李倩如，熊 瑤，林嘉諾，葉 倩，繆 松，張龍濤,，鄭寶東

（1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2.中愛國際合作食品物質(zhì)學(xué)與結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)研究中心，福建 福州 350002；3. Teagasc食品研究中心，愛爾蘭 科克 999014）

大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）作為一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白源[1]，具有良好的功能特性[2]，如凝膠 性[3-6]、溶解性、保水性[7-10]等，因而被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)。目前，SPI及其深加工產(chǎn)品遍及食品的各個(gè)領(lǐng)域，對(duì)其聚集和凝膠特性進(jìn)行研究，力求對(duì)其凝膠過程進(jìn)行調(diào)控也是研究熱點(diǎn)。Campbell等[11]通過控制SPI溶液的加熱次數(shù)，調(diào)控SPI聚集體的性質(zhì)，進(jìn)一步調(diào)控了大豆蛋白凝膠的質(zhì)構(gòu)特性。研究表明，大豆蛋白的聚集情況顯著影響大豆蛋白的凝膠性質(zhì)[12]。

葡萄糖酸內(nèi)酯（glucono-δ-lactone，GDL）誘導(dǎo)的大豆蛋白凝膠的凝固機(jī)理為GDL在水溶液中緩慢水解為葡萄糖酸，通過降低體系pH值，使蛋白質(zhì)分子負(fù)電荷集團(tuán)間靜電斥力降低，蛋白分子間不斷聚集、成膠。 武肖[13]通過對(duì)比不同的加熱和冷卻速率對(duì)大豆蛋白聚集和凝膠特性的影響，發(fā)現(xiàn)凝膠點(diǎn)受加熱速率調(diào)控，而與冷卻速率無關(guān)，并且，較低加熱速率形成的三維網(wǎng)絡(luò)凝膠結(jié)構(gòu)更加致密。李云[14]研究GDL誘導(dǎo)形成的大豆蛋白凝膠時(shí)，也發(fā)現(xiàn)慢速加熱時(shí)凝膠的保水性提高，而快速加熱時(shí)結(jié)果相反。GDL在水中的水解（酸化）速率與溫度成正相關(guān)，溫度越高，GDL酸化速率越快，蛋白分子的聚集和凝膠速率越快[15-16]。

迄今為止，關(guān)于酸化速率對(duì)大豆蛋白凝膠結(jié)構(gòu)的研究較少。本實(shí)驗(yàn)通過改變保溫溫度，以pH值、濁度為指標(biāo)，揭示GDL酸化速率的變化，進(jìn)一步探討GDL酸化速率對(duì)大豆蛋白凝膠的凝膠強(qiáng)度、剛性、保水性和微觀結(jié)構(gòu)的影響，對(duì)調(diào)控大豆蛋白凝膠的形成過程、開發(fā)質(zhì)構(gòu)各異的大豆蛋白凝膠制品具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SPI（＞90%蛋白） 山東嘉華保健品股份有限公司； GDL、Rhodamine B 麥克林生化科技有限公司。所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司； TA.XT plus質(zhì)構(gòu)測(cè)試儀 英國Stable Micro System公司； UV-1800紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司； MCR 301高級(jí)旋轉(zhuǎn)流變儀 奧地利安東帕有限公司；pH700型pH計(jì) 德信科技有限公司；JB300-D型攪拌器 上海標(biāo)本模型廠；Allegra X-30R離心機(jī) 美國貝克曼有限公司；BSA224S電子天平、BSA2202S電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；TCS SP8X DLS激光共聚焦顯微鏡 Leica生物系統(tǒng)公司。

1.3 方法

1.3.1 GDL誘導(dǎo)的SPI凝膠的制備

將蛋白樣品取出添加去離子水配制60 g/L的SPI溶液，攪拌器攪拌2 h至完全溶解后，在4 ℃水化12 h，貯藏于4 ℃?zhèn)溆?。將SPI溶液在95 ℃水浴60 min至完全變性，加入GDL溶液至最終溶液中的SPI質(zhì)量濃度為50 g/L，凝固劑質(zhì)量濃度為5 g/L，SPI混合液放置于30、40、50、60、70、80、90 ℃條件下保溫30 min后自然冷卻成型，在4 ℃放置24 h，待測(cè)。

