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(1.北京城市學(xué)院生物醫(yī)藥學(xué)部,北京 100083;2.北京市營養(yǎng)源研究所,北京 100069)

乳蛋白主要分為兩大類:酪蛋白和乳清蛋白,牛乳蛋白中酪蛋白含量約為80%,乳清蛋白含量約為20%。乳清蛋白在嬰兒的免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)、肌肉組織建立等起到了很重要的輔助作用[1-2]。乳清蛋白稱作蛋白之王,它是一種從奶類中提取的高營養(yǎng)、易吸收、內(nèi)含多種活性成分的蛋白質(zhì),是世界公認(rèn)的人體優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)補(bǔ)充劑之一[3-4]。乳清蛋白的主要成分包括β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、乳鐵蛋白、牛血清白蛋白、免疫球蛋白、乳過氧化物酶等。這些成分是人體中免疫系統(tǒng)的防御機(jī)制的一部分,在抑菌、抗病毒和調(diào)節(jié)人體免疫循環(huán)等方面發(fā)揮了積極作用[5-6]。

β-乳球蛋白是牛乳中的主要乳清蛋白,約占乳清蛋白的50%,是由162個(gè)氨基酸殘基、2個(gè)二硫基團(tuán)(S-S)和1個(gè)硫氫基團(tuán)(-SH)組成的一種分子量約18.3 kDa的小的球狀蛋白。β-乳球蛋白與葉酸結(jié)合,可以有效地增強(qiáng)其穩(wěn)定性;與脂溶性維生素和脂肪酸等結(jié)合,可以改善產(chǎn)品的風(fēng)味、促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收;β-乳球蛋白也可以延緩某些脂肪酸和維生素的氧化降解,起到保護(hù)作用[7]。

α-乳白蛋白是乳清蛋白中第二豐富的組分,占牛乳清蛋白的20%。α-乳白蛋白在乳腺中合成,在乳糖的生物合成上作為輔酶參與作用[8]。α-乳白蛋白控制著乳腺中乳糖的含量,是泌乳階段的一個(gè)重要調(diào)節(jié)因子。另外,α-乳白蛋白也是必需氨基酸色氨酸和半胱氨酸的良好供體[9]。

表1 不同來源及加工方式的乳樣品Table 1 The milk samples from different sources and processing methods

乳鐵蛋白是乳清蛋白中的一種重要的非血紅素鐵結(jié)合糖蛋白,它是母乳中重要的具有多種生理活性的鐵結(jié)合糖蛋白[10],約占母乳乳清蛋白的26%,乳鐵蛋白因其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能,在強(qiáng)化機(jī)體鐵吸收、對抗病原體、免疫調(diào)節(jié)以及抗氧化等方面發(fā)揮著重要作用[11-12]。但并非乳汁所特有,在哺乳動(dòng)物的很多外分泌物中都存在,如眼淚、唾液和精液等[13]。只是除乳中外,其他分泌物中含量甚微。因其晶體呈紅色,故也有學(xué)者稱之為紅蛋白[14]。乳鐵蛋白具有很多對人體有益的功能:抗菌、抗氧化、抗癌、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等[15]。因此,被認(rèn)為是一種新型抗菌、抗癌藥物和極具開發(fā)潛力的食品和飼料添加劑,越來越多的受到國內(nèi)外相關(guān)企業(yè)及研究者的重視[16]。我國在GB14880-2012《食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑使用標(biāo)準(zhǔn)》將乳鐵蛋白列為了新型營養(yǎng)強(qiáng)化劑,并規(guī)定了其在相關(guān)乳制品中的含量標(biāo)準(zhǔn)。目前,我國并沒有建立相應(yīng)的檢測標(biāo)準(zhǔn)[17-18]。

近年來隨著人們生活水平的提高,人們對乳及乳制品的需求量也越來越大,除了牛乳,羊乳、牦牛乳等乳制品也逐漸流入市場。目前系統(tǒng)地對不同來源不同物種奶中乳清蛋白的研究并不多,本研究采用高效液相色譜法串聯(lián)質(zhì)譜外標(biāo)法測定不同來源的羊乳、牦牛乳、牛乳中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、乳鐵蛋白含量,分別分析其在不同乳中的差異。為嬰幼兒配方奶粉等食品加工提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和技術(shù)思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

