茅嘉田，周晚晴，Pavel N. NESTERENKO，葉明立，謝廣發(fā)，陳梅蘭,

（1.浙江樹人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 310028；2.莫斯科國立萊蒙諾索夫大學(xué)物理化學(xué)部化學(xué)系，俄羅斯 莫斯科 119991）

黃酒也稱為米酒，屬于釀造酒，在世界三大釀造酒中占有重要的一席，它有養(yǎng)胃健脾、和血行氣、調(diào)經(jīng)止痛等功效，適合冬天畏寒怕冷、四肢發(fā)涼者。黃酒中含有Li+、Na+、NH4+、K+、Mg2+、Ca2+等多種有益于人體健康的陽離子等，Na+和K+是保持人體電解質(zhì)平衡的基礎(chǔ)，適量的Li+能改善人體造血功能，提高免疫機能[1]，Mg2+可增強人體代謝時酶的活力，Ca2+可促進糖化，提高酶活性[2-3]，還能促進曲中酶的產(chǎn)生與溶出，使α-淀粉酶不易破壞[4]，NH4+的毒性未寫明，但是氨水具有中等毒性，半數(shù)致死量（大鼠，經(jīng)口）為350 mg/kg，已公布的吸入人體最低中毒質(zhì)量濃度為408 mg/L[5]，超過一定量會對人體產(chǎn)生危害。

目前檢測Li+、Na+、NH4+、K+、Mg2+、Ca2+的方法有原子吸收法[6-10]、電位滴定法[8]、分光光度法[9]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法[10-11]、毛細管區(qū)帶電泳法[12-14]、離子色譜法[15-24]等。在這些方法中，離子色譜法可同時適用于白酒、啤酒、葡萄酒以及黃酒，分析速度快、靈敏度高、選擇性好、能實現(xiàn)多組分同時分離定量等特點，簡單、快速、準(zhǔn)確，在應(yīng)用中推廣性強。

盧中明等[15]采用離子色譜法測定白酒中的Na+、K+、 Mg2+、Ca2+4 種陽離子含量，未檢測Li+和NH4+。郭龑茹等[20]的實驗測定啤酒樣品中的8 種陰離子和5 種陽離子（Na+、NH4+、K+、Mg2+、Ca2+），但缺少Li+。馬繼平等[2]在20 min內(nèi)完成啤酒中5 種陽離子的測定。 韓小江等[16]利用非抑制電導(dǎo)離子色譜法在25 min內(nèi)分離出啤酒中的4 種陽離子和3 種胺類化合物，未檢測其中的Li+。目前黃酒中主要研究對象為生物胺，而對黃酒中NH4+的研究鮮見報道。如張鳳杰等[25]對黃酒釀造過程中生物胺的變化規(guī)律進行研究，以及在釀造的各個階段探究生物胺的組成成分。

本實驗建立離子色譜法同時測定酒中的金屬陽離子Li+、Na+、NH4+、K+、Mg2+、Ca2+，并利用建立的方法檢測市面上常見的18 種黃酒、3 種白酒、3 種啤酒和3 種葡萄酒的陽離子，對檢測結(jié)果進行對比分析，對黃酒中較高含量NH4+的來源進行探討，為黃酒的質(zhì)量控制及酒類購買選擇提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃酒、白酒、啤酒、葡萄酒 市購；焦糖色素由黃酒生產(chǎn)廠家提供。

實驗用水為超純水（電阻率為18.2 MΩ·cm） 美國 Millipore有限公司；氯化鋰（分析純） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；六水合氯化鍶、硫酸鈣、硫酸鎂、氯化鈉、硝酸鉀、氯化銨（均為分析純） 上海試四赫維化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ICS-2100型離子色譜儀 美國Thermo Fisher公司； Ion Pac CS16陽離子分析柱（5 mm×250 mm）、Ion Pac CG16陽離子保護柱（5 mm×50 mm）、CERS-300（4 mm）陽離子抑制器、EGC III MSA淋洗液發(fā)生器和CR-CTC連續(xù)自動再生捕獲柱、數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)Chromeleon 6.8 美國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

