肖 非， 曹二龍， 龍南彪， 曾賽麗

(1邵陽學院醫(yī)學檢驗學院， 湖南 邵陽 422000； 2南華大學附屬第二醫(yī)院呼吸內科， 湖南 衡陽 421001)

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae，KP)是一種革蘭陰性致病菌，是引起醫(yī)院獲得性感染的主要病原體之一。KP能夠在不同的環(huán)境中存活，并定植于人體各個部位引起包括重癥肺炎、尿路感染、敗血癥以及傷口感染等在內的多種感染性疾病[1]。近年來，抗生素的使用不當以及KP持續(xù)接觸不同抗菌藥物，使得其產(chǎn)生了多種抗生素的耐藥菌株[2]。臨床研究顯示，由多重耐藥KP菌株引起的感染其死亡率在危重病人和器官移植的患者中高達40%以上[3]。多重耐藥KP菌株的臨床危害較大，但是目前并沒有有效的治療方案,因此，明確KP的致病以及耐藥機制，對于有效預防、治療KP感染至關重要。

表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)是一個170 kD的跨膜糖蛋白受體酪氨酸激酶，由表皮生長因子激活并調控細胞的生長和分化。EGFR的活化能夠參與氣道上皮細胞的修復和再生，同時其還與促炎細胞因子和趨化因子的分泌密切相關[4-5]。研究表明，呼吸道感染引起的炎性病變主要受細胞外信號調節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)和核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)信號通路的調節(jié)，而EGFR則是其中一種重要的受體。盡管已有研究顯示多種細菌或病毒病原體感染均能夠激活EGFR[6-7]，但其在KP感染引起炎性反應中的作用機制尚不清楚。因此，本研究探討了EGFR在KP莢膜多糖(capsular polysaccharide，CPS)誘導人正常支氣管上皮細胞產(chǎn)生炎癥反應中的作用，并進一步明確了EGFR與ERK、NF-κB信號通路的關系。

材 料 和 方 法

1 菌株與細胞株

肺炎克雷伯菌(13883)購自ATCC；人正常支氣管上皮細胞BEAS-2B購自中科院細胞庫。

2 主要實驗材料

抗EGFR、p-EGFR、ERK、p-ERK和p65抗體購自Abcam；EGFR抑制劑AG1478、ERK抑制劑PD98059和NF-κB抑制劑PDTC購自Sigma；人腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)和白細胞介素8(interleukin-8, IL-8)ELISA Kit購自Invitrogen；細胞培養(yǎng)試劑購自上海生物工程股份有限公司。

3 主要方法

3.1肺炎克雷伯菌的培養(yǎng)與莢膜多糖提取 肺炎克雷伯菌于含100 mg/L氨芐青霉素或50 mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)。按照參考文獻提供的方法提取CPS[8]：100 ℃加熱含KP的培養(yǎng)基以釋放其莢膜成分。隨后加入丙酮沉淀CPS。經(jīng)RNase B(30 mg/L)、DNase I(70 mg/L)及鏈霉蛋白酶溶液(含10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，1 mmol/L CaCl2)消化后對樣品透析、凍干。隨后于TSK HW-65F柱上進一步純化并采用苯酚-濃硫酸法測定CPS的濃度。刺激細胞前采用2-酮基-3-脫氧辛酸-硫代巴比妥酸法測定CPS中脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)的含量以排除LPS污染。

3.2細胞培養(yǎng)與處理 BEAS-2B細胞中加入含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基(含1 %的青霉素-鏈霉素混合液)，并于37 ℃、5 % CO2的條件下培養(yǎng)。待細胞生長至對數(shù)期時，用胰蛋白酶消化細胞并進行細胞傳代。將細胞按相應比例稀釋后置于新的細胞瓶中，進行如下處理：(1)分別用濃度為1、5和10 mg/L的CPS刺激細胞12 h后收集細胞及上清待用;(2)10和30 μmol/L的EGFR抑制劑AG1478處理2 h后，10 mg/L CPS刺激細胞12 h，收集細胞及上清待用;(3)10和30 μmol/L的ERK抑制劑PD98059或NF-κB抑制劑PDTC預處理2 h后，再用10 mg/L CPS刺激細胞12 h，收集細胞上清待用。

