郭玉倩 ，曾躍勤，吳 超，陸姜利，楊 藝，鄭 紅，梁 張

（1）昆明醫(yī)科大學實驗動物學部；2）分子臨床研究院；3）科技處，云南昆明 650500）

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是常見的原發(fā)性老年性神經(jīng)退行性疾病，是最常見的癡呆類型。臨床表現(xiàn)主要為進行性記憶力下降、認知功能障礙、行為異常和人格失常等。我國每年新增大約30 萬患者[1]。AD 患病率與年齡密切相關，年齡平均每增加6.1 歲，患病率升高1 倍；在85 歲以上老年人群中，AD 患病率可高達20%～30%。到2050 年，全球AD 患者將超過1 億[2]。AD 不僅給患者帶來巨大的痛苦，還給家庭和社會帶來了沉重的精神壓力和醫(yī)療、照料負擔。由于發(fā)病原因不明確和發(fā)病機制復雜性，目前AD 治療藥物均不能逆轉(zhuǎn)疾病進程[3]。因此，建立適宜的AD 動物模型有利于開展發(fā)病機制、藥物研發(fā)和機理研究[4]。筆者以樹鼩為研究對象，通過海馬內(nèi)注射Aβ25-35、皮下注射D-gal 和聯(lián)合給藥3 種方式建立AD 模型，旨在為AD 的研究提供理想的動物模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

24 只雄性樹鼩來源于昆明醫(yī)科大學實驗動物學部，許可證：SCXK（滇）2015-0002）；實驗樹鼩飼料、飼養(yǎng)籠均由昆明醫(yī)科大學實驗動物學部提供，動物自由飲水，單籠飼養(yǎng)。飼養(yǎng)室溫度（22±2）℃，相對濕度50%～60%。

1.2 主要儀器

腦立體定位儀（成都儀器廠），水迷宮行為測試系統(tǒng)（成都泰盟公司），組織切片機、烤片機、包埋機（德國leica 公司），顯微鏡（日本尼康公司），恒溫培養(yǎng)箱、冰箱（美國Thermo），粘附載玻片（福州邁新公司）。

1.3 主要試劑

Beta 淀粉樣蛋白25-35、D-半乳糖（Sigma公司），兔抗鼠Aβ1-42一抗（Abcam 公司），PBS磷酸緩沖液（Solarbio 公司），檸檬酸鈉、多聚甲醛、快捷型山羊抗兔/小鼠IgG（福州邁新公司），中性樹膠（南京建成公司）。

1.4 方法

1.4.1 Aβ25-35 的孵育參照Zheng 等[5]方法，用生理鹽水將Aβ25-35（5 mg/mL）配制成溶液，放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育7 d，用于樹鼩海馬注射。

1.4.2 動物分組及處理24 只雄性樹鼩，體重135～145 g，隨機分為對照組（CT），D-半乳糖組（D），Aβ 組（A），D-半乳糖聯(lián)合Aβ25-35（D+A）組。用3%戊巴比妥（30 mg/kg）腹腔注射麻醉樹鼩。Aβ25-35在立體定儀下向A 組和D+A 組海馬中1 次性注射4 μL 的Aβ25-35（5 mg/mL）；CT 和D 組注射等量生理鹽水，術后所有樹鼩肌肉注射青霉素[22 000 U/(kg·d)]連續(xù)3 d，預防感染。向D 組和D+A 組皮下注射D-半乳糖[125 mg/(kg·d)]，對照組和Aβ25-35組給予等量生理鹽水，連續(xù)8 周。

1.4.3 Morris 水迷宮檢測（MWM）在第9 周進行，每天早上9:00 點開始測試。泳池直徑1.6 m，水溫（21±1）℃。第1 天為搜索平臺的適應訓練，水迷宮設置為可見平臺，將樹鼩面朝向池壁，距水面高度10 cm 放下，30 s 后若樹鼩沒有找到平臺，將其引導上平臺。在平臺停留10 s 后，把樹鼩取出、充分擦干身體。第2～6 天進行定位巡航實驗，設置為距水面下1 cm 的隱藏平臺，實驗操作同第1 天，記錄樹鼩找到平臺的時間，如30 s 未找到平臺，逃避潛伏期記為30 s。第7 天進行空間搜索實驗，撤去平臺，記錄樹鼩通過原平臺位置的次數(shù)、運動軌跡。

1.4.4 免疫組化檢測水迷宮實驗結(jié)束后，心臟采血處死樹鼩，生理鹽水和多聚甲醛灌注固定樹鼩腦組織，取大腦制成5 μm 石蠟切片，經(jīng)脫蠟、檸檬酸鈉修復、封閉、兔抗鼠Aβ1-42一抗孵育、二抗孵育、DAP 顯色、蘇木素染色、乙醇梯度脫水、二甲苯透明后，封片。顯微鏡下觀察大腦皮層和海馬細胞形態(tài)和Aβ1-42的表達。

1.5 統(tǒng)計學處理

實驗結(jié)果得到的數(shù)據(jù)均采用SPSS 進行處理分析，樹鼩腦片免疫組化染色結(jié)果采用image J 進行定量，所有數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差表示，組間比較使用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 樹鼩Morris 水迷宮

