>白穗醋栗>草原櫻桃>蔓越莓>軟棗獼猴桃;據(jù)報道,黑果腺肋花楸的多酚類物質能高度清除機體產生的自由基,如DPPH·、ABTS+·[36];與常見水果相比,黑果腺肋花楸表現(xiàn)出高的抗氧化活性[32],這跟本文研究結果一致。采用ORAC法測得的抗氧化能力由強至弱依次為:軟棗獼猴桃>白穗醋栗>草原櫻桃>蔓越莓>黑果腺肋花楸。據(jù)Wojdyo[37]等的報道軟棗獼猴桃對自由基有良好的清除能力。雖然用ORAC法測得的軟棗獼猴桃的抗氧化能力最強,為28.37 μmol/TEg,但是它對DPPH·、ABTS+·清除能力很弱;劉慶慶等[38]發(fā)現(xiàn)采用DPPH和ORAC法比較不同黃酮類化合物的抗氧化性的結果相反,其抗氧化性跟C環(huán)跟B環(huán)上的羥基的個數(shù)與位置有關。這說明不同多酚的不同結構可能對不同自由基的清除程度產生影響。

2.3 不同果實抗α-淀粉酶活性分析

不同果實對α-淀粉酶活性抑制的動力學曲線,見圖1。隨著阿卡波糖質量濃度的增加,660 nm處的吸光值逐漸減小,動力學曲線逐漸平緩,說明淀粉濁度變化速率逐漸減小(圖1A)。當阿卡波糖質量濃度達到0.33 mg/mL時,反應120 min后,660 nm處的吸光值與對照趨于一致,說明淀粉已被α-淀粉酶完全水解,說明此濃度對α-淀粉酶的抑制效果最佳。當白穗醋栗質量濃度為0.07 mg/mL時(圖1B),不到30 min淀粉就被α-淀粉酶水解完全,說明此濃度下α-淀粉酶的活力極高;當白穗醋栗質量濃度提升至0.18 mg/mL時,隨著時間的推移,淀粉濁度下降速率減小,此濃度下的白穗醋栗對α-淀粉酶抑制效果最好。同上,蔓越莓(圖1C)、草原櫻桃(圖1D)質量濃度在分別在6.99、9.22 mg/mL時濃度越高,抑制時間越久,表現(xiàn)出對α-淀粉酶較好的抑制能力,不同于以上果實良好的抑制效果,軟棗獼猴桃在低質量濃度下(<11.43 mg/mL)的淀粉濁度(OD值越高,淀粉溶液越渾濁)下降較快,直到質量濃度提高到14.67 mg/mL時才表現(xiàn)出對α-淀粉酶有較好的抑制效果(圖1E);而黑果腺肋花楸的抑制效果最差(圖1F),在質量濃度為18.43 mg/mL時,相比于對照,淀粉濁度迅速下降,對α-淀粉酶幾乎無抑制作用。

阿卡波糖是治療高血糖癥的處方藥,能有效抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶[39];因此,它被選為參考標準品。不同果實的抗α-淀粉酶活性存在顯著性差異,見表3。對α-淀粉酶抑制能力最強的是白穗醋栗,IC50值低于阿卡波糖(0.16 mg/mL),僅為0.122 mg/mL,其AE值為2034.18 mmol AE/g,與阿卡波糖(1550 mmol AE/g)相當,顯著高于蔓越莓、草原櫻桃、軟棗獼猴桃、黑果腺肋花楸,約為它們的42～127倍。另外,蔓越莓、草原櫻桃和軟棗獼猴桃表現(xiàn)出較強的抗α-淀粉酶活性;而對于黑果腺肋花楸,本試驗檢測到在濃度為18.43 mg/mL時,對α-淀粉酶活性無明顯抑制作用。之前的報道稱白穗醋栗中的主要成分是原花青素和酚酸[34],對于白穗醋栗表現(xiàn)出強的抗α-淀粉酶活性,可能與其果實中富含的原花青素有關。Huang等[40]發(fā)現(xiàn)何首烏莖中的原花青素低聚物對α-淀粉酶有很強的抑制作用。另外,富含原花青素的高粱麩提取物對α-淀粉酶抑制活性是不含原花青素的黑高粱麩提取物的10倍[41-42]。

