哈米薩木·艾合買(mǎi)提江，曹玲，馬建華，雷晶

帕金森病（Parkinson's disease，PD）是一種神經(jīng)退行性疾病，其主要特征為黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性變性[1]。位于多巴胺能神經(jīng)元周?chē)男∧z質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)加速神經(jīng)退行性病變[2]。小膠質(zhì)細(xì)胞及T 淋巴細(xì)胞參與PD 腦內(nèi)的神經(jīng)免疫活動(dòng)[3,4]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T Lymphocytes，Treg）是具有維持自身免疫耐受功能的一種CD4+T細(xì)胞亞群，其免疫表型為CD4+CD25+Foxp3+，特異性表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 并發(fā)揮作用[5]。在1-甲基-4 苯基-1,2,3,6-四氫吡啶（1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP）誘導(dǎo)的小鼠中，Treg細(xì)胞能減輕Th17細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[6]。本研究通過(guò)檢測(cè)PD患者和正常健康者外周血Treg細(xì)胞百分比，探討其與PD之間的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入我院2018 年3 月至2018 年8 月診斷為PD 的患者42 例為PD 組，男21 例，女21 例；年齡47～82 歲，平均65 歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合英國(guó)帕金森病學(xué)會(huì)腦庫(kù)制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)。選取中老年健康體檢者42 例為對(duì)照組，男22 例，女20 例；年齡43～79歲，平均61 歲。受試者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 2 組血液指標(biāo)檢測(cè) 抽取受試者空腹外周血2 mL，肝素鈉抗凝，24 h內(nèi)處理樣本，在超凈工作臺(tái)下處理。采用BD FACSAriaTM Ⅱ型流式細(xì)胞儀檢測(cè)檢測(cè)Treg細(xì)胞：流式上樣管中加入100 μL外周血，按照抗體說(shuō)明書(shū)加入相應(yīng)量的20 μL CD4、20 μL CD25、5 μL CD127，避光孵育15 min。加入一定量的溶血素，避光裂解10 min。300 g離心5 min，棄上清。PBS洗滌一次，離心，棄上清，400 μL PBS重懸上機(jī)。

1.2.2 量表評(píng)估 對(duì)所有患者進(jìn)行詳細(xì)的病史詢(xún)問(wèn)，包括起病年齡、起病時(shí)間、診斷時(shí)間、既往史、家族史及用藥情況。由經(jīng)過(guò)專(zhuān)門(mén)培訓(xùn)的神經(jīng)科醫(yī)師對(duì)所有PD 患者于入院時(shí)評(píng)定量表：采用UPDRSⅢ量表（The United Parkinson's Disease Rate Scale Part III，UPDRS Ⅲ）評(píng)估運(yùn)動(dòng)癥狀，采用日常生活能力（activities of daily living，ADL）量表評(píng)估生活自理能力，采用Hoehn-Yahr（H-Y）分期量表評(píng)估PD 分期，采用非運(yùn)動(dòng)癥狀量表（Non-motor symptom questionnaire，NMSQ）評(píng)估非運(yùn)動(dòng)癥狀，采用簡(jiǎn)易智力狀態(tài)檢查量表（Mini-mental state examination，MMSE）、蒙特利爾認(rèn)知評(píng)估量表（Montreal cognitive assessment，MoCA）評(píng)估認(rèn)知功能，采用漢密爾頓抑郁量表（Hamilton depression scale，HAMD）、漢密爾頓焦慮量表（Hamilton anxiety rating scale，HAMA）評(píng)估焦慮抑郁狀態(tài)，采用便秘患者癥狀自評(píng)量表（patient assessment of constipation symptom，PAC-SYM）評(píng)估便秘情況，采用阿森斯失眠量表（Athens Insomnia Scale，AIS）評(píng)估睡眠障礙，采用左旋多巴等效每日劑量（levodopa equivalent daily dose，LEDD）評(píng)估用藥情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，符合正態(tài)分布與方差齊性的組間計(jì)量資料比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；Pearson相關(guān)性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組外周血中Treg細(xì)胞百分比比較

對(duì)照組、PD 組的外周血中Treg 細(xì)胞分別為（4.80±3.22）%、（3.72±2.05）%，PD 組的Treg 細(xì)胞百分比低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)對(duì)照組（A）和PD組（B）外周血中Treg細(xì)胞

2.2 PD患者外周血Treg細(xì)胞水平與病情相關(guān)性分析

PD 組中，Treg 細(xì)胞百分比與年齡（r=0.054，P=0.735）、性別（r=0.045，P=0.776）、LE DD（r=－0.140，P=0.377）、H-Y 分期（r=0.187，P=0.236）、ADL 量表（r=－0.053，P=0.740）、UPDRS Ⅲ評(píng)分（r=0.116，P=0.466）、NMSQ評(píng)分（r=0.136，P=0.392）、AIS評(píng)分（r=0.004，P=0.982）、PAC-SYM 評(píng)分（r=0.049，P=0.756）、MMSE評(píng)分（r=0.081，P=0.611）、MoCA 評(píng)分（r=－0.048，P=0.761）、HAMA評(píng)分（r=0.168，P=0.288）、HAMD（r=0.073，P=0.646）評(píng)分之間無(wú)相關(guān)性。