定位巡航實驗中，從第4 天至第6 天，D-半乳糖組、Aβ25-35組和D-半乳糖聯(lián)合Aβ25-35（D+A）組逃避潛伏期延長，與對照組（P＜0.01；圖1a）具有差異極顯著性；在第6 天，D+A 組（P＜0.05；圖1A）逃避潛伏期顯著長于D-半乳糖組、Aβ25-35組。在空間搜索實驗中，結(jié)果顯示相對于對照組相比（P＜0.05；圖1A），D、A 和D+A組穿越平臺次數(shù)均顯著性降低；D+A 組（P＜0.05；圖1A）穿越平臺次數(shù)顯著低于單因素誘導的D-半乳糖組和Aβ25-35組。

2.2 樹鼩海馬與皮層中Aβ1-42 的表達

免疫組化結(jié)果顯示，在樹鼩海馬中，對照組神經(jīng)元形態(tài)完整，胞質(zhì)和細胞核結(jié)構(gòu)清晰，細胞排列緊密。D 組、A 組和D+A 組細胞排列相對松散、核固縮，胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)不同程度棕色。對陽性面積定量分析顯示，D 組、A 組和D+A 組顯著高于對照組（P＜0.05；圖1B，Hip），而D+A 組Aβ1-42的表達最多，顯著高于D 組和A 組。樹鼩的大腦皮層中也有類似的結(jié)果，3 個處理組細胞固縮明顯，胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)不同程度棕色。定量分析顯示，D 組、A 組和D+A 組顯著高于對照組（P＜0.05；圖1B，Cor），而D+A 組（P＜0.05）Aβ1-42的表達顯著高于D 組和A 組。

圖1 樹鼩不同處理水迷宮實驗和大腦Aβ1-42表達分布情況（n=6）Fig.1 Morris water maze and Aβ1-42IHC（n=6）

3 討論

為了探究AD 的機制和潛在治療藥物，建立合適的動物模型是關鍵的一步。理想的AD 動物模型將為解決藥物靶點不明、臨床前后藥效學不一致等問題提供有力工具[6]。大小鼠等嚙齒類動物是最常用的AD 模型，因其繁殖力強、利于大規(guī)模飼養(yǎng)、成本低和易于操作等優(yōu)點廣泛用于AD 動物模型研究。但由于與人類親緣關系較遠，僅能模擬部分病理學特征[7]。其他的動物模型，如犬和果蠅等也有局限性[8]。目前靈長類動物被廣泛認為是最合適的AD 動物模型，但由于價格昂貴，飼養(yǎng)的經(jīng)濟和空間成本高、實驗周期長等缺點，尚難以廣泛應用。因此具有類似靈長類動物特征同時體型較小的動物是理想的AD 候選動物模型。通過全基因組測序和分子基礎研究證實，攀鼩目動物樹鼩為靈長目的近親[9]，具有較大的腦重比和復雜的行為特征，適合應用于神經(jīng)退行性疾病研究[10-11]。與非人靈長類動物相比，樹鼩體型小，成年體重平均150 g 左右，飼養(yǎng)的空間和經(jīng)濟成本低，繁殖周期短[12]。有研究已經(jīng)證實，通過將孵育的Aβ1-40注射到大腦，引起樹鼩認知功能障礙[13]并且臨床治療藥物多奈哌齊可緩解樹鼩癥狀[5]。D-半乳糖是一種動物體內(nèi)的還原糖，皮下注射可以模擬自然衰老過程并誘導行為改變[14]，同時還可促進認知功能障礙、神經(jīng)元損傷、線粒體功能喪失和膽堿能系統(tǒng)異常[15-16]。但尚未見復合因素誘導樹鼩AD 模型的報道。

AD 動物模型包括單因素誘導和復合因素誘導。復合因素AD 動物模型是使用2 種或者2 種以上的因子聯(lián)合作用，以更全面地模擬AD 的病理改變。AD 復合模型的構(gòu)建通常使用2 種誘導方法，一種為短暫性、局部性的誘導因子，常采用腦內(nèi)注射Aβ[17]、鏈脲霉素等；另一種誘導方式通常為相對長期性、機體整體性的作用，與AD 時程長、病情嚴重的特點相符合，例如D-半乳糖注射衰老模型、高膽固醇飲食模型、丙烯醛誘導模型、金屬離子紊亂模型[18]。AD 復合模型的優(yōu)點是能研究多種因素在AD 發(fā)展中的作用以及因素間的相互作用關系。Morimoto 等[19]在大鼠腦內(nèi)注射β 淀粉樣蛋白25-35 或1-40 片段聯(lián)合鵝膏蕈氨酸，觀察到海馬區(qū)神經(jīng)元大量丟失和Aβ 沉積，膠質(zhì)細胞活化。Laurent 等[20]用β 淀粉樣蛋白聯(lián)合2 價鐵離子導致氧化應激反應，淀粉樣蛋白沉積和神經(jīng)細胞凋亡增加、記憶能力降低。

在AD 病理學中，認知功能障礙是典型的行為學變化[21-22]。腦內(nèi)Aβ1-42是構(gòu)成老年斑的核心病理學分子[23-24]。本實驗以雄性樹鼩為研究對象，通過海馬內(nèi)注射Aβ25-35、皮下注射D-gal 和聯(lián)合給藥三種方式，發(fā)現(xiàn)D-半乳糖、Aβ25-35和D+A 組樹鼩均出現(xiàn)認知功能損傷，觀察到大腦皮層和海馬中Aβ1-42蛋白的表達增加。表明D-半乳糖、Aβ25-35單獨和聯(lián)合作用均能誘導樹鼩AD 樣病理改變。相對于單因子誘導，D-半乳糖和Aβ25-35復合因素誘導，樹鼩認知障礙和分子病理學特征更顯著，是更為合適的樹鼩AD 造模方式，本實驗進一步優(yōu)化和豐富了樹鼩AD 模型。