取市售瓶裝黃酒1 mL稀釋10 倍后過0.45 μm濾膜和RP（Onguard）小柱（預(yù)先經(jīng)甲醇和水活化），棄去初濾液，續(xù)濾液收集后進樣分析Na+、NH4+、K+、Mg2+、Ca2+等離子的含量。若酒樣底部有沉淀物，先放入50 ℃的恒溫箱加熱3 min使底部沉淀物溶解。Li+在樣品中含量較低，采取直接處理后進樣分析。

啤酒樣品經(jīng)超聲脫氣10 min，稀釋5 倍后進行上述處理后進樣；白酒樣品不稀釋直接前處理后進樣；葡萄酒稀釋20 倍后前處理進樣，其中測NH4+含量不稀釋處理后直接進樣，所有樣品溶液制備均用電阻率為18.2 MΩ·cm超純水；焦糖色素比較黏稠，稀釋100 倍后前處理再進樣分析。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取6 種陽離子，置于100 mL容量瓶中，用超純水定容，配制質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的貯備液，于4 ℃冰箱備用。分別移取一定量的貯備液至10 mL的容量瓶中，用超純水定容，繪制陽離子的回歸方程（Li+：0.005～1 mg/L；Na+：0.5～10 mg/L；NH4+： 1～40 mg/L；K+：5～100 mg/L；Mg2+：1～30 mg/L；Ca2+：1～50 mg/L）。

(3)其他利用職務(wù)阻礙解救被拐賣、綁架的婦女、兒童應(yīng)予追究刑事責(zé)任的情形。該情形屬于兜底情形，是對上述不完全列舉的一種補充。其他利用職務(wù)阻礙解救的行為，是指除上述利用職權(quán)和利用職務(wù)上的便利以外，與上述情形相類似的行為，既可能是利用職權(quán)的行為，也可能是利用職務(wù)上的便利的行為，還可能兩者兼而有之。

1.3.3 色譜條件

Ion Pac CS16陽離子分析柱（5 mm×250 mm）和Ion Pac CG16陽離子保護柱（5 mm×50 mm）；柱溫42 ℃；檢測器溫度35 ℃；流動相：30 mmol/L甲基磺酸（淋洗液發(fā)生器自動生成）；進樣量25 μL，以峰面積定量；流速1.0 mL/min；抑制電流88 mA。標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的色譜峰見圖1。

圖 1 陽離子黃酒樣品（a）與標(biāo)準(zhǔn)樣品（b）（10 mg/L）對比圖Fig. 1 Comparison of chromatograms of cations in yellow wine sample (a) and cation standards (b) (10 mg/L)

2 結(jié)果與分析

2.1 方法線性范圍、重復(fù)性和檢出限結(jié)果

用1 000 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液配制6 種陽離子混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，按1.3.3節(jié)色譜條件進樣，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算回歸方程以及相關(guān)系數(shù)，結(jié)果表明6 種陽離子的相關(guān)系數(shù)R2均不小于0.999 0，可見方法具有良好的線性關(guān)系（表1）。

另取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（Li+：0.005 mg/L、Na+：0.5 mg/L、NH4+：5.0 mg/L、K+：10.0 mg/L、Mg2+：1.0 mg/L、Ca2+：1.0 mg/L）重復(fù)進樣6 次，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），以3 倍信噪比計算得出各陽離子的檢出限，結(jié)果見表1。

表 1 線性范圍、重復(fù)性及檢出限Table 1 Linear range, reproducibility and limits of detection for the developed method

2.2 方法的回收率結(jié)果

在待測黃酒樣品5、18中加入3 種質(zhì)量濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別為樣品質(zhì)量濃度的120%、100%和80%左右。加標(biāo)分2 次進行，Li+直接加標(biāo)，含量較高的 Na+、NH4+、K+、Mg2+、Ca2+加標(biāo)后稀釋10 倍后再進行測定，結(jié)果見表2。

表 2 樣品的加標(biāo)回收率Table 2 Recoveries of spiked samples

2.3 黃酒樣品測定結(jié)果

圖 2 黃酒樣品6的離子色譜圖Fig. 2 Chromatograms of cations in yellow rice wine sample 6

考慮樣品稀釋10 倍過RP（Onguard）小柱后對樣品可能吸附，因此實驗對過RP（Onguard）小柱樣品進行了加標(biāo)回收實驗，結(jié)果表明過RP（Onguard）小柱后的回收率在91.11%～108.76%之間，可見對待測陽離子并無吸附作用。樣品經(jīng)1.3.1節(jié)前處理后手動進樣，外標(biāo)法定量，測定的質(zhì)量濃度結(jié)果見圖2、表3。

