胡柳 吳妍 韓銓

[摘要]目的 比較兩種不同慢性心肌缺血造模方式之間的差異及優(yōu)劣情況。方法 選取雄性ICR小鼠30只，根據(jù)造模方式的不同分為皮下注射組、緩釋泵釋放組、正常對(duì)照組，每組各10只。皮下注射組于小鼠腰背部皮下注射異丙腎上腺素（ISO）30 mg/（kg·d），連續(xù)注射14 d;緩釋泵釋放組于小鼠腰背部皮下埋入微量緩釋泵，ISO釋放量30 mg/（kg·d）;正常對(duì)照組小鼠皮下注射等劑量生理鹽水。采用心肌酶譜、心臟切片TTC染色等指標(biāo)衡量小鼠的心肌缺血程度。結(jié)果 皮下注射組與緩釋泵釋放組小鼠的造模死亡率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;皮下注射組與緩釋泵釋放組小鼠的心臟心肌肥大指數(shù)高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;皮下注射組與緩釋泵釋放組小鼠的心肌肥大指數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;緩釋泵釋放組小鼠的心肌缺血面積百分比高于皮下注射組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;緩釋泵釋放組小鼠的心肌酶譜各項(xiàng)指標(biāo)和肌鈣蛋白（cTnT）水平高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;皮下注射組小鼠的血清α-羥丁酸脫氧酶（α-HBDH）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）及同工酶（mAST）、cTnT水平均高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;皮下注射組小鼠的血清肌酸激酶（CK）及同工酶（CK-MB）、乳酸脫氧酶（LDH）水平與正常對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;緩釋泵釋放組與皮下注射組小鼠的心肌酶譜各項(xiàng)指標(biāo)及cTnT水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 皮下注射及緩釋泵釋放ISO兩種方式均可以造成小鼠心肌肥大，緩釋泵釋放則能更大程度上誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)心肌缺血，緩釋泵釋放同時(shí)在更大程度上造成了心肌功能的損傷。

[關(guān)鍵詞]慢性心肌缺血;異丙腎上腺素;緩釋泵;皮下注射;小鼠

[中圖分類號(hào)] R541? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1674-4721（2020）2（b）-0007-05

[Abstract] Objective To compare the differences and advantages between different methods of chronic myocardial ischemia. Methods Thirty male ICR mice were selected and divided into subcutaneous injection group， sustained-release pump release group and control group according to different modeling methods， with 10 rats in each group. In the subcutaneous group， Isoproterenol （ISO） 30 mg/（kg·d） was injected subcutaneously into the lumbar back of the mice for 14 days. The release pump group was placed subcutaneously in the lumbar back of the mice. The ISO release amount was 30 mg/（kg·d）. The control group was injected subcutaneously with an equal dose of physiological saline. Myocardial ischemia was measured by myocardial zymogram and heart section TTC staining. Results There was no significant difference in the mortality between the subcutaneous injection group and the sustained-release pump release group （P>0.05）. The cardiac hypertrophy index of the mice in the subcutaneous injection group and the sustained-release pump release group was higher than that in the normal control group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. There was no significant difference in the cardiac hypertrophy index between the subcutaneous injection group and the sustained-release pump release group （P>0.05）. The myocardial ischemic area of the mice in the sustained-release pump release group was higher than that of the subcutaneous injection group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The myocardial enzymes and cardiac troponin T （cTnT） level of the mice in the sustained-release pump release group were higher than those in the normal control group， and the differences were statistically significant （P<0.05）. The levels of α-hydroxybutyrate deoxygenase （α-HBDH）， aspartate aminotransferase （AST）， isozyme （mAST） and cTnT in the subcutaneous group were higher than those in the normal control group， and the differences were statistically significant （P<0.05）. While the levels of creatine kinase （CK） and isoenzyme （CK-MB） and lactate deoxygenase （LDH） in the subcutaneous group were not significantly different from those of the normal control group （P>0.05）. There was no significant difference in myocardial zymogram and cTnT between the sustained-release pump release group and the subcutaneous injection group （P>0.05）. Conclusion Both subcutaneous injection and sustained release pump release ISO can cause myocardial hypertrophy in mice， sustained release pump can induce myocardial ischemia in mice to a greater extent， and sustained release pump also causes damage to myocardial function to a greater extent.