3.3Western blot檢測蛋白磷酸化 將上述細胞通過超聲破碎儀收集細胞總蛋白。BCA法測定蛋白濃度后，通過稀釋使各樣本濃度保持一致。隨后按照說明書要求進行SDS-PAGE。電泳完成后根據(jù)不同條件進行轉膜，轉膜完成后取出PVDF膜于封閉液中室溫封閉2 h。隨后加入稀釋好的I抗[抗EGFR抗體(1∶1 000)、抗p-EGFR抗體(1∶1 000)、抗ERK抗體(1∶2 000)和抗p-ERK抗體(1∶2 000)]4 ℃孵育過夜。再用相應的IgG II 抗室溫孵育2 h。最后進行ECL顯影。

3.4ELISA測定TNF-α和IL-8的分泌 收集不同處理條件下的細胞上清，嚴格按照人TNF-α和IL-8 ELISA Kit說明書要求檢測細胞上清中TNF-α和IL-8含量，并在酶標儀450 nm處測定各組樣本的吸光度(A)值。每組實驗重復3次。最后通過標準品檢測制備的標準曲線計算各細胞上清中TNF-α和IL-8水平。

3.5間接免疫熒光檢測p65核轉位 BEAS-2B細胞經(jīng)CPS處理后，在細胞中加入3.5%的多聚甲醛固定10～15 min；孵育完成后加入0.3%的Triton X-100，室溫孵育20 min；隨后用PBS洗滌細胞3次，加入稀釋的抗p65抗體(1∶200)后4℃孵育過夜；PBS洗3遍后再加入稀釋的IgG II抗(1∶400)避光孵育1.5 h；最后熒光顯微鏡下觀察NF-κB p65的核轉位情況。

4 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 16.0進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，各組間比較采用單因素方差分析及SNK-q檢驗。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 肺炎克雷伯菌CPS誘導支氣管上皮細胞分泌TNF-α和IL-8

未經(jīng)處理的BEAS-2B細胞上清中TNF-α和IL-8分泌水平較低,而當給予10 mg/L CPS刺激12 h后，TNF-α和IL-8分泌水平明顯增多(P<0.05),見圖1。

Figure 1.The effect ofKlebsiellapneumoniaeCPS on secretion of TNF-α and IL-8 in bronchial epithelial BEAS-2B cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group (0 mg/L).

圖1 肺炎克雷伯菌CPS對支氣管上皮BEAS-2B細胞分泌TNF-α和IL-8的影響

2 肺炎克雷伯菌CPS激活支氣管上皮細胞EGFR

未經(jīng)處理的BEAS-2B細胞中EGFR磷酸化水平較低，當用10 mg/L CPS刺激細胞30 min后，可明顯檢測到EGFR磷酸化，且磷酸化水平可持續(xù)至120 min，見圖2A。此外，分別用10和30 μmol/L EGFR抑制劑AG1478預處理2 h后再用CPS刺激細胞，細胞上清中TNF-α和IL-8的分泌水平明顯減少(P<0.05),見圖2B。

Figure 2.The effect ofKlebsiellapneumoniaeCPS on the activation of EGFR in bronchial epithelial BEAS-2B cells. A: EGFR phosphorylation was detected by Western blot; B: EGFR inhibitor AG1478 inhibited the secretion of TNF-α and IL-8. Mean±SD.n=3.△P<0.05vs0 min group;*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsCPS group.

圖2 肺炎克雷伯菌CPS對支氣管上皮BEAS-2B細胞EGFR活化的影響

3 肺炎克雷伯菌CPS經(jīng)EGFR激活ERK通路誘導支氣管上皮細胞分泌TNF-α和IL-8

10 mg/L CPS刺激30 min～2 h均可明顯誘導ERK磷酸化,而30 μmol/L AG1478預處理2 h后，ERK磷酸化則明顯降低(P<0.05),見圖3A。此外，ELISA結果顯示，在給予10和30 μmol/L ERK抑制劑PD98059預處理后，細胞上清中TNF-α和IL-8分泌水平均明顯減少(P<0.05),見圖3B。

4 肺炎克雷伯菌CPS經(jīng)EGFR激活NF-κB通路誘導支氣管上皮細胞分泌TNF-α和IL-8

BEAS-2B細胞經(jīng)10 mg/L CPS孵育1 h后，細胞核內p65水平明顯增多，并可持續(xù)到4 h,而用EGFR抑制劑AG1478預處理2 h后，細胞核內p65水平則出現(xiàn)明顯降低,見圖4A。此外，當給予10和30 μmol/L NF-κB抑制劑PDTC預處理后，細胞上清中的TNF-α和IL-8分泌水平也明顯減少(P<0.05)，見圖4B。

Figure 3.The effect of ERK pathway on the secretion of TNF-α and IL-8 in bronchial epithelial BEAS-2B cells induced byKlebsiellapneumoniaeCPS. A: the phosphorylation level of ERK was determined by Western blot; B: ERK inhibitor PD98059 inhibited the secretion of TNF-α and IL-8. Mean±SD.n=3.△P<0.05vs0 h group;▲P<0.05vs120 min group;*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsCPS group.

