C的雜合錯義突變,導(dǎo)致第4位高度保守的色氨酸改變?yōu)榫彼幔╬.W4R),而家系內(nèi)正常成員及正常對照者中均未發(fā)現(xiàn)該突變。結(jié)論 GJA8基因c.1"/>

国产日韩欧美一区二区三区三州_亚洲少妇熟女av_久久久久亚洲av国产精品_波多野结衣网站一区二区_亚洲欧美色片在线91_国产亚洲精品精品国产优播av_日本一区二区三区波多野结衣 _久久国产av不卡

?

先天性白內(nèi)障一患病家系的突變基因篩查

2020-04-03 13:35王中英劉善賀鄭貴倩
中國當(dāng)代醫(yī)藥 2020年5期
關(guān)鍵詞:突變

王中英 劉善賀 鄭貴倩

[摘要]目的 對先天性藍點狀白內(nèi)障一患病家系進行致病基因突變篩查,以探索其潛在遺傳學(xué)缺陷。方法 2017年9月收集黑龍江省一個先天性藍點狀白內(nèi)障家系,對該家系及正常對照者進行詳細的病史采集及臨床相關(guān)檢查后,應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)測序法對其進行白內(nèi)障熱點候選基因的突變檢測。結(jié)果 在該家系患者的GJA8基因發(fā)現(xiàn)了c.10T>C的雜合錯義突變,導(dǎo)致第4位高度保守的色氨酸改變?yōu)榫彼幔╬.W4R),而家系內(nèi)正常成員及正常對照者中均未發(fā)現(xiàn)該突變。結(jié)論 GJA8基因c.10T>C點突變是該患病家系的潛在遺傳學(xué)病因,拓展了先天性白內(nèi)障GJA8基因突變譜。

[關(guān)鍵詞]先天性白內(nèi)障;GJA8基因;突變;縫隙連接蛋白

[中圖分類號] R776.1? ? ? ? ? [文獻標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721(2020)2(b)-0004-04

[Abstract] Objective To screen mutation in pathogenic genes in a family with congenital blue dot cataract, so as to explore their potential genetic defects. Methods A congenital blue dot cataract family in Heilongjiang province was collected in September 2017. After detailed medical history collection and clinical examination of this family and normal controls, polymerase chain reaction (PCR) sequencing was used to detect the mutation of candidate genes in cataract hot spots. Results The heterozygous missense mutation of c.10T>C was found in the GJA8 gene of this family, which resulted in the change of the highly conserved tryptophan in the fourth position to arginine (p.W4R), but the mutation was not found in the normal members of the family or the normal controls. Conclusion The GJA8 gene c.10T>C mutation is the potential genetic etiology of this family, which extends the GJA8 gene mutation spectrum of congenital cataract.

[Key words] Congenital cataract; GJA8 genes; Mutation; Connexin

先天性白內(nèi)障是一組由于晶狀體混濁且通常發(fā)生在出生時或兒童早期的疾病,是一種常見的視覺障礙性眼病,為全球兒童可治療性失明的首要原因[1-2],據(jù)報道,其發(fā)病率在發(fā)展中國家明顯高于發(fā)達國家,約為其10倍[3]。晶狀體可表現(xiàn)有多種不同的混濁類型,如板層狀、核性、粉塵狀、藍點狀、花冠狀、極性等[4]。據(jù)報道,約50%的先天性白內(nèi)障與遺傳因素有關(guān)[5],其主要有3種不同的遺傳方式:常染色體顯性遺傳(ADCC)、常染色體隱性遺傳(ARCC)及X連鎖隱性遺傳(XRCC),其中以ADCC最為常見。同時有研究證實,先天性白內(nèi)障具有明顯的遺傳異質(zhì)性[6]。直到今天,已有超過40多個致病候選位點(http://omim.org/phenotypicSeries/PS116200)、200多個突變(https://cat-map.wustl.edu/)被報道與先天性白內(nèi)障有關(guān)[7]。隨著高通量測序技術(shù)的迅猛發(fā)展,越來越多的基因及突變位點被鑒定出與先天性白內(nèi)障的發(fā)生相關(guān),然而在這些突變位點中,大約50%位于編碼晶狀體蛋白的基因:CRYAA、CRYBA1/A3、CRYAB、CRYBA4、CRYBB1、CRYBB2、CRYGC、CRYGD和CRYGS[8],1/4的突變來自于編碼晶狀體膜蛋白的基因GJA3和GJA8[9]。因而,這些基因被認為是先天性白內(nèi)障的熱點致病基因。本研究對1例先天性藍點狀白內(nèi)障中國家系進行熱點致病基因突變的進行篩查研究,現(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