1.3.2 酸化速率的分析

1.3.2.1 樣品pH值的測(cè)定

將新鮮配好的GDL溶液加入大豆蛋白溶液，使蛋白總質(zhì)量濃度為50 g/L，凝固劑質(zhì)量濃度為5 g/L，SPI混合液放置在30、40、50、60、70、80、90 ℃條件下保溫，每隔10、20、30、60、90、120、180、240、360、480 min，將SPI凝膠取出，在25 ℃水浴鍋內(nèi)平衡5 min后，測(cè)定pH值。

1.3.2.2 濁度測(cè)定

根據(jù)María等[17]的方法作適當(dāng)修改，用UV-1800紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)量共混溶液的濁度。蛋白溶液在95 ℃加熱1 h后，與新鮮配制的GDL溶液混合至最終溶液中的SPI質(zhì)量濃度為50 g/L，凝固劑質(zhì)量濃度為5 g/L。取4 mL的液體混合物在波長600 nm處測(cè)量吸光度。

1.3.3 凝膠強(qiáng)度的測(cè)定

按照1.3.1節(jié)方法制備凝膠。參照Cardoso等[18]的方法并稍作修改，將凝膠在4 ℃貯藏24 h之后，利用TA. XT plus物性測(cè)試儀測(cè)定凝膠強(qiáng)度。探頭型號(hào)P/0.5，測(cè)前速率1 mm/s，測(cè)試速率1 mm/s，測(cè)后速率1 mm/s，測(cè)定距離為10 mm，觸發(fā)力5 g，觸發(fā)類型為自動(dòng)，實(shí)驗(yàn)設(shè)置6 個(gè)平行樣品。

1.3.4 保水性的測(cè)定

參照Maltais等[19]的方法，將含有凝膠的試管在25 ℃條件下10 000×g離心10 min，然后倒轉(zhuǎn)30 min，使析出的水分充分釋放。保水性為離心后凝膠質(zhì)量占離心前凝膠質(zhì)量的百分比，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)平行樣品。

1.3.5 頻率掃描測(cè)定

使用MCR 301旋轉(zhuǎn)流變儀，配備PP50（1 mm間隙）平行板進(jìn)行頻率掃描。用刀片剪切凝膠，制備樣品。在25 ℃、0.1～10 Hz、應(yīng)力1%條件下進(jìn)行頻率掃描，記錄模量。

1.3.6 微觀結(jié)構(gòu)分析

1.3.6.1 激光共聚焦掃描測(cè)試

將成膠前的大豆蛋白共混溶液與染色染料Rhodamine B（10 μg/g）混合后，按1.3.1節(jié)方法，將共混溶液滴入凹槽載玻片，加一層蓋玻片且在四周涂一層指甲油防止水分蒸發(fā)后，分別放在各溫度下保溫成膠。激發(fā)波長543 nm，在560～700 nm范圍內(nèi)進(jìn)行觀測(cè)。

1.3.6.2 圖像的分形分析

采用ImageJ 1.50i對(duì)激光共聚焦圖像進(jìn)行處理，閾值化所用的灰度值是根據(jù)Eduard等[20]的方法分析每幅圖像的灰度直方圖的中值。按式（1）和（2）的分形盒計(jì)數(shù)法計(jì)算分形維數(shù)（D?）：

式中：N?為包含某一部分圖像的某一尺度上的盒子的數(shù)量；?為對(duì)應(yīng)的尺度；D為分形維數(shù)；D?為一個(gè)額外的維度用于真實(shí)地表示凝膠的三維特征。

1.4 數(shù)據(jù)分析

除凝膠強(qiáng)度測(cè)定6 次，其他均測(cè)定3 次。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPS和Origin 8.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，每組數(shù)據(jù)均進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），平均值差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性 （P＜0.05）通過LSD測(cè)試進(jìn)行評(píng)估，所有結(jié)果均以±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸化速率的分析

圖 1 保溫溫度對(duì)SPI凝膠pH值的影響Fig. 1 Effect of incubation temperature on the pH value of soy protein isolate gels

