李 安，陳秋生，趙 杰，潘立剛,，張 強，靳欣欣，張少軍，錢 訓

（1.北京農業(yè)質量標準與檢測技術研究中心，北京 100097；2.天津市農業(yè)質量標準與檢測技術研究所，天津 300381；3.河北省農林科學院農產品質量安全研究中心，河北 石家莊 050051）

近年來，國家大力實施品牌興農、質量強農戰(zhàn)略，一大批具有鮮明地域特色的名優(yōu)產品被認定為國家地理標志產品，有效地推進了農業(yè)生產的標準化、產品品牌價值的提升和產業(yè)集群發(fā)展，對區(qū)域經濟的發(fā)展貢獻度不斷加大。以平谷大桃為例，自2006年實施地理標志產品保護以來，逐漸成為北京市平谷區(qū)水果種植的龍頭和支柱產業(yè)（占全部果品產值達80%）[1]。對食品的原產地進行認證和追溯是歐盟、美國、日本、新西蘭等許多發(fā)達國家的通行做法[2-3]，通過食品產地追溯體系的建設，一方面為原產地標識的保護提供技術支撐，另一方面也是實施“從農田到餐桌”安全全程控制的必要手段。因此，研發(fā)可靠有效的產地判別技術，成為構建產地追溯體系、保護地理標志產品、落實食品標簽法規(guī)和保障食品安全的迫切需求。

穩(wěn)定同位素指紋分析技術是食品產地溯源與確證領域最具應用前景的技術之一。由于生物體的穩(wěn)定同位素組成與氣候條件和地理環(huán)境密切相關，蘊含了豐富的產地環(huán)境信息，因此成為產地鑒別的關鍵溯源因子。國內外學者利用穩(wěn)定同位素指紋分析技術，已開展了蘋果、梨、棗、橙汁、葡萄酒等水果及水果制品的產地溯源研究。Tanja等[4]比較了意大利4 個產區(qū)4 個品種蘋果δ13C、δ15N比值差異，指出地域因素對蘋果C、N同位素組成的影響明顯大于品種因素，利用C、N同位素組合可區(qū)分一定空間尺度差異的蘋果。王紅云等[5]對河北省太行山區(qū)贊皇、行唐、阜平3 縣大棗果肉中的δ13C和δ15N進行了分析，構建了太行山中麓大棗果肉中同位素組成的區(qū)域分布圖譜。Schipilliti等[6]利用單體同位素分析技術研究了意大利不同產地的檸檬精油中C同位素組成，結果表明δ13C可有效區(qū)分不同產地的精油。吳浩等[7]利用5 種揮發(fā)性組分的單體C同位素比值有效區(qū)分了中國、法國、美國和澳大利亞4 個產地的葡萄酒。早期學者們對C、N同位素比較關注，近年研究發(fā)現H、O同位素也是區(qū)分食品原產地的有效指標。Rummel等[8]利用δ2H和87Sr含量組成的二維圖譜有效區(qū)分了西班牙與美洲國家的橙汁。Bat等[9]利用糖分δ13C、蛋白質δ13C和δ15N、果汁水分δ2H和δ18O和8 種元素（P、S、Cl、K、Ca、Mn、Zn和Rb）等指標建立的線性判別模型成功區(qū)分了斯洛文尼亞國內4 個區(qū)域的蘋果，其中第1個判別函數對分類模型的解釋能力達89.7%，果汁水分δ2H和δ18O是主要的貢獻因子。黃島平等[10]分析比較了4 個省份的柑橘果汁δ2H值，結果表明不同地域的柑橘果汁中H同位素組成具有極顯著差異，δ2H值總體呈現隨著地理緯度增加而減小的趨勢。