碳酸氫銨、氯化鈣、乙酸、硫酸、氫氧化鈉 均為分析純,北京化工廠;色譜純甲酸、乙腈 賽默飛世爾科技有限公司;二流蘇糖醇(DTT) Solarbio公司、碘代乙酰胺(IAA) Solarbio公司、牛胰蛋白酶(SIGMA公司);牛乳鐵蛋白特異肽段VDSALYLGSR、α-乳白蛋白特異肽段VGINYWLAHK、β-乳球蛋白特異肽段TPEVDDEALEK 純度≥95%,由寧波康貝生化有限公司制備。

UPLC I-CLASS XEVO液相色譜-串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(帶電噴霧離子源) WATERS公司;TQCP124C全自動(dòng)電子天平(十萬分之一) 日本A&D公司;MVS-1漩渦混合器 北京金北德工貿(mào)有限公司;Easypure純水系統(tǒng) 美國Barnstead公司;PS-60A超聲波振蕩器 深圳市深華泰實(shí)業(yè)有限公司；ZHWY-110X30往復(fù)式恒溫水浴搖床 上海智城分析儀器制造有限公司；KJ2300全自動(dòng)凱氏定氮儀 FOSS公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 乳類樣品的采集與處理 本研究通過市場采購和網(wǎng)購方式采集到來自不同產(chǎn)地包括巴氏殺菌乳和UHT滅菌乳共24種,其中牛乳15種、羊乳6種、牦牛乳3種。詳情見表1。奶樣采集后4 ℃保存,3 d內(nèi)測定。

1.2.2α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳鐵蛋白含量的測定 乳類樣品中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳鐵蛋白含量檢測方法參考液相色譜質(zhì)譜法[19-22]進(jìn)行檢測。

1.2.2.1 樣品預(yù)處理 稱取2.5 g樣品溶液于100 mL容量瓶中,用水稀釋定容至刻度,混勻。移取200 μL稀釋液于小試管中,加入180 μL碳酸氫銨溶液,混勻,加入15 μL二硫蘇糖醇溶液,50 ℃恒溫反應(yīng)30 min,取出冷卻,加入45 μL碘代乙酰胺溶液,避光靜止30 min,加入10 μL氯化鈣溶液和40 μL胰蛋白酶溶液,37 ℃恒溫酶解4 h,取出后加入10 μL甲酸,室溫靜止30 min,最后加入適量水,使酶解液總體積為1.0 mL,混勻后過0.22 μm濾膜,即為待測樣品供試液,供液相色譜質(zhì)譜測定。

1.2.2.2 液相條件 色譜柱:硅烷基C18柱;流動(dòng)相A:0.1%甲酸水溶液;流動(dòng)相B:0.1%甲酸乙腈溶液;流動(dòng)相流動(dòng)速度:0.3 mL/min;色譜柱柱溫:40 ℃;試液溫度:10 ℃;進(jìn)樣體積:5 μL。

1.2.2.3 質(zhì)譜條件 毛細(xì)管電壓3.5 kV,錐孔電壓35 kV,脫溶劑溫度500 ℃,脫溶劑氣流量800 L/min,錐孔反吹氣流量30 L/hr,碰撞室壓力3.0×10-3mbar,低端分辨率1:2.5 V,高端分辨率1:15.0 V,離子能量1:0.5,低端分辨率2:2.8 V,高端分辨率2:15.0 V,離子能量2:1.0,離子源溫度:150 ℃,提取器壓力:3.0 V,入口透鏡電壓:0.5 V,碰撞梯度:1.0。

1.2.2.4 定性定量條件α-乳白蛋白特異肽段分子量1199.65,母離子為[M+2H]2+為601,子離子為355.2+/284.2+;β-乳球蛋白特異肽段分子量1244.50,母離子為[M+2H]2+為623.2,子離子為819.3+/918.4+。乳鐵蛋白特異肽段分子量1079.6,母離子為[M+2H]2+為540.9,子離子為595.3+/319.3+。