2017年9月收集黑龍江省一個先天性藍點狀白內(nèi)障家系,包括先證者、其家系內(nèi)其他2例已診斷明確的患者和2名與之有血緣關(guān)系的家系中正常成員。本研究首先對其進行全面的體格檢查,排除其他眼部疾病及對其可能有影響的系統(tǒng)疾病。同時,從牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院眼科門診患者中隨機選取50份無白內(nèi)障的正常人外周血進行對照。所有實驗對象均采集外周靜脈血5 ml置于EDTA抗凝管中。本研究遵循《赫爾辛基宣言》,所有家系成員及對照者均知情同意。

1.2方法

1.2.1提取基因組DNA? 使用血液DNA提取試劑盒(TIANamp Blood DNA Kit,Tiangen Biltech)進行提取和純化所有外周靜脈血基因組DNA;使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計來檢測樣本DNA純度及其濃度后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2設(shè)計候選基因特異性引物? 依據(jù)已報道的先天性白內(nèi)障突變基因的篩查情況,本研究選取以往研究關(guān)注的熱點致病基因及設(shè)計的引物序列[10],所設(shè)計的引物覆蓋熱點基因的全部外顯子區(qū)。

1.2.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)測序分析? 按SYBRR Green PCR Master Mix(TakaRa生物工程公司提供)試劑盒制備實時定量PCR的反應(yīng)體系,將合格有效的產(chǎn)物送到上海英駿生物技術(shù)有限公司進行純化及DNA序列測定。測序結(jié)果使用在線blast軟件進行分析,與美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)數(shù)據(jù)庫發(fā)布的基因堿基序列(參考基因組:NG_016242.1;轉(zhuǎn)錄本mRNA序列版本號NM_005267.4)進行比對,以尋找堿基序列的改變。并查閱篩查GJA8,c.10T>C在ESP等各大數(shù)據(jù)庫中的頻率信息以排除多態(tài)位點。每個樣本重復(fù)并正反向測序3遍,如發(fā)現(xiàn)有堿基序列的改變并排除了該堿基是單核苷酸多態(tài)性的可能后,再將該位點與其余全部成員進行對比,以確定該堿基序列的改變在該家系中是否與該疾病是共分離的。

1.2.4突變生物功能預(yù)測? 利用PolyPhen生物信息學(xué)軟件(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph/)對氨基酸的改變對蛋白質(zhì)功能及空間構(gòu)象的影響進行預(yù)測。利用Misc Protein Analysis軟件(https://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_www.cgi?rm=misc1)對突變氨基酸的二級結(jié)構(gòu)和疏水性改變進行預(yù)測。利用NCBI-Protein https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/?term=GJA8獲得不同物種GJA8的氨基酸序列,采用MegAlign軟件進行不同物種的保守性分析。

2結(jié)果

2.1該家系的臨床表現(xiàn)

先天性白內(nèi)障家系圖如圖1所示,經(jīng)系譜分析其遺傳方式為常染色體顯性遺傳;先證者眼前部檢查圖如圖2所示,為晶狀體藍色點狀混濁表型;家系中其他患病成員如其母親及其外婆均已行白內(nèi)障手術(shù)治療,無圖片提供。

2.2基因突變

PCR測序分析該家系GJA8基因測序圖如圖3(封三)所示,結(jié)果顯示,先證者及家系患者的GJA8基因發(fā)現(xiàn)了c.10T>C的雜合錯義突變;家系內(nèi)正常成員及正常對照者中未發(fā)現(xiàn)雙峰樣的雜合突變。GJA8氨基酸序列的多序列對比圖如圖4(封三)所示,比對數(shù)據(jù)顯示,在許多物種中位于第4個氨基酸位置的色氨酸為高度保守序列,黑色矩形框所示。

2.3突變預(yù)測結(jié)果

PolyPhen生物信息學(xué)軟件的預(yù)測結(jié)果如圖5(封三)所示,Cx50-W4R得分為1.00,提示該突變可能為有意義的突變。Misc Protein Analysis軟件預(yù)測結(jié)果如圖6(封四)所示,結(jié)果顯示,先證者及家系患者p.W4R突變改變了氨基酸鏈的正常二級結(jié)構(gòu),多增加了一個“轉(zhuǎn)角”結(jié)構(gòu),如紅色矩形框所示。突變氨基酸的疏水性預(yù)測圖如圖7(封四)所示,結(jié)果顯示,先證者及家系患者蛋白質(zhì)的疏水性明顯降低,影響其跨膜結(jié)構(gòu)和溶解度,進而改變蛋白質(zhì)的功能和自我聚集[11],如紅色矩形框所示。

3討論

已有研究表明,人類第一個定位于常染色體上的疾病是遺傳性先天性白內(nèi)障,其致病基因位點突變會導(dǎo)致先天性白內(nèi)障的發(fā)生。本研究在對一例先天性藍點狀白內(nèi)障患病家系進行致病基因突變篩查時,發(fā)現(xiàn)了GJA8基因的c.10T>C的雜合錯義突變,導(dǎo)致第4位高度保守的色氨酸改變?yōu)榫彼幔╬.W4R),從而揭示了該家系的遺傳學(xué)缺陷。