稀土元素是元素周期表中15 種鑭系元素、鈧元素和釔元素的總稱。稀土元素以不同形態(tài)廣泛分布于土壤中，通常主要以難溶殘渣態(tài)形式存在，但也存在可被植物吸收利用的水溶態(tài)、可交換態(tài)和有機態(tài)[11]。植源性農產品中稀土元素來源與地域環(huán)境具有一定的關聯性，近年來國內外學者對利用稀土元素作為產地溯源指標的可行性進行了探究。林昕等[12]研究了基于15 種稀土元素的指紋特征對云南普洱茶產地判別的有效性，結果表明La、Ce、Eu和Sc是有效的判別指標，對普洱古樹茶的產地判別準確率達到94.4%。唐偲雨等[13]利用包含稀土元素在內的32 種礦質元素指紋建立了不同產地的22 個茶葉樣品主成分分類模型時發(fā)現，稀土元素Y、Pr、Nd、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er和微量元素Fe起到主要貢獻作用。Bandoniene等[14]通過對包含稀土元素在內的多種礦物元素的測定，利用多元判別分析方法成功將來自澳大利亞、中國和俄羅斯的南瓜籽油進行了區(qū)分。Santos等[15]對南美地區(qū)2 種外觀非常相近的特色水果，即埃塔棕果和阿薩依果中的稀土元素進行了分析，發(fā)現Sm、Tb、La、Pr、Gd、Ce和Nd等稀土元素在2 種水果中的差異十分明顯，可應用于2 種水果的區(qū)分以及產地的鑒別。Farmaki等[16]利用希臘4 個不同地區(qū)橄欖油中的10 種稀土元素含量分布數據建立了線性判別模型，模型預測準確為73%。

通常利用單一技術難以實現農產品產地的準確判別，尤其是針對小空間尺度的產品產地區(qū)分難度較大，采用多技術、多指標聯合進行產地的精確溯源是當前的發(fā)展趨勢[17]。本研究擬利用穩(wěn)定同位素聯合稀土元素指紋分析技術，建立華北地區(qū)小空間尺度下的普通大桃產地溯源模型，以期為大桃產地溯源檢測技術體系的建立提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

穩(wěn)定同位素標準物質USGS40（δ13CVPDB-LSVEC= -26.39‰，δ15NAIR=-4.52‰）、USGS45（δ2HVSMOW= -1 0.3‰，δ18OVSMOW=-2.2 3 8‰）、U S G S 4 6（δ2HVSMOW=-235.8‰，δ18OVSMOW=-29.8‰）和USGS47（δ2HVSMOW=-150.2‰，δ18OVSMOW=-19.80‰）均為美國地質勘探局Reston穩(wěn)定同位素實驗室研制。

稀土元素測定標準物質GBW10019（生物成分分析標準物質——蘋果）為中國地質科學院地球物理地球化學勘查研究所研制。

1.2 儀器與設備

MAT253穩(wěn)定同位素比值質譜儀、Flash 2000HT元素分析儀 美國賽默飛世爾公司；GM200研磨儀 德國萊馳公司；XP6微量天平 瑞士梅特勒-托利多公司；SCIENTZ-18N冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司；LI-2000全自動真空冷凝抽提系統(tǒng) 北京理加聯合科技有限公司；7900電感耦合等離子體質譜（inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS）儀 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

2 0 1 8 年7 ～8 月在北京和河北桃主產區(qū)采集樣品，樣品數量依次為：河北省樂亭縣2 0 個（經度范圍11 8°4 8′3 4′′～11 8°5 9′8′′，緯度范圍39°19′50′′～39°30′40′′）、河北省順平縣15 個（經度范圍115°3′9′′～115°8′41′′，緯度范圍38°54′10′′～38°58′56′′）、河北省永清縣13 個（經度范圍116°34′17′′～116°36′4′′，緯度范圍39°11′54′′～39°28′26′′）、北京市平谷區(qū)44 個（經度范圍117°0′54′′～117°16′9′′，緯度范圍40°8′47′′～40°16′33′′），其中平谷大桃和順平桃為地理標志產品。樣品均為普通大桃，品種包括久保、綠化九、大紅桃等當地主栽品種。4 個產地的地理氣候環(huán)境具有一定程度的差異，緯度值從大到小依次為平谷區(qū)＞樂亭縣＞永清縣＞順平縣；平谷區(qū)和順平縣為半山區(qū)丘陵地形，平均海拔高于永清縣和樂亭縣；樂亭縣為濱海地區(qū)，具有典型的濱海半濕潤大陸性季風氣候特征。