表 3 黃酒樣品中各陽離子含量Table 3 Concentrations of cations in yellow rice wine samples

2.4 其他有機胺的影響

考慮到黃酒因有機物非常復(fù)雜，可能存在其他有機胺，因此在1.3.3節(jié)色譜條件下進樣6 種陽離子與6 種有機胺（甲胺、乙胺、二甲胺、丙胺、三甲胺、丁胺各為1 mg/L），如圖3所示，陽離子標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖中NH4+的保留時間為8.51 min，K+的保留時間為12.03 min，而有機胺標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖顯示有機胺出峰的位置為4～6，保留時間為9.54～11.51 min，可見有機胺并不影響NH4+和K+的檢測。

圖 3 陽離子標(biāo)準(zhǔn)溶液與有機胺標(biāo)準(zhǔn)溶液對比圖Fig. 3 Chromatograms of mixture standard solution of six cations and mixture standard solution of six organic amines

2.5 黃酒中NH4+的來源探討

2.5.1 焦糖色素的影響

圖 4 焦糖色素陽離子色譜圖Fig. 4 Chromatogram of cations in caramel pigment

2.5.2 黃酒釀造原料的影響

考慮黃酒中NH4+可能來自于釀酒過程，是原料中氨基酸及含氮化合物通過發(fā)酵，在微生物的作用下形成 NH4+[21]。因此分別對白酒、啤酒及葡萄酒3 種不同原料釀制的酒進行檢測，結(jié)果見表4。酒樣19、22、25的色譜對比圖見圖5。

表 4 白酒、啤酒和葡萄酒樣品陽離子含量Table 4 Concentrations of cations detected in Chinese liquor, beer and red wine samples mg/L

從表4可知，白酒樣品中NH4+低于檢出限，且其余陽離子的檢出質(zhì)量濃度偏低，可能是由于白酒的制備方式屬于蒸餾酒，僅通過較短時間的發(fā)酵和多次蒸餾技術(shù)[26]啤酒中22號和23兩種品牌檢出質(zhì)量濃度為30～45 mg/L的 NH4+，但質(zhì)量濃度大大低于黃酒中的NH4+，是黃酒中NH4+的13.28%～31.30%。24號啤酒是純生啤酒，NH4+未檢出，相對于熟啤酒釀造過程，純生啤酒在整個釀造、過濾、包裝全過程對污染微生物嚴(yán)格控制，是酵母的純種發(fā)酵，這可能是未生成NH4+的原因。而3 種葡萄酒（分別來自西班牙、意大利和中國）也全部檢測出NH4+，但質(zhì)量濃度也大大低于黃酒，甚至比啤酒低，這可能原因是葡萄中粗蛋白含量較低（約為0.5%）[27]。

啤酒麥芽汁質(zhì)量分?jǐn)?shù)在10%～12%之間，相當(dāng)于1.0 kg麥芽可以制作9.0 kg左右的啤酒，而1.0 kg大米可以釀造2.0 kg左右的黃酒，可見，啤酒的產(chǎn)量約為黃酒產(chǎn)量的4.5 倍，而黃酒中的NH4+含量平均值約為啤酒中NH4+含量的4～5 倍，而大米中粗蛋白含量（8.8%）略低于大麥中粗蛋白含量（9%～12%），兩者濃度之間的關(guān)系說明釀造酒中NH4+主要來源于原料中的粗蛋白，粗蛋白在微生物的作用下把原料中的含氮化物最終轉(zhuǎn)變成NH4+。

圖 5 3 種類型酒樣的離子色譜圖Fig. 5 Chromatograms of cations in beer, Chinese liquor and wine

2.5.3 黃酒發(fā)酵程度（乙醇體積分?jǐn)?shù)）對NH4+生成的影響

圖 6 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)條件下NH＋4質(zhì)量濃度Fig. 6 Variation in ammonium ion concentration in wines with different alcohol contents