縫隙連接蛋白(connexin,Cx)是重要的細胞膜蛋白,對于細胞間的信號傳導(dǎo),轉(zhuǎn)運物質(zhì)能量和代謝產(chǎn)物等具有重要的作用[12]。晶狀體是一種無血管結(jié)構(gòu),其主要依靠Cx43、Cx46和Cx50介導(dǎo)的細胞間通訊來維持晶狀體的穩(wěn)態(tài)和透明度[13]。Cx50蛋白在晶狀體上皮細胞和晶狀體纖維細胞內(nèi)皆有表達[11],由GJA8基因進行編碼,其主要功能是在細胞間運輸離子及小分子物質(zhì)。Cx50蛋白經(jīng)過了4次的跨膜,形成了一個胞質(zhì)內(nèi)環(huán)、兩個細胞外環(huán)(E1、E2)以及位于該胞質(zhì)內(nèi)的C-末端和N-末端,相鄰的細胞外環(huán)之間通過相互作用形成連接子,相鄰兩個細胞間的連接子再通過相互連接構(gòu)成細胞間的縫隙連接通道。本研究通過測序及序列對比分析發(fā)現(xiàn)GJA8基因的c.10T>C的雜合錯義突變,導(dǎo)致第4位高度保守的色氨酸改變?yōu)榫彼幔╬.W4R),并發(fā)現(xiàn)該突變體位于胞質(zhì)內(nèi)的N-末端。Oh等[14]通過研究發(fā)現(xiàn)Cx N-末端可以影響跨界電壓依賴性門控的靈敏性。Musa等[15]的實驗也說明了Cx N-末端可能形成一個關(guān)鍵的細胞質(zhì)成孔區(qū)域,作為跨界電壓依賴的受體被細胞內(nèi)多胺封閉和阻斷。另外,還有研究表明,N-末端在滲透性方面也發(fā)揮著關(guān)鍵作用[16]。所以在本研究中,筆者認為該突變體可能改變N-末端結(jié)構(gòu),影響其發(fā)揮正常的功能作用。據(jù)報道,主要定位于細胞質(zhì)中的Cx50 R23T突變體會破壞縫隙連接的電導(dǎo),影響細胞間的通訊,這可能是因為帶正電荷的精氨酸(R)轉(zhuǎn)變?yōu)椴粠щ姾傻臉O性氨基酸蘇氨酸(T)[17]。因此,筆者懷疑Cx50 W4R也可能是由于不帶電荷的極性氨基酸精氨酸(W)被帶正電荷的氨基酸(R)取代造成的。Cx50分布結(jié)果表明,Cx50 W4R影響Cx50在亞細胞中的分布和轉(zhuǎn)運到質(zhì)膜,從而不能形成正常的半通道。因此,功能失調(diào)性縫隙連接可能是Cx50突變體導(dǎo)致白內(nèi)障的一種可能機制.

此外,Zhang等[18]通過靶向外顯子測序發(fā)現(xiàn)GJA8基因的c.10T>A的雜合錯義突變也會導(dǎo)致第4位高度保守的色氨酸改變?yōu)榫彼幔╬.W4R),這與本實驗研究的主要不同之處在于突變堿基的不同,但結(jié)果都為導(dǎo)致了同樣的氨基酸改變,并進一步促進了白內(nèi)障的發(fā)生。這種變異符合致病變異分級中的同一密碼子改變導(dǎo)致相同氨基酸改變這一標(biāo)準(zhǔn)[19],并且本研究通過PolyPhen預(yù)測分析結(jié)果顯示該氨基酸與致病性變異有關(guān),因此,進一步提示該致病基因突變?yōu)閺娭虏⌒酝蛔?,為該家系的遺傳學(xué)致病原因之一。但這是否與不同的白內(nèi)障表型相關(guān)聯(lián),還有待進一步研究。

綜上所述,GJA8基因發(fā)生c.10T>C的雜合錯義突變,導(dǎo)致第4位高度保守的色氨酸改變?yōu)榫彼幔╬.W4R)。該突變拓展了先天性白內(nèi)障GJA8基因突變譜,促進了先天性白內(nèi)障的研究進展,為研究尋找基因治療靶點提供了新的方向。

[參考文獻]

[1]葛堅,王寧利.眼科學(xué)[M].3版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2015:230-231.

[2]Li B,Liu Y,Liu Y,et al.Identification of a GJA3 mutation in a large family with bilateral congenital cataract[J].DNA Cell Biol,2016,35(3):135-139.

[3]Lin D,Chen J,Lin Z,et al.10-year overview of the hospital-based prevalence and treatment of congenital cataracts:the CCPMOH experience[J].PLoS One,2015,10(11):e0142298.