1.3.2 樣品前處理

樣品采集后，去除果柄、果核，并用潔凈干紗布擦去果皮表面的灰塵和土壤，利用研磨儀將樣品研碎后分裝成3 份，分別用于冷凍干燥、水分提取和樣品消解。

冷凍干燥：取適量帶皮研碎后的桃果漿樣品進行預凍處理后，置于冷凍干燥機的樣品室中，在-40 ℃、50 Pa條件下進行真空冷凍干燥48 h，凍干后立即取出過100 目篩，將粉末樣品置于干燥器中保存，待測。

水分提?。喝? g左右的研碎樣品于玻璃樣品瓶中，利用全自動真空冷凝抽提系統(tǒng)進行水分提取，將提取出的水分轉移至進樣小瓶中密封保存，待測。

樣品消解：稱取5 g（精確到0.001 g）鮮樣于50 mL微波消解罐中，加入8 mL硝酸，加蓋放置過夜，裝入消解外罐，放入微波消解爐轉盤上，消解條件主要參考GB 5009.268—2016《食品中多元素的測定》[18]，具體如 表1所示。消解結束后取出消解罐，緩慢打開罐蓋進行排氣，將消解罐放在控溫電熱板上，于100 ℃加熱30 min，用水定容至25 mL，待測。試劑空白和國家標準物質GBW10019按上述方法同時進行分析。

表 1 微波消解條件Table 1 Conditions of microwave digestion

1.3.3 穩(wěn)定同位素比值測定

C、N穩(wěn)定同位素比值的測定：稱取約0.8 mg待測樣品，用錫杯包好后置于元素分析儀自動進樣盤中，樣品在960 ℃高溫燃燒，并在Cr2O3的作用下氧化成CO2和氮氧化物，氮氧化物經銅還原成N2，即樣品中的C和N元素轉化成CO2和N2，并在氦載氣流和色譜柱吸附解吸后，N2和CO2先后進入穩(wěn)定同位素質譜儀進行同位素比值的測定。以USGS40為標準物質，采用單點校正的方式對測試結果進行校正。

H、O穩(wěn)定同位素比值的測定：將提取的樣品水分置于元素分析儀的自動進樣盤中，樣品在1 400 ℃、玻璃碳珠催化作用下裂解為H2和CO，即樣品中的H和O元素轉化成H2和CO氣體，在氦載氣流和色譜柱吸附解吸后，H2和CO先后進入穩(wěn)定同位素質譜儀進行同位素比值的測定。以USGS45、USGS46和USGS47為標準物質，采用3 點校正的方式對測試結果進行校正。

元素分析-穩(wěn)定同位素質譜（elemental analysisisotope ratio mass spectrometry，EA-IRMS）儀的具體參數：氦氣載氣流速100 mL/min，氦氣吹掃氣流速100 mL/min，C、N燃燒爐溫度960 ℃，H、O裂解爐溫度1 400 ℃。

穩(wěn)定同位素比值按下式計算：

式中：R樣品為測試樣品中重同位素與輕同位素豐度比值，即13C/12C、15N/14N、18O/16O、2H/1H；R標準為國際標準樣的重同位素與輕同位素豐度比值，其中δ13C以國際標準V-PDB為基準，δ15N以大氣為參照標準，δ2H和δ18O以平均海洋水為基準。