乙醇由酵母發(fā)酵轉(zhuǎn)化而來，由相關(guān)文獻[30-31]可知，氮素營養(yǎng)是酵母菌進行正常乙醇發(fā)酵所必需的重要營養(yǎng)元素之一。乙醇發(fā)酵啟動后，酵母菌優(yōu)先利用銨態(tài)氮形式的氮源。是因為在初級發(fā)酵過程中，氮元素作為酵母細胞生長和新陳代謝的重要組成部分，常以營養(yǎng)素形式補充氮的發(fā)酵，并且無機氮比有機氮更容易被酵母消耗，即使在初級發(fā)酵過程中乙醇體積分?jǐn)?shù)較高，也很容易被酵母吸收。而且在蛋白質(zhì)水解過程中，如果污染了腐敗細菌，會使蛋白質(zhì)過度（異常）發(fā)酵，此時，蛋白質(zhì)水解生成的氨基酸繼續(xù)降解，或失去CO2生成胺類，或同時進行脫氨基和脫羧基反應(yīng)，釋放出游離 NH4+和NH3[28]。說明，發(fā)酵程度越好，乙醇體積分?jǐn)?shù)越高，生成的NH4+也會越多。為了檢驗發(fā)酵程度與NH4+含量的關(guān)系，對比黃酒的乙醇體積分?jǐn)?shù)與NH4+的含量， 見圖6。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的上升，NH4+的含量總趨勢也是上升，可見發(fā)酵程度與NH4+的含量相關(guān)。

2.5.4 釀造方式及酒齡對NH4+的影響

實驗選擇了元紅、加飯、善釀和香雪及酒齡分別為3、5、8、10 a及15 a的黃酒進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同釀造方式和酒齡對黃酒成品中NH4+的含量無明顯規(guī)律。

2.6 黃酒中的陽離子含量

對5 種品牌黃酒及同一品牌不同年份黃酒中陽離子含量進行分析，發(fā)現(xiàn)黃酒中Na+、K+、Ca2+、NH4+和Mg2+的濃度普遍較高，相比于同一水源地的自來水和地表水中的K+、Ca2+、Mg2+高出上百倍，最高的Ca2+質(zhì)量濃度超過310 mg/L，其中地表水中NH4+含量極低，作為 黃酒釀造的自來水中的NH4+含量幾乎為零[22]，而黃酒中NH4+質(zhì)量濃度最高的達306.14 mg/L，可見黃酒中陽離子主要來源于釀造原料。白酒中NH4+未檢出或低于檢出限，Na+和Ca2+的含量相比黃酒相差30～270 倍左右。而葡萄酒Na+、Mg2+和Ca2+含量高于常規(guī)地表水2 倍多，K+含量普遍較高（超過1 000 mg/L），是黃酒中K+含量的2.62～6.38 倍。K+含量高的主要原因是葡萄（可食部分）本身K+含量較高，達到995 mg/100 g[29-32]。

3 結(jié) 論

綜上所述，黃酒釀造以麥曲為糖化發(fā)酵劑，麥曲中含有豐富的微生物，所分泌的酶由于催化作用可加快蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)變成氨基酸。由于細菌種類繁多，在微生物作用下使原料中蛋白質(zhì)分解，產(chǎn)生游離NH3和CO2，這會導(dǎo)致NH4+的增加。其原因有待進一步研究，以明確其形成機理，以實現(xiàn)有效的控制。其次黃酒中陽離子普遍比同一水源地的自來水和地表水高出上百倍，尤其是K+、 Ca2+、Mg2+、NH4+，其中NH4+的差異尤為明顯，地表水和自來水中含量極低甚至為0，但黃酒中可達 130～310 mg/L，可見，黃酒中陽離子含量高與水質(zhì)無關(guān)，主要與釀造原料有關(guān)。不僅如此，發(fā)酵程度也會影響NH4+的含量，由于乙醇由酵母發(fā)酵轉(zhuǎn)化而來，酵母菌會優(yōu)先利用銨態(tài)氮形式的氮源，因此乙醇體積分?jǐn)?shù)越高，發(fā)酵程度也越完全。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的上升，NH4+的含量總趨勢會上升，可見發(fā)酵程度與NH4+含量有關(guān)。