2.1.1 pH值的測(cè)定結(jié)果

GDL溶于水后會(huì)逐漸分解成葡萄糖酸，釋放酸性離子H+，中和蛋白質(zhì)的表面電荷，降低共混體系的pH值，使蛋白質(zhì)聚集、沉淀、成膠[11,21-23]。如圖1所示，SPI凝膠樣品的最終pH值穩(wěn)定在5.17。隨著保溫溫度的升高，SPI凝膠的pH值下降速率增加，這是因?yàn)镚DL分解速率隨保溫溫度的升高而加快，酸化速率增加[15-16]。當(dāng)保溫溫度不大于60 ℃時(shí)，樣品在10 h之后達(dá)到穩(wěn)定pH值，酸化速率慢。當(dāng)保溫溫度為90 ℃時(shí)，樣品在2 h時(shí)便達(dá)到穩(wěn)定pH值。由此表明，通過改變保溫溫度，可以顯著調(diào)控大豆蛋白凝膠被酸化的速率。

2.1.2 濁度測(cè)定結(jié)果

圖 2 保溫溫度對(duì)SPI溶液濁度的影響Fig. 2 Effect of incubation temperature on the turbidity of soy protein isolate solution

當(dāng)?shù)鞍拙奂脑窖杆?，聚集程度越高，蛋白濁度越高[17]。由圖2可知，隨著保溫溫度的升高，SPI溶液的濁度越高，形成凝膠的時(shí)間越短。當(dāng)保溫溫度不大于40 ℃時(shí)，蛋白溶液在保溫30 min后仍未形成凝膠，而當(dāng)保溫溫度不小于50 ℃時(shí)，蛋白在保溫30 min的過程中均已開始形成凝膠，SPI溶液在90 ℃保溫1 min后即形成凝膠。結(jié)合SPI凝膠pH值的測(cè)定結(jié)果，不同的保溫溫度可以調(diào)控SPI凝膠被酸化的速率。

2.2 凝膠強(qiáng)度的測(cè)定

圖 3 保溫溫度對(duì)SPI凝膠的凝膠強(qiáng)度的影響Fig. 3 Effect of incubation temperature on the gel strength of soy protein isolate gels

由圖3可知，隨著保溫溫度的升高，SPI凝膠的凝膠強(qiáng)度不斷提高。30 ℃和40 ℃保溫形成的蛋白凝膠的凝膠強(qiáng)度無顯著差異，這是因?yàn)楫?dāng)保溫溫度不大于40 ℃時(shí)，酸化速率較慢，蛋白聚集程度較低，蛋白溶液在保溫30 min后均未形成凝膠，凝膠結(jié)構(gòu)極弱。當(dāng)保溫溫度提高到50 ℃時(shí)，酸化速率加快，蛋白聚集加快，蛋白溶液在保溫20 min后便凝固成膠，凝膠強(qiáng)度顯著增大。當(dāng)保溫溫度不大于60 ℃時(shí)，凝膠樣品在10 h之后才達(dá)到穩(wěn)定pH值，凝膠結(jié)構(gòu)固化時(shí)間短，凝膠強(qiáng)度較低，當(dāng)保溫溫度由60 ℃提高到70 ℃時(shí)，酸化速率顯著加快，蛋白在保溫10 min的過程中均已開始形成凝膠，蛋白凝膠固化時(shí)間較長，凝膠結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定，所以凝膠強(qiáng)度顯著增大[24-25]。

2.3 頻率掃描結(jié)果

圖 4 保溫溫度對(duì)SPI凝膠頻率掃描過程中G’的影響Fig. 4 Effect of incubation temperature on the storage modulus of soy protein isolate gels during frequency sweep

由圖4可知，SPI凝膠的儲(chǔ)能模量（G’）在0.1～10 Hz范圍內(nèi)是頻率相關(guān)的，即形成了SPI凝膠結(jié)構(gòu)，具有典型的黏彈性材料屬性[26-27]。當(dāng)保溫溫度不大于50 ℃時(shí)，酸化速率較慢，SPI凝膠達(dá)到穩(wěn)定pH值需較長的時(shí)間（≥10 h），蛋白聚集體之間彼此交聯(lián)形成凝膠的時(shí)間長，凝膠固化時(shí)間短，因此，在30、40、50 ℃的保溫溫度下G’間無顯著性差異。當(dāng)保溫溫度為60 ℃時(shí)，酸化速率加快，蛋白聚集體之間迅速發(fā)生交聯(lián)，蛋白凝膠在保溫10 min后便固化成膠，G’增大，凝膠剛性增大。隨著保溫溫度的升高，酸化速率不斷增加，蛋白聚集和凝膠速率不斷增加，凝膠剛性不斷增加，90 ℃時(shí)達(dá)到最大[28]。