1.3.4 稀土元素含量測定

桃樣品中16 種稀土元素（La、Gd、Sm、Ce、Nd、Pr、Eu、Sc、Y、Yb、Tb、Ho、Dy、Tm、Er、Lu）含量由ICP-MS測定。工作參數：射頻功率1 550 W，冷卻氣流速15.0 L/min，輔助氣流速0.90 L/min，霧化器流速 1.16 L/min，采樣高度8.0 mm，泵穩(wěn)定時間180 s。內標溶液為Agilent 5188-6525；儀器調諧貯備液為Agilent 5184-3566。

1.4 數據處理

應用SPSS 22.0軟件對不同產地的大桃樣品4 種穩(wěn)定同位素比值和16 種稀土元素含量進行及多重比較分析和差異顯著性檢驗。應用SPSS 22.0軟件對4 個產地的大桃樣品進行一般判別分析。

2 結果與分析

2.1 大桃C、N、H、O穩(wěn)定同位素比值差異分析

利用EA-IRMS測定來自北京和河北4 個不同縣區(qū)產地的大桃樣品C、N、H、O穩(wěn)定同位素比值，即δ13C、δ15N、δ2H和δ18O。如圖1所示，不同產區(qū)的桃穩(wěn)定同位素組成表現出一定的地域差異性。桃樹為典型的C3植物，其果實δ13C值分布范圍為-29.168‰～-25.061‰。平谷區(qū)和順平縣同屬山區(qū)，地理及氣候環(huán)境有相似之處，2 個產地的δ13C值總體上低于其他產地。樂亭縣的δ13C值顯著高于其他3 個產地（P＜0.05），原因可能是樂亭地區(qū)屬濱海半濕潤大陸性季風氣候，與其他3 個產地明顯不同。農作物樣品的δ15N值與施肥類型密切相關，施用有機肥的農作物樣品中δ15N值明顯高于施用無機化肥樣品。相較地域因素的影響，施肥因素導致δ15N值差異的影響程度要大，由圖1可知，平谷大桃的δ15N值顯著高于其他產區(qū)（P＜0.05），樂亭、順平、永清3 個產區(qū)大桃的δ15N值差異不顯著（P＞0.05），由此說明，平谷地區(qū)的大桃總體上施用有機肥比例較高。植物樣品中H、O穩(wěn)定同位素組成主要受其水源的H、O穩(wěn)定同位素組成的影響，全球水同位素監(jiān)測數據顯示，大氣降水的δ2H和δ18O值隨著海拔的增加而減小，地表水和地下水也呈相同的分布規(guī)律[19]。 桃樹的水源主要來源大氣降水和地下水灌溉，研究發(fā)現樂亭縣大桃產區(qū)（海拔1～15 m）的δ2H值顯著高于平谷（海拔20～1234 m）和順平（海拔33～1 006.7 m）地區(qū)。樂亭縣大桃產區(qū)δ18O 值顯著高于順平地區(qū) （P＜0.05），但與永清地區(qū)差異不顯著（P＞0.05），可能是由于樂亭所處地勢相對較低，加之臨近海洋，因此δ2H值和δ18O值處在相對較高的水平，與大氣降水的氫氧同位素分布特征相吻合（圖1），而永清縣海拔也較低，因此差異不明顯。

圖 1 4 個大桃產地C、N、H、O穩(wěn)定同位素比值箱線圖Fig. 1 Box-plots of stable carbon, nitrogen, hydrogen and oxygen isotope ratios in peaches from four producing areas

2.2 大桃稀土元素含量差異分析

如表2所示，根據實驗測定結果，鮮桃肉中Ce、La、Y、Nd 4 種輕稀土元素在果肉中分布較其他稀土元素較為豐富，桃果中輕稀土元素富集、重稀土元素虧缺的特征，與曾江萍等[20]的研究結論一致。利用ANOVA單因素方差分析比較不同產地稀土元素含量差異顯著性，結果表明：除Ce和Er外，順平縣15 種稀土元素與樂亭縣的稀土元素含量無顯著差異（P＞0.05）。平谷區(qū)與永清縣相比，Ce、Eu、Gd稀土元素具有顯著差異（P＜0.05），其余稀土元素的含量均無顯著性差異（P＞0.05）。