[4]Gong X,Song ZX,Wang LQ,et al.Screening and identification of genetic defect with congenital posterior polar cataract in a Chinese family[J].Rec Adv Ophthalmol,2015,35(12):1113-1115.

[5]Hansen L,Mikkelsen A,Nürnberg P,et al.Comprehensive mutational screening in a cohort of Danish families with hereditary congenital cataract[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2009,50(7):3291-303.

[6]楊家翼,邢怡橋.遺傳性先天性白內(nèi)障相關(guān)的基因突變和機制的研究進展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2018,24(23):4640-4646.

[7]饒艷.兩個先天性核性白內(nèi)障家系的突變篩查及突變蛋白功能研究[D].武漢:武漢大學(xué),2017.

[8]Ren M,Yang XG,Dang XJ,et al.Exome sequencing identifies a novel mutation in GJA8 associated with inherited cataract in a Chinese family[J].Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol,2017,255(1):141-151.

[9]Micheal S,Niewold ITG,Siddiqui SN,et al.Delineation of novel autosomal recessive mutation in GJA3 and autosomal dominant mutations in GJA8 in Pakistani congenital cataract families[J].Genes (Basel),2018,9(2):pii:E112.

[10]Hu S,Wang B,Zhou Z,et al.A novel mutation in GJA8 causing congenital cataract-microcornea syndrome in a Chinese pedigree[J].Mol Vis,2010,16:1585-1592.

[11]Yao K,Wang W,Zhu Y,et al.A novel GJA3 mutation associated with congenital nuclear pulverulent and posterior polar cataract in a Chinese family[J].Hum Mutat,2011,32(12):1367-1370.

[12]Shi Q,Jiang JX.Connexin arrests the cell cycle through cytosolic retention of an E3 ligase[J].Mol Cell Oncol,2016,3(2):e1132119.

[13]White TW.Unique and redundant connexin contributions to lens development[J].Science,2002,295(5553):319-320.

[14]Oh S,Abrams CK,Verselis VK,et al.Stoichiometry of transjunctional voltage-gating polarity reversal by a negative charge substitution in the amino terminus of a connexin32 chimera[J].J Gen Physiol,2000,116(1):13-31.

[15]Musa H,F(xiàn)enn E,Crye M,et al.Amino terminal glutamate residues confer spermine sensitivity and affect voltage gating and channel conductance of rat connexin40 gap junctions[J].J Physiol,2004,557(Pt 3):863-878.

[16]Dong L,Liu X,Li H,et al.Role of the N-terminus in permeability of chicken connexin45.6 gap junctional channels[J].J Physiol,2006,576(Pt 3):787-799.

[17]Thomas BC,Minogue PJ,Valiunas V,et al.Cataracts are caused by alterations of a critical N-terminal positive charge in connexin50[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2008,49(6):2549-2556.

[18]Zhang L,Liang Y,Zhou Y,et al.A missense mutation in GJA8 encoding connexin 50 in a Chinese pedigree with autosomal dominant congenital cataract[J].Tohoku J Exp Med,2018, 244(2):105-111.

[19]王秋菊,沈亦平,鄔玲仟,等.遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)與指南[J].中國科學(xué)(生命科學(xué)),2017,47(6):668-688.

(收稿日期:2019-08-14? 本文編輯:任秀蘭)

猜你喜歡
突變
精子線粒體與男性不育的相關(guān)性研究進展
兩種檢測方法對71例非綜合征型耳聾患者基因檢測結(jié)果的對比分析
例析應(yīng)對體育教學(xué)環(huán)境突變的教學(xué)策略
關(guān)于分析皮帶傳送中的摩擦力突變問題
快速PCR介導(dǎo)的NeuroD—3′UTR的定點突變研究
抑癌基因p16在燃煤型砷中毒患者中突變及甲基化的情況與意義
北約防長開會應(yīng)對東歐“突變”
遼寧朝陽地區(qū)氣溫變化特征分析
G蛋白偶聯(lián)受體突變分析的生物信息學(xué)方法及其資源研究
加工番茄無離層突變及離區(qū)JOINTLESS基因序列分析
沂南县| 昌宁县| 页游| 芮城县| 延安市| 新民市| 苗栗县| 灵宝市| 咸阳市| 阳原县| 邹平县| 田林县| 彭山县| 东安县| 鲁山县| 衡阳县| 北海市| 铜梁县| 贵溪市| 姜堰市| 寻甸| 陆河县| 屏南县| 兴安盟| 英吉沙县| 台中市| 乐昌市| 砀山县| 和政县| 南岸区| 新乐市| 新建县| 延川县| 涞源县| 郎溪县| 绥德县| 中西区| 澜沧| 泾阳县| 中卫市| 小金县|