[Key words] Chronic myocardial ischemia; Isoproterenol; Sustained release pump; Percutaneous injection; Mice

心血管疾病是我國(guó)導(dǎo)致居民死亡的第一病因，而且患病率仍將持續(xù)增加[1]，因此，研究心血管疾病的病因和發(fā)病機(jī)制對(duì)于提高人民的健康水平、延長(zhǎng)壽命具有重大意義[2]。心肌缺血（myocardial ischemia）是指由于心臟出現(xiàn)生理或病理性的血液灌注減少，從而導(dǎo)致心臟相應(yīng)的供氧減少，最終引起心肌能量代謝異常，不能維持心臟正常工作狀態(tài)的一種病理狀態(tài)。

心血管疾病的康復(fù)機(jī)制研究的關(guān)鍵技術(shù)之一是復(fù)制心肌缺血?jiǎng)游锬Ｐ?。建立適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型，不僅為該病的發(fā)病機(jī)制和病理生理改變提供重要的資料，更重要的是能夠促進(jìn)新藥的開發(fā)，推進(jìn)臨床診斷的各種治療方法的進(jìn)步。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，皮下注射大劑量異丙腎上腺素（Isoproterenol，ISO）會(huì)導(dǎo)致大小鼠急性心肌缺血損傷[3-7]，這種損傷與人的急性心肌缺血較為相似， 故可作為評(píng)價(jià)藥物抗心肌缺血的動(dòng)物模型[8]。ISO的作用機(jī)制為興奮β1受體，使心肌興奮性提高、收縮加快、心率加快、代謝旺盛，增加心肌耗氧量，從而造成心臟負(fù)荷過重，同時(shí)興奮β2受體，使外周血管擴(kuò)張，回心血量減少，動(dòng)脈壓降低，冠脈流量減少。

實(shí)驗(yàn)研究過程中，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型應(yīng)在滿足與疾病相似性、重復(fù)性、可靠性等前提下，盡可能模擬人類心肌缺血疾病的發(fā)生、發(fā)展?fàn)顟B(tài)，可以為探求心肌缺血疾病的病因、發(fā)病機(jī)制、臨床治療提供更好的研究基礎(chǔ)。目前，現(xiàn)有的心肌缺血的模型大致可以分為以下幾類：急性心肌缺血模型、慢性心肌缺血模型、可控性心肌缺血模型和離體心肌缺血模型。本研究的主要目的，是比較皮下注射和皮下緩釋泵釋放兩種給藥方式下，哪種慢性心肌缺血模型的造模方式更穩(wěn)定，小鼠存活率更高，心肌缺血狀態(tài)更明顯，從而為今后對(duì)于冠心病的研究提供可靠的動(dòng)物模型。

1對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物為ICR小鼠，共30只，雄性，18～22 g，SPF級(jí)，均購(gòu)于浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（浙）2019-0002。小鼠均自由攝食和飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周左右后，開始實(shí)驗(yàn)操作。

1.2主要儀器與試劑

1.2.1實(shí)驗(yàn)試劑

ISO注射液（上海禾豐制藥有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：6E20003，規(guī)格：0.5 mg/ml）;生理鹽水（江蘇長(zhǎng)江藥業(yè)有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)A20070002）;水合氯醛（中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司，生產(chǎn)批號(hào)：20120720）。

1.2.2實(shí)驗(yàn)儀器

微量緩釋泵（Alzet，model 1002），0.22 μm濾膜，1 ml注射器，剃毛刀，手術(shù)器械。

1.3實(shí)驗(yàn)分組及處理

1.3.1動(dòng)物分組

將30只雄性ICR小鼠隨機(jī)分為三組，每組各10只。正常對(duì)照組小鼠皮下注射生理鹽水，10 μl/g，連續(xù)注射14 d;皮下注射組小鼠皮下注射ISO，給藥量為30 mg/（kg·d）[9]，10 μl/g，連續(xù)注射14 d;緩釋泵釋放組小鼠皮下植入含有ISO的緩釋泵，給藥量為30 mg/（kg·d），6 μl/d，連續(xù)注射14 d，緩釋泵內(nèi)ISO濃度=小鼠重量×30 mg/（kg·d）×14 d/（1000×6 μl/d×14 d）。