表 2 大桃果實中16 種稀土元素含量分布情況Table 2 Distribution profiles of 16 rare earth elements in peaches

2.3 基于Fisher判別分析的大桃產地區(qū)分模型

基于Fisher判別函數的一般判別方法對大桃樣品進行多變量判別分析，以4 種穩(wěn)定同位素指標（δ13C、δ15N、δ2H和δ18O）和8 種地域分布差異較為明顯的稀土元素指標（Y、Ce、Eu、Sm、Pr、Nd、Gd和Er）作為判別分析的自變量，建立大桃產地的判別模型，如下：

提取模型前3 個典型判別函數，Wilks’ Lambda檢驗結果進一步證實，在α＝0.05的顯著性水平下，3 個函數對分類效果均為顯著，表明判別模型擬合率可接受，其中判別函數1和判別函數2累計解釋判別模型能力為94.7%，且相關系數均大于0.9，表明判別函數1和判別函數2對4 個大桃產地分類占主要貢獻作用，利用判別函 數1和判別函數2的得分值作散點圖。由圖2可知，順平大桃能明顯與其他產地的桃區(qū)分開來，這也與順平縣有山區(qū)和內陸特殊的氣候環(huán)境和土壤條件，尤其是順平縣與其他產區(qū)的空間距離較遠，因此利用穩(wěn)定同位素和稀土元素相對容易區(qū)分；從圖2可以看出，平谷、永清和樂亭大桃的組重心距離比較接近。永清大桃與平谷和樂亭的樣本均出現重疊現象。

圖 2 不同產地大桃前2 個典型判別函數得分散點圖Fig. 2 Scattering points of the first two typical discriminant functions for peaches from different geographical origins

利用所建立的判別模型對4 個產地的大桃樣品進行歸類，并結合留一交叉檢驗法對所建模型的有效性進行驗證。由表3可知，不同產地大桃樣本的回代檢驗的整體正確判別率達97.8%?；卮鷻z驗是針對所有訓練樣本進行的檢驗，因此樣本的錯判率是相應總體率的偏低估計，而留一交叉檢驗比較真實地體現了模型的判別能力，本研究建立的判別模型交叉檢驗的整體正確判別率為95.7%。順平大桃和樂亭大桃的判別效果最佳，回代和交叉檢驗的正確判別率均為100%，平谷大桃的交叉檢驗中有1 個樣品被誤判為樂亭桃；永清桃的交叉檢驗中分別各有1 個和2 個樣品被誤判為樂亭桃和平谷桃。

表 3 不同產地大桃的一般判別分析結果Table 3 General discriminant analysis of peaches from different geographical origins