圖3 ERK通路對肺炎克雷伯菌CPS誘導支氣管上皮BEAS-2B細胞分泌TNF-α和IL-8的影響

討 論

國內外流行病學調查結果顯示，由于各類抗菌藥物使用不當，KP藥物耐藥性不斷增加并出現(xiàn)了多重耐藥菌株，臨床治療十分困難。盡管聯(lián)合治療包括粘菌素、磷霉素、替加環(huán)素以及氨基糖苷類藥物在過去幾年得到了廣泛應用，但其治療效果并不理想[9]。因此，明確其致病機制進而有效預防、治療KP感染是目前的當務之急。本研究通過明確EGFR在KP CPS誘導支氣管上皮細胞炎癥反應中的作用，為臨床KP的防治提供了理論依據(jù)。

Figure 4.The effect of NF-κB pathway on the secretion of TNF-α and IL-8 in bronchial epithelial BEAS-2B cells induced byKlebsiellapneumoniaeCPS. A: NF-κB p65 expression was detected by indirect immunofluorescence; B: NF-κB inhibitor PDTC inhibited the secretion of TNF-α and IL-8. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsCPS group.

圖4 NF-κB通路對肺炎克雷伯菌CPS誘導支氣管上皮BEAS-2B細胞分泌TNF-α和IL-8的影響

EGFR是一種重要信號通路受體，在調控細胞存活以及炎性反應方面具有重要作用[10]。研究表明，EGFR可以通過交叉關聯(lián)的信號通路被激活，其中就包括了Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)[11],而由于TLRs在上皮細胞中表達，可識別各種細菌、病毒和真菌的致病相關分子模式[12]，因此EGFR與上皮細胞的炎癥反應也存在一定聯(lián)系。Beswick等[13]研究表明，在幽門螺桿菌感染的胃上皮細胞中，巨噬細胞遷移抑制因子和IL-8可誘導EGFR的磷酸化。此外，卡他莫拉菌同樣可以在支氣管上皮細胞中通過活化EGFR刺激產(chǎn)生IL-8[14]。本研中用10 mg/L KP CPS刺激支氣管上皮細胞后，可在細胞內檢測到明顯的EGFR磷酸化，且在抑制EGFR表達后細胞上清中的炎性因子分泌水平顯著降低，提示EGFR同樣能夠參與KP對支氣管上皮細胞的致炎作用。

ERK是MAPK家族中的重要成員，它能夠參與調控多種關鍵的細胞活動，包括細胞的凋亡與增殖[15]。EGFR被認為是ERK的主要激活因子，EGFR/ERK信號通路能夠參與多種細胞先天免疫反應[16]。有研究表明，ERK異常激活將會導致呼吸道上皮的異常病變，主要包括黏液的過度分泌、細胞因子過表達以及炎癥等[17]。本研究通過檢測細胞中ERK的磷酸化水平發(fā)現(xiàn)，EGFR抑制劑預處理后細胞內的ERK磷酸化明顯降低，而ERK抑制劑也能夠顯著減少細胞中TNF-α和IL-8的表達水平，充分說明EGFR能夠激活ERK通路，并參與KP CPS誘導的炎癥反應。

NF-κB信號通路在調節(jié)TNF-α和白細胞介素等多種促炎介質方面具有重要作用[18]。研究表明，在卡他莫拉菌引起的呼吸道上皮細胞炎癥反應中，其可通過EGFR激活NF-κB信號通路促進IL-8的分泌[14]。為了分析NF-κB通路是否也參與了KP CPS誘導的炎癥反應，本研究又檢測了細胞中p65的磷酸化水平，結果發(fā)現(xiàn)使用EGFR抑制劑后細胞內p65磷酸化水平顯著減少，而進一步使用NF-κB抑制劑也能夠有效抑制細胞中TNF-α和IL-8的分泌，提示NF-κB也可通過EGFR參與KP CPS誘導的炎癥反應。