1.3.2緩釋泵的制備

1.3.2.1配制ISO溶液? 使用劑量為30 mg/（kg·d），所用ISO溶液的濃度為100 mg/ml（預(yù)計(jì)小鼠重量為20 g）。①稱取200 mg ISO，加入2 ml的生理鹽水溶液，充分溶解;②0.22 μm濾膜過濾ISO溶液;③無菌條件下取出緩釋泵，放在干凈的紗布上，注意不要污染;④稱量記錄空泵重量，一般約為0.5 g，取出注射裝置，安裝上注射管，吸取約0.2 ml的ISO溶液，左手垂直手持緩釋泵，右手持注射管，垂直插到管底，緩慢推注射器，并緩慢上提注射器，直至有液體流出，擦拭掉流出的液體，并安裝上pump的頭部插件;⑤再次稱量記錄注入ISO后緩釋泵的重量，兩次相差應(yīng)該大于90 mg，否則吸出ISO再次灌注緩釋泵;⑥將緩釋泵置入無菌的0.9%生理鹽水中，37℃孵箱中過夜（>6 h）。

1.3.2.2緩釋泵的植入? ①配制4%水合氯醛，麻醉小鼠，以0.2 ml/20 g劑量進(jìn)行腹腔注射;②小鼠背部脫毛，酒精消毒后，于兩塊肩胛骨中間，與體軸呈90°剪開一個(gè)小口子，使用鑷子沿著口子在小鼠背部掏一個(gè)口袋，用來放緩釋泵;③將泵放入口袋中，縫合背部，并涂上青霉素鈉，將小鼠放在保溫墊上待完全蘇醒后，放回籠中。

1.4觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.4.1觀察指標(biāo)

在給藥14 d后，①摘取小鼠眼球，取全血和血清，比較三組小鼠心肌酶譜及肌鈣蛋白（cTnT）水平，心肌酶譜指標(biāo)包括α-羥丁酸脫氫酶（α-HBDH）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）及同工酶（mAST）、肌酸激酶（CK）及同工酶（CK-MB）、乳酸脫氧酶（LDH）;②測(cè)量小鼠的體重及心臟重量，并記錄，使用心肌肥大指數(shù)（HW/BW）作為衡量心臟肥大的指標(biāo)[10];③心臟組織切片進(jìn)行心肌缺血TTC染色;④統(tǒng)計(jì)小鼠死亡率。

1.4.2 TTC染色

小鼠處死后取心臟，刀片垂直心臟長(zhǎng)軸將其橫切為5～6片，每片約為2 mm。展平后置于1% TTC溶液中，37℃避光孵育20 min后置于10%中性甲醛（0.1 mol/L PBS配制）中。于染色后第1周對(duì)4個(gè)橫切片的正反兩面進(jìn)行圖像采集，照片采用Photoshop 3S Extended軟件計(jì)算心肌缺血面積。心肌缺血面積百分比（%）=心肌缺血面積/橫切片總面積×100%[11]。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1皮下注射組與緩釋泵釋放組小鼠造模死亡率的比較

給藥14 d后，皮下注射組小鼠存活8只，死亡2只，死亡率為20%;而緩釋泵釋放組小鼠存活10只，無死亡，死亡率為0%。皮下注射組與緩釋泵釋放組小鼠的造模死亡率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2.222，P=0.136）。

2.2三組小鼠心臟肥大及心肌缺血情況的比較

皮下注射組與緩釋泵釋放組小鼠的HW/BW高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;皮下注射組與緩釋泵釋放組小鼠的HW/BW比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;緩釋泵釋放組小鼠的心肌缺血面積百分比高于皮下注射組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（表1、圖1）。