2.4 保水性的測(cè)定

圖 5 保溫溫度對(duì)SPI凝膠的保水性的影響Fig. 5 Effect of incubation temperature on the water holding capacity of soy protein isolate gels

如圖5所示，隨著保溫溫度的升高，SPI凝膠的保水性先增加后降低，60 ℃時(shí)達(dá)到最大。當(dāng)保溫溫度小于60 ℃時(shí)，酸化速率過慢，pH值變化緩慢，聚集速率過慢，凝膠形成緩慢，需較長時(shí)間才可達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，凝膠結(jié)構(gòu)較弱，因而形成的凝膠保水性差。當(dāng)保溫溫度大于60 ℃時(shí)，酸化速率過快，pH值下降過快，聚集過快，形成的聚集體較大，凝膠結(jié)構(gòu)粗糙，不均勻，凝膠的保水性相較于最優(yōu)的酸化速率條件下（60 ℃保溫）的保水性有所下降[17]。當(dāng)保溫溫度為60 ℃時(shí)，GDL分解速率最為適中，SPI被酸化的速率最優(yōu)，因而形成的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)最為致密均勻，凝膠保水性最優(yōu)。該結(jié)果與SPI凝膠的凝膠強(qiáng)度變化趨勢(shì)不同，這是因?yàn)榈鞍啄z的保水性主要受蛋白分子網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的致密程度所調(diào)控，而不是凝膠強(qiáng)度[29-30]。

2.5 微觀結(jié)構(gòu)分析

圖 6 不同保溫溫度形成的SPI凝膠的共聚焦圖和對(duì)應(yīng)的二進(jìn)值圖Fig. 6 Confocal laser scanning microscopic images and corresponding binary images of soy protein isolate gels formed at different incubation temperatures

如圖6所示，當(dāng)保溫溫度在60 ℃時(shí)，形成的SPI凝膠結(jié)構(gòu)最為均勻致密，其分形維數(shù)達(dá)到最大值2.90±0.010；30 ℃保溫時(shí)，分形維數(shù)為2.88±0.010，凝膠結(jié)構(gòu)松散、不致密，這是因?yàn)樗峄俾蔬^低，蛋白分子聚集速率過慢，不能形成致密的凝膠結(jié)構(gòu)，保水性較低；90 ℃保溫時(shí)，分形維數(shù)最低2.86±0.010，這是因?yàn)樵谠摐囟认麦w系酸化速率過快，蛋白分子迅速聚集沉淀，形成團(tuán)簇狀結(jié)構(gòu)，因而凝膠結(jié)構(gòu)空隙較多，凝膠的致密均勻程度降低。該結(jié)果與SPI凝膠保水性的結(jié)果相同，這也進(jìn)一步表明蛋白凝膠的保水性主要受蛋白分子結(jié)構(gòu)的致密程度調(diào)控[29-30]。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)研究酸化速率對(duì)GDL誘導(dǎo)的SPI凝膠結(jié)構(gòu)的影響，pH值和濁度的測(cè)定結(jié)果表明，通過改變保溫溫度可以顯著調(diào)控蛋白凝膠的酸化速率。當(dāng)保溫溫度不斷升高，GDL凝固劑的釋放速率越來越快，SPI凝膠的pH值的下降速率越來越大，同時(shí)，蛋白溶液的濁度不斷增加，表明蛋白聚集速率的增加，凝膠形成速率的加快。隨著酸化速率的增加，SPI凝膠的凝膠強(qiáng)度和剛性不斷提高，但是，保水性先增加后降低，在60 ℃時(shí)達(dá)到最大值。微觀結(jié)構(gòu)的測(cè)定結(jié)果顯示，在60 ℃保溫的SPI凝膠的結(jié)構(gòu)最為均勻致密。綜上所述，GDL的酸化速率可以調(diào)控SPI凝膠的質(zhì)構(gòu)特性，制成質(zhì)構(gòu)各異的SPI凝膠。