2.3 對(duì)照組外周血Treg細(xì)胞與年齡、性別相關(guān)性分析

對(duì)照組外周血Treg 細(xì)胞百分比與性別（r=－0.014，P=0.932）、年齡（r=0.252，P=0.108）無(wú)相關(guān)性。

3 討論

Treg細(xì)胞功能缺陷的小鼠易發(fā)生自身免疫疾病，將正常小鼠的Treg 細(xì)胞過(guò)繼給缺陷小鼠可抑制其自身免疫疾病的發(fā)生。Foxp3 基因敲除小鼠的Treg 細(xì)胞不能發(fā)揮免疫抑制作用，易發(fā)生自身免疫疾病[7]。Treg細(xì)胞活化后能抑制T細(xì)胞的活化與增殖，同時(shí)抑制效應(yīng)T細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子[8]。Treg細(xì)胞可下調(diào)免疫應(yīng)答、維持自身免疫耐受及抑制自身免疫疾病發(fā)生[14]。

本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，PD患者Treg細(xì)胞百分比減少（P＜0.05），這表明PD 患者外周血T 淋巴細(xì)胞出現(xiàn)免疫異常。Treg細(xì)胞表達(dá)降低的原因可能有如下幾種：①PD患者多巴胺能神經(jīng)元變性過(guò)程中聚集和硝化的α-syn 的釋放介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，激活后的膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)分泌TNF-α、IL-6、IL-1α、IL-β、IFN-γ等多種炎性介質(zhì)，這些炎癥介質(zhì)誘導(dǎo)NO、自由基或前列腺素的產(chǎn)生，從而干擾Treg 細(xì)胞的增殖和活性，因此Treg細(xì)胞比例降低[9]。②PD病程中，黑質(zhì)多巴胺嚴(yán)重丟失導(dǎo)致黑質(zhì)紋狀體軸突末端D1 樣受體的超敏和功能上調(diào)[10]，多巴胺通過(guò)D1 樣受體降低Treg 細(xì)胞的抑制活性、粘附和遷移能力，從而導(dǎo)致效應(yīng)T 細(xì)胞功能升高，起神經(jīng)保護(hù)作用的Treg 細(xì)胞數(shù)目減少，產(chǎn)生級(jí)聯(lián)炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步導(dǎo)致Treg 細(xì)胞神經(jīng)保護(hù)功能降低，加重多巴胺神經(jīng)凋亡[10]。③神經(jīng)元變性后繼發(fā)的一系列氧化應(yīng)激反應(yīng)使皮質(zhì)、紋狀體、丘腦底核、黑質(zhì)通路中的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)作用增強(qiáng)，從而調(diào)節(jié)能力減弱，Treg細(xì)胞功能及活性下降。④隨著PD患者α-syn的表達(dá)增加，聚集的α-syn當(dāng)從瀕臨死亡的神經(jīng)元釋放出來(lái)時(shí)，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生大量的神經(jīng)毒性因子[11]。小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的多巴胺神經(jīng)毒性機(jī)制與小膠質(zhì)細(xì)胞氧化損傷的發(fā)生有關(guān)。其中產(chǎn)生的NO 和超氧化物，快速反應(yīng)生成過(guò)氧亞硝酸鹽，它可以穿過(guò)細(xì)胞膜，導(dǎo)致3-硝基酪氨酸（3-Nitro-Tyrosine，3-NT）的形成、DNA損傷、線(xiàn)粒體抑制或脂質(zhì)過(guò)氧化[12]?；罨蠓置诘募?xì)胞因子，如TNF-α損耗多巴胺能神經(jīng)元的內(nèi)源性抗氧化物，如谷胱甘肽等，使神經(jīng)元的抗氧化能力減弱，同時(shí)產(chǎn)生的ROS、NO及過(guò)氧化物通過(guò)氧化應(yīng)激反應(yīng)損傷神經(jīng)元，進(jìn)一步放大炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[13]。隨著Treg細(xì)胞受損，數(shù)量減少，抗氧化能力減弱，硝化α-syn程度進(jìn)行性加重，從而對(duì)Treg細(xì)胞的損傷作用也增強(qiáng)，由此形成惡性循環(huán)。

PD組的Treg細(xì)胞百分比與LEDD、H-Y分期、ADL量表、運(yùn)動(dòng)癥狀、非運(yùn)動(dòng)癥狀、失眠嚴(yán)重程度、便秘嚴(yán)重程度、認(rèn)知嚴(yán)重程度之間均無(wú)相關(guān)性（均P＞0.05）。Treg 水平似乎與年齡有關(guān)，Treg細(xì)胞功能在老年人中可能較差[15]。然而在本研究中對(duì)照組年齡與Treg細(xì)胞百分比降低與無(wú)明顯相關(guān)性。考慮可能與本研究中受試者年齡均值在65歲左右，無(wú)年齡差距，故未發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞與年齡之間的相關(guān)性，需進(jìn)一步設(shè)計(jì)更多樣本量的研究。

本研究驗(yàn)證了PD 患者Treg 細(xì)胞數(shù)量降低，因此在未來(lái)的PD臨床治療研究中，可以將Treg細(xì)胞作為靶點(diǎn)，進(jìn)一步研究神經(jīng)保護(hù)劑，從而減少多巴胺能神經(jīng)元的變性、壞死。