α-乳白蛋白分子量為14178、β-乳球蛋白分子量為18320、乳鐵蛋白分子量為76095.1,采用特異肽段外標(biāo)法定量。

乳清蛋白含量(g/100 g)=[α-乳白蛋白含量(g/100 g)+β-乳球蛋白含量(g/100 g)]/系數(shù)(60%)。

1.2.3 不同乳中總蛋白含量 牛乳、羊乳、牦牛乳總蛋白含量采用GB 5009.5-2016食品中蛋白質(zhì)的測定中第一法:凱氏定氮法進(jìn)行測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過實(shí)驗(yàn)收集到的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過Microsoft Office Excel 2013和SPSS 22.0整理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳鐵蛋白定量測定方法

本文采用酶解法同時(shí)測定乳品中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳鐵蛋白含量,以各功能蛋白的特異肽段定性定量子離子峰面積為橫坐標(biāo),濃度為縱坐標(biāo),得到標(biāo)準(zhǔn)曲線,各標(biāo)準(zhǔn)曲線方程相關(guān)系數(shù)均大于0.99,可滿足定量測定需要。各功能蛋白液相條件能夠很好的分離,如圖1～圖3。

圖1 α-乳白蛋白特異肽段譜圖Fig.1 α-lactoalbumin specific peptide segment spectrum

圖2 β-乳球蛋白特異肽段譜圖Fig.2 β-lactoglobulin specific peptide segment spectrum

圖3 乳鐵蛋白特異肽段譜圖Fig.3 Lactoferrin specific peptide segment spectrum

2.2 不同乳品中乳清蛋白含量比較

采集的牛、羊、牦牛乳樣品均以三平行平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì),羊奶乳清蛋白含量在0.287～0.484 g/100 g,牦牛奶乳清蛋白含量在0.447～0.601 g/100 g,牛奶乳清蛋白含量在0.454～0.578 g/100 g。通過對羊、牦牛、牛乳測定的乳清蛋白含量占總蛋白比分析后,可以看出三種乳類中的乳清蛋白量差異不明顯。其中,牛奶中的乳清蛋白量占總蛋白比例在三種乳類中最高(均值為16.2%),然后依次是牦牛乳(均值為14.81%)和羊乳(均值為13.28%)。乳清蛋白的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表2。各個(gè)乳類測定的乳清蛋白占總蛋白比較見圖4。

圖4 不同乳品中乳清蛋白占總蛋白比例Fig.4 The percentage of whey protein content to total protein in different milk products

表2 不同乳品中乳清蛋白含量Table 2 Contents of whey protein in different milk samples

2.3 不同乳品中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量比較

2.3.1 不同羊奶樣品間α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量 由圖5可得,同一樣品間數(shù)據(jù)平行性很好,但不同樣品間波動(dòng)性較大,所以做羊奶整體平均數(shù)時(shí)采用舍極值取平均的公式計(jì)算,保障羊奶中蛋白含量的普遍性。結(jié)果得到羊奶中α-乳白蛋白含量在0.113～0.213 g/100 g范圍;而β-乳球蛋白含量約在0.110～0.174 g/100 g范圍內(nèi)。

圖5 不同羊乳樣品間α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量Fig.5 Contents of α-lactoalbumin and β-lactoglobulin in different samples of goat milk

2.3.2 不同牦牛乳樣品間α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量 牦牛乳乳清蛋白樣品間α-乳白蛋白和β-乳球蛋白測定結(jié)果比較見圖6。從圖中可知,不同牦牛乳樣品間存在較大差異,牦牛乳中α-乳白蛋白的含量范圍在0.118～0.207 g/100 g;β-乳球蛋白的含量范圍在0.150～0.178 g/100 g。

圖6 不同牦牛乳中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量Fig.6 Contents of α-lactoalbumin and β-lactoglobulin in different yak milk

2.3.3 不同牛乳樣品中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量 由圖7可看出,同一樣品間的三組數(shù)據(jù)平行性較好,但個(gè)別數(shù)據(jù)出現(xiàn)了單組差異性較大,并且不同樣品間β-乳球蛋白差異較大,所以在牛奶整體取平均數(shù)時(shí),也采用舍極值取平均來保障牛奶中蛋白含量的普遍性。牛奶中α-乳白蛋白的含量在0.121～0.205 g/100 g范圍內(nèi);β-乳球蛋白含量在0.120～0.193 g/100 g范圍內(nèi)。

圖7 不同牛乳中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量Fig.7 Contents of α-lactoalbumin and β-lactoglobulin in different milk