2.3三組小鼠心肌酶譜及cTnT水平的比較

緩釋泵釋放組小鼠的血清α-HBDH、AST、mAST、CK及CK-MB、LDH水平均高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;皮下注射組小鼠的血清α-HBDH、AST、mAST水平高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;皮下注射組小鼠的血清CK、CK-MB、LDH水平與正常對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;皮下注射組與緩釋泵釋放組的心肌酶譜各項(xiàng)指標(biāo)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。緩釋泵釋放組與皮下注射組小鼠的cTnT水平均高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;皮下注射組與緩釋泵釋放組的cTnT水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表2）。

3討論

心血管疾病現(xiàn)如今已成為威脅人類生命健康的最主要的疾病之一，而心肌缺血性疾病又是在心血管疾病總發(fā)病率中占比較高的一類疾病。心血管疾病的相關(guān)基礎(chǔ)研究的難點(diǎn)之一就是建立合適可重復(fù)的心肌缺血?jiǎng)游锬Ｐ?。建立適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型，不僅能為該病的發(fā)病機(jī)制和病理生理改變的研究奠定基礎(chǔ)，更重要的是能推動(dòng)新藥的開發(fā)，促進(jìn)臨床診斷和各種治療方法的進(jìn)步。在已有文獻(xiàn)報(bào)道的心肌缺血模型中，動(dòng)物種類和造模方法較多，應(yīng)用不同動(dòng)物建立的心肌缺血模型具有不同特點(diǎn)，因此建議根據(jù)研究實(shí)驗(yàn)的要求選擇適當(dāng)?shù)膭?dòng)物和造模方法[12]。

ISO是一種非特異性β-腎上腺素受體激動(dòng)劑，在小鼠心肌缺血、心臟肥大等病理模型中應(yīng)用廣泛[6]。有文獻(xiàn)報(bào)道顯示，皮下注射大劑量ISO會(huì)導(dǎo)致大小鼠急性心肌缺血損傷[6-7]，這種損傷的病理變化與人的急性心肌缺血病理過程較為相似，因此可以應(yīng)用其來進(jìn)行心肌缺血?jiǎng)游锬Ｐ偷乃幮гu(píng)價(jià)。且有研究顯示，在小鼠腰背部皮下包埋微量緩釋泵，給予ISO劑量分別為0.3、3、30 mg/（kg·d），2周后均可以誘導(dǎo)出心肌缺血及心臟肥大[13]。另有學(xué)者報(bào)道稱，于小鼠背部皮下注射ISO 5 mg/（kg·d），持續(xù)1周[14]，或者腰背部皮下包埋微量緩釋泵，給予ISO 5 mg/（kg·d），持續(xù)2周[15]，也均可引起明顯的心臟肥大和心肌缺血癥狀。

在前期實(shí)驗(yàn)中，筆者已經(jīng)探索到腹腔注射ISO無法穩(wěn)定成模，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)中期即會(huì)呈現(xiàn)較高的死亡率。且相關(guān)研究顯示，小鼠皮下注射ISO有一定可能性會(huì)出現(xiàn)皮下硬結(jié)，呈現(xiàn)不同程度的發(fā)硬和黑痂，并且會(huì)隨著造模天數(shù)的增加，逐漸加重，最終可能影響藥物吸收，無法達(dá)到有效的造模劑量，導(dǎo)致造模失敗[16-18]。另一方面，雖然腹腔注射吸收快，但極有可能因?yàn)檠簝?nèi)藥物濃度迅速達(dá)到高峰，導(dǎo)致藥物單次劑量過大而造成實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡率增加[18-19]。因此，在本研究中，引入了ALzet微量緩釋泵，與皮下注射ISO的造模方法進(jìn)行比較。本研究結(jié)果顯示，采用腰部皮下包埋微量緩釋泵釋放ISO 30 mg/（kg·d）或腰背部皮下注射ISO 30 mg/（kg·d）2周均可以成功誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)顯著的心肌肥大和心肌缺血癥狀，這一結(jié)果與相關(guān)研究報(bào)道一致[13]。且微量緩釋泵造模得到的心肌缺血狀態(tài)更為嚴(yán)重。