3 討 論

由于不同元素的同位素豐度受環(huán)境和生物代謝類型影響程度不同，因此各元素的溯源能力不同。前人研究發(fā)現，C同位素組成首先取決于植物光合途徑（C3、C4、CAM），并受氣候環(huán)境因子（溫濕度、降雨）與自身生理因素（氣孔導度、胞間CO2濃度）相互作用的影響[21]；N同位素組成則主要與植物固氮類型和生長時所用的肥料類型有關[22]，化學合成氮肥中的氮素直接來源于空氣中的N2，工業(yè)生產過程中氮穩(wěn)定同位素基本不發(fā)生分餾，氮肥的δ15N在-2‰～2‰之間，而有機肥（如堆肥、糞肥和魚粉等）等有機物質由于本身原料中的δ15N值較高，加之在堆沃、發(fā)酵等生產過程中更加富集15N，因此δ15N值相對較高，其中動物糞便肥一般在3.5‰～16.2‰之間[23-24]。 H、O同位素組成則體現了降雨、地表水、地下水等各種水源的混合水分穩(wěn)定同位素組成特征及其對應的氣候環(huán)境條件[21]。本研究涉及的4 個產地大桃判別指標中，N同位素的判別能力顯著高于C、H、O同位素，尤其是平谷區(qū)桃的15N水平明顯比其他3 個產地富集，表明在小空間尺度下的桃樣本，種植因素的地區(qū)差異要比氣候環(huán)境因素明顯。C、H、O同位素組成均受氣候因子的影響，但對于本研究涉及的小空間尺度樣本，僅樂亭縣的H、O同位素組成與其他3 個產地有較為明顯的差異，可能是由于樂亭縣的濱海氣候類型有關；由于大氣降水的大陸效應，從海岸到內陸，δ2H和δ18O值逐漸下降[25]，因此這可能是導致樂亭縣桃的2H和18O同位素較為富集的原因，進一步的研究需要對水源樣品進行采集分析，以明確果實中H、O同位素的地域分布原因和各種水源對果實氫氧同位素組成的貢獻率。H、O同位素分布與農作物生長季節(jié)有關，因此樣本成熟季節(jié)的差異可能會影響產地區(qū)分效果，本研究采集的樣品涉及久保、綠化九等7～8月份不同成熟期的樣品，由于成熟時間不同而存在氣候差異，可能會導致同一產地樣本的同位素分餾差異，進而影響了判別的準確性。

作物中的稀土元素主要吸收于種植地的土壤，而土壤中稀土元素的種類和豐度具有地質特異性，因此理論上特定產地的農產品及制品中礦質元素具有指紋特性，國內外學者利用稀土元素對南瓜籽油[26]、茶葉[27-28]、 紫菜[29]、大米[30]進行了大空間尺度的產地溯源應用，并取得了較為理想的判別效果。而本研究所涉及產地的空間差異相對較小，4 個產地均為華北地區(qū)較典型的棕壤土或褐土，且均沒有稀土礦或毗鄰稀土礦區(qū)，因此4 個產地的16 種稀土元素含量未出現數量級的差異，但是同一個產地的大桃樣品稀土元素含量分布區(qū)間較寬，本研究測定稀土元素時所分析的樣品為水果勻漿樣，由于稀土金屬通常以離子形式存在而在果汁和固形物中均有分布，因此水果勻漿樣在稱取時的精密度要低于凍干的固體粉末樣品，這可能是導致同一產地的稀土元素含量變化較大的原因，進一步的研究需深入探討分析樣品部位對溯源指標值的影響。本研究將不同產地之間具有顯著差異特征的稀土元素結合穩(wěn)定同位素指紋特征進行多元素多指標的統(tǒng)計建模，實現了小空間尺度下大桃產地的有效判別。本研究建立的判別模型在進行留一交叉檢驗發(fā)現，永清桃的誤判率相對較高（達23.1%），其中7.7%被誤判為樂亭桃，15.4%被誤判為平谷桃，地域相近因素可能是永清桃誤判率相對較高的原因。而平谷大桃也有2.3%樣本被誤判為樂亭桃，被誤判樣本來自平谷區(qū)的低海拔區(qū)域。樣本數量是影響判別模型準確率的因素之一，本實驗的判別模型包含12 個變量，盡管樣本總量達到變量個數5 倍以上，但不同分類之間的樣本數量不均一（僅1 個產區(qū)的樣本量超過30 個），降低了模型的穩(wěn)健性?；诜€(wěn)定同位素和稀土元素指紋特征，對北京和河北地區(qū)大桃產地判別的準確率可達95.7%，因此本研究為小空間尺度的果品產地溯源提供了參考。為了實現對小空間尺度的桃產地進行100%的準確區(qū)分，建議應綜合考慮品種、季節(jié)、種植等因素進行多層次分析，且應結合更多的溯源指標（如其他礦物元素、有機成分、光譜特征等）進行統(tǒng)計建模，此外還需獲取足夠的有統(tǒng)計意義和代表性的樣本量，才能構建出穩(wěn)健、有效的產地判別模型。