由于人乳與其他乳品的蛋白質(zhì)構(gòu)成存在差異,再加上嬰兒腸道和免疫系統(tǒng)發(fā)育尚不成熟,有一部分嬰兒會(huì)對乳品過敏。研究表明,β-乳球蛋白是牛乳的主要過敏原[22],本研究顯示,羊乳中β-乳球蛋白的含量最低,牦牛乳次之,牛乳最高,因此羊乳較牦牛乳、牛乳較更不易引起嬰兒過敏。

2.4 不同來源乳中乳鐵蛋白含量比較

由表3可以看出,羊奶乳鐵蛋白含量在2.15～9.90 mg/100 g,牦牛奶乳鐵蛋白含量在2.21～2.65 mg/100 g,牛奶乳鐵蛋白含量在1.21～3.27 mg/100 g。通過對三種乳類測定出的乳鐵蛋白含量占其總蛋白含量的比例分析,可得羊乳中的乳鐵蛋白含量最高,牦牛乳和牛乳的乳鐵蛋白量相差不多。如圖8可以看出,乳鐵蛋白占總蛋白比例由多到少依次是羊乳(約總蛋白量占0.124%)>牦牛乳(約總蛋白量占0.07%)>牛乳(約總蛋白量占0.06%)。本研究中羊乳中乳鐵蛋白濃度稍高,不同來源樣品間差異較大,可能與農(nóng)場的養(yǎng)殖水平、飼料、飼養(yǎng)環(huán)境有關(guān)。

圖8 不同乳品中乳鐵蛋白占總蛋白比例Fig.8 The percentage of lactoferrin content to total protein in different milk products

表4 不同來源乳品α-乳白蛋白含量、β-乳球蛋白含量和乳鐵蛋白含量差異性分析Table 4 Differentiation of the contents of α-lactoalbumin,β-lactoglobulin and lactoferrin in milk from different sources

表3 不同乳品中乳鐵蛋白含量Table 3 Contents of lactoferrin in different milk samples

2.5 不同來源乳品中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳鐵蛋白含量比較

本文采集到牦牛乳、牛乳和羊乳共3種類型乳品。經(jīng)檢測分析,3個(gè)地區(qū)的牦牛乳中α-乳白蛋白含量差異很大,最小值為0.118 g/100 g、最大值為0.207 g/100 g;β-乳球蛋白含量在3個(gè)地區(qū)牦牛乳中含量一致。15個(gè)牛乳中α-乳白蛋白含量差異較大,其范圍在0.121～0.205 g/100 g;β-乳球蛋白含量與α-乳白蛋白含量范圍接近,在0.120～0.193 g/100 g。6個(gè)羊乳樣品測定結(jié)果顯示,α-乳白蛋白含量大于牦牛乳和牛乳,在0.113～0.213 g/100 g,β-乳球蛋白含量差異不顯著,范圍在0.110 g/100 g～0.174 g/100 g。

3種類型乳品乳鐵蛋白含量差異顯著,含量范圍在1.21～9.90 mg/100 g(表3)。3個(gè)地區(qū)的牦牛乳中乳鐵蛋白含量一致,在2.21～2.65 mg/100 g。15個(gè)牛乳中乳鐵蛋白含量在1.21～3.27 mg/100 g。羊乳中乳鐵蛋白含量差異最顯著,最低值為2.15 mg/100 g,最大值為9.90 mg/100 g?？傮w來看,羊乳中乳鐵蛋白含量優(yōu)于牛乳和牦牛乳。

3 結(jié)論

本研究對24種市售乳品的測定得到,不同來源乳品的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白、乳鐵蛋白和總蛋白含量存在差異。牦牛乳和牛乳的乳清蛋白含量接近,羊乳中乳清蛋白含量相對較低。但是,羊乳卻是良好的乳鐵蛋白來源,在三類乳源中含量最高。牦牛乳總蛋白含量明顯高于牛乳和羊乳。

GB 10765-2010規(guī)定,嬰兒奶粉中乳清蛋白含量要大于總蛋白的60%。本研究乳清蛋白含量和乳清蛋白占總蛋白比例結(jié)果可以為嬰兒乳粉等產(chǎn)品中乳清蛋白來源提供數(shù)據(jù)支持,乳鐵蛋白含量結(jié)果可以篩選更適宜的營養(yǎng)強(qiáng)化劑乳鐵蛋白原料來源。