心肌中通常存在多種心肌酶，其中包括AST、LDH及同功酶、α-HBDH和CK及CK-MB，通常將這一組與心肌損傷相關(guān)的酶合稱為心肌酶譜，對(duì)心肌梗死具有重要的診斷意義[20]。LDH、CK、AST及mAST在維持心肌正常生理功能方面發(fā)揮著重要的作用。存在于組織中的LDH其活力比存在于血清中的LDH高得多，所以當(dāng)出現(xiàn)組織壞死時(shí)，該酶即從組織中釋放入血，而使血清中的酶活力升高。在正常情況下，AST存在于組織細(xì)胞內(nèi)，其中心肌細(xì)胞中含量最高，血清中含量極少。當(dāng)心肌細(xì)胞由于缺血而受到損傷時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的AST釋放入血，使血清AST含量升高，臨床一般也將其視為心肌梗死的輔助檢查指標(biāo)[20]。當(dāng)心肌發(fā)生缺血或梗塞時(shí)，心肌受損，導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)的心肌酶釋放入血，血液中酶活性增高，進(jìn)一步造成心肌的損傷?！阏J(rèn)為，血清中AST、CK、LDH含量升高程度與心肌梗死程度成正相關(guān)，因此血清中LDH、AST、CK及其同工酶的活性可作為衡量心肌缺血程度的指標(biāo)[20]。

本研究結(jié)果顯示，緩釋泵釋放組小鼠的血清α-HBDH、AST、mAST、CK及CK-MB、LDH水平均高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;皮下注射組小鼠的血清α-HBDH、AST、mAST水平高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;皮下注射組小鼠的血清CK、CK-MB、LDH水平與正常對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。提示兩組均在一定程度上造成了心肌功能的損傷，而皮下注射組對(duì)于小鼠心肌功能的損傷程度低于緩釋泵釋放組。

cTnT作為心肌細(xì)胞所特有的一種調(diào)鈣蛋白，具有較高的心肌特異性，是反映心肌壞死的血清標(biāo)志物，對(duì)評(píng)價(jià)心肌細(xì)胞損傷同樣具有重要意義。cTnT 存在于心肌細(xì)胞的細(xì)肌絲中，是心肌肌鈣蛋白復(fù)合體中的一種多肽亞單位，具有高度的心肌特異性，當(dāng)缺血缺氧造成心肌細(xì)胞損傷時(shí)，細(xì)胞膜通透性增加，大量cTnT釋放入血，使血清中cTnT濃度迅速升高[20]。cTnT具有入血時(shí)間早、濃度高、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)等特點(diǎn)，對(duì)于不同程度的心肌缺血具有較高的靈敏度及特異性，在監(jiān)測(cè)心肌梗死的發(fā)展、治療及預(yù)后上具有重要意義。cTnT相比較于經(jīng)典的酶學(xué)指標(biāo)CK-MB具有更高的敏感性，并且診斷窗口期更寬，因此，近年來cTnT成為了心肌缺血早期和晚期診斷的重要實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。

本研究中使用的兩種造模方法具有不同的特點(diǎn)，皮下注射ISO相較于其他造模方法，不需要手術(shù)開腹、開胸，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物損傷小，死亡率低于腹腔注射的造模方法[21]; Alzet微量緩釋泵造價(jià)較高，且無法重復(fù)利用，應(yīng)用該方法單次實(shí)驗(yàn)成本會(huì)相應(yīng)提高。但微量緩釋泵給藥過程穩(wěn)定且只需一次操作，相較于一般的手術(shù)造模方法對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物傷害較小，人為操作失誤而引起的系統(tǒng)誤差小，小鼠存活率高，得到的心肌缺血模型穩(wěn)定且可重復(fù)。綜上所述，本研究認(rèn)為于ICR小鼠腰背部皮下包埋微量緩釋泵，給予ISO 30 mg/（kg·d）2周，可以建立穩(wěn)定顯著的心肌肥大和心肌缺血模型，該方法操作簡(jiǎn)單，且能保證實(shí)驗(yàn)動(dòng)物較高的存活率，但造價(jià)相對(duì)較高。為進(jìn)一步心血管疾病的研究提供了模型參考，值得推廣。

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（收稿日期：2019-07-25? 本文編輯：閆? 佩）