表3 α-淀粉酶抑制劑的IC50和阿卡波糖當量(n=3)Table 3 IC50 and acarbose equivalence of inhibitors against α-amylase

2.4 不同果實中總酚含量(TPC)、總花色苷含量(TAC)、抗氧化和抗α-淀粉酶活性之間的相關性分析

如表4所示,對不同果實中總酚含量(TPC)、總花色苷含量(TAC)與抗氧化、抗α-淀粉酶活性之間的相關性進行分析,TPC、TAC均與抗氧化活性(FRAP)之間存在極顯著相關關系,并且TPC與抗氧化活性(DPPH)之間也存在極顯著相關關系(P<0.01)。據(jù)Oszmianski報道,酚類化合物的含量與其抗氧化活性呈正相關關系[43];Francik發(fā)現(xiàn)黑果腺肋花楸果實中的花青素具有強大的抗氧化屬性,其總花青素含量與抗氧化活性呈顯著正相關[44],這些研究均與本文研究結果相符。此外,TPC、TAC與抗α-淀粉酶之間無顯著性相關關系。本文研究發(fā)現(xiàn),黑果腺肋花楸TPC跟TAC是5種果樹種含量最高的(表1),但其抗α-淀粉酶活性卻最低(表3);雖然白穗醋栗TPC僅次于黑果腺肋花楸,TAC最低(表1),但是其抗α-淀粉酶活性最強(表3);因此，果實抗α-淀粉酶活性可能與花青素的關系不大,而與除花青素之外的其他酚類物質存在一定相關性。Tadera對比了花青素、槲皮素、木犀草素、楊梅素等6種類黃酮化合物對α-淀粉酶的抑制作用,發(fā)現(xiàn)花色苷的抑制作用較弱[45]。原花青素能夠有效抑制碳水化合物水解酶(如α-淀粉酶)的活性[46],其抑制能力高于花青素[47]。但此結論仍需進一步的驗證。

表4 五種果實甲醇提取物總酚含量(TPC)、總花色苷含量(TAC)、抗氧化和抗α-淀粉酶活性之間的相關性Table 4 Correlationship between total phenolic content(TPC),total anthocyanin content(TAC),antioxidant capacity and α-amylase inhibitory activity of methanol extracts from five fruits

圖1 阿卡波糖及5種不同濃度果實提取物對α-淀粉酶活力的動力學曲線(A1～E1、F)及抑制效果(A2～E2)Fig.1 The kinetic curves(A1～E1,F)and inhibitory activity(A2～E2)of starch hydrolysis by α-amylase in the presence of acarbose and different concentrations of methanol extracts from five fruits注:A:阿卡波糖;B:白穗醋栗;C:蔓越莓;D:草原櫻桃;E:軟棗獼猴桃;F:黑果腺肋花楸。

3 結論

本研究通過對五種寒地果實的多酚含量、抗氧化活性及抗α-淀粉酶活性分析,發(fā)現(xiàn)黑果腺肋花楸的總酚含量跟總花色苷含量顯著高于白穗醋栗、草原櫻桃、軟棗獼猴桃和蔓越莓(P<0.05),白穗醋栗的總酚含量僅次于黑果腺肋花楸;黑果腺肋花楸、白穗醋栗、與軟棗獼猴桃表現(xiàn)出高的抗氧化活性;白穗醋栗的抗α-淀粉酶活性顯著強于其它四種寒地果實。另外,相關性分析表明,五種寒地果實的TPC、TAC與抗氧化活性之間存在極顯著相關關系(P<0.01),與抗α-淀粉酶之間無顯著性相關關系。

綜上所述,黑果腺肋花楸與白穗醋栗的果實中多酚類物質豐富,是獲取天然多酚的良好原料,并且具有良好的抗氧化功效。其中,白穗醋栗對α-淀粉酶活性抑制能力突出,具有優(yōu)于阿卡波糖的降糖能力,但對其降糖機制仍需探究。