（民勤縣畜牧獸醫(yī)工作站，甘肅民勤 733399）

按中國動物地理區(qū)劃，武威市屬于古北界，地處黃土高原、青藏高原和蒙新高原三大高原交匯地帶，地勢西高東低，局部地形復雜，是典型的蒙新區(qū)西部荒漠和半荒漠地區(qū)，也是駱駝生息繁衍的理想場所。民勤縣是聞名的“駱駝之鄉(xiāng)”，豢養(yǎng)使役駱駝歷史悠久，古有“漢馬唐駝”的說法。多年來，武威市駱駝養(yǎng)殖一直以傳統(tǒng)放牧為主，主要飼養(yǎng)于騰格里沙漠和巴丹吉林沙漠沿邊區(qū)域。近年來，因政府發(fā)布禁牧政策，自由式的放牧已不再適應駱駝養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，導致駱駝數量急劇減少。

動物梨形蟲病是世界各國公認的、最重要的一類寄生蟲病之一。該病在我國分布廣泛，常呈地方性流行，給疫區(qū)畜牧業(yè)造成嚴重經濟損失。20世紀70～90年代，王心娥等[1]、康新民等[2]、姚文炳[3]對河西三地區(qū)和阿拉善盟地區(qū)的駱駝蜱類區(qū)系做過詳細調查，但僅作了蜱蟲種類鑒定，而對梨形蟲病病原在媒介蜱和貯藏宿主體內的感染分布情況未作詳細描述。駱駝在自由放牧過程中接觸環(huán)境中媒介蜱蟲的概率較高。蜱蟲可通過吸取宿主血液，造成駱駝貧血、消瘦、營養(yǎng)不良、內臟機能受損、生產性能下降，更為嚴重的是蜱蟲可傳播多種疾病，如不采取有效的防治措施，會給駱駝產業(yè)造成毀滅性打擊。為深入了解和逐步保護開發(fā)駱駝產業(yè)，對武威市駱駝媒介蜱及其貯藏在體內的梨形蟲病病原進行了分子流行病學調查。

1 材料與方法

1.1 試劑

大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α、TaKaRa ExTaq?、RNase-free Water、X-gal、IPTG，購自寶生物工程（大連）有限公司；pGEM-T Easy載體，為Promega公司產品；DNA提取試劑盒，購自QIAGEN公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒（ZymocleanGel DNA Recovery Kit），購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2 基因組DNA

臨床樣品為2018年6—7月采自武威市“甘蒙”邊界21匹駱駝體表的蜱蟲及相對應駱駝的抗凝血樣品，其中抗凝血樣品21份、蜱樣品40份。蜱樣品為饑餓成蜱或半飽血雌蜱，其中雄蜱8只、雌蜱32只。使用QIAGEN公司的基因組提取試劑盒（No.51306）提取臨床樣品基因組DNA，置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。梨形蟲病病原陽性及陰性基因組DNA，均由中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所外寄生蟲與蟲媒疫病團隊提供。

1.3 方法

1.3.1 蜱蟲形態(tài)學鑒定 借助顯微鏡，對采集的饑餓成蜱（雌蜱）進行形態(tài)學鑒定。

1.3.2 梨形蟲病病原通用引物設計及基因擴增 參考文獻[4-5]，設計合成擴增巴貝斯蟲和泰勒蟲（統(tǒng)稱為梨形蟲病病原）18S rRNA基因的巢式PCR通用引物2對：VP-1F（5'-CCT TCCTTTAAGTGATAAGGTTCAC-3'），VP-1R（5'-GACGGTAGGGTATTGGCCTmCCG-3'，簡并堿基m=A+C）；VP-2F（5'-ATTACCCAATmC bGACACvGkGAGG-3'，簡并堿基v=A+C+G，b=T+C+G，k=T+G，m=A+C）；VP-2R（5'-TTAAATACGAATGCCCCCAAC-3'）。以實驗室保存的動物梨形蟲病病原基因組為模板，分別以陽性基因組、陰性基因組和PCR用水為陽性對照、陰性對照和空白對照，在25 μL反應體系中進行第1輪擴增：10×PCR buffer（Mg2+plus）2.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L each）2.0 μL，TaqDNA polymerase 1.25 U，VP-1F和VP-1R引物（10 μmol/L）各1 μL，基因組模板1 μL，PCR用水補足至25 μL。反應程序為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。然后以擴增產物為模板，用VP-2F和VP-2R引物對進行第2輪擴增，反應體系同上。反應程序為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃再延伸5 min，4 ℃保存。擴增結束后，對PCR產物用1.5%的瓊脂糖凝膠（含8 μL/100 mL的Goldview I 型核酸染色劑）電泳分析，觀察擴增結果。在380～420 bp位置出現特異性目的條帶時，判定為動物梨形蟲病病原樣品陽性。對擴增的陽性目的條帶進行膠回收，將所得目的片段與pGEM-T Easy載體連接；連接產物轉化到大腸桿菌Trans DH5α感受態(tài)細胞中，用含氨芐青霉素的LB平板篩選陽性菌落。將PCR鑒定為陽性的重組質粒送西安擎科生物技術有限公司進行測序，測定的基因片段經BLASTn分析，鑒定引物擴增特異性區(qū)段的正確性。

2 結果

2.1 蜱形態(tài)學鑒定

通過顯微鏡對采集的饑餓成蜱（雌蜱）進行觀察發(fā)現：盾板橢圓多角形，后緣尖窄，暗呈角狀，亮褐至暗褐色；氣門板逗點形，背突細窄，氣門板后緣在背突基部較直；足粗細適中，呈黃褐色或赤褐色，關節(jié)的淡色環(huán)帶及背緣談色縱帶較窄；爪墊短小，不及爪長一半。根據以上形態(tài)學特征，鑒定該蜱為亞洲璃眼蜱（圖1）。

圖1 蜱蟲鑒定結果

2.2 蜱體內梨形蟲病病原基因擴增

通過巢式PCR擴增鑒定，從駱駝體表采集的40份蜱樣品中擴增出陽性樣品1份，經測序鑒定為雙芽巴貝斯蟲；將擴增的序列提交GenBank，獲得基因序列登錄號MK418667。

2.3 駱駝抗凝血中梨形蟲病病原基因擴增

通過巢式PCR擴增，在采集的21份駱駝抗凝血樣中，未檢測出巴貝斯蟲和泰勒蟲病原。

3 討論

研究[1-2]顯示：20世紀70～90年代，武威市駱駝蜱蟲種類主要為鈍跗硬蜱（Ixodes pomerantzevi Serdukova，1941年）、亞東璃眼蜱（Hyalomma asisticum kozlovi Olenev，1931年）、亞洲璃眼蜱（H.asistisum asiaticum Schlze &Schlottke，1929年）和波斯銳緣蜱（Argas persicus Oken，1818年）。此次調查所采集到的蜱蟲經形態(tài)學鑒定為亞洲璃眼蜱，證實亞洲璃眼蜱依然是該地的優(yōu)勢種。亞洲璃眼蜱是一種三宿主蜱，主要分布于我國新疆、內蒙古、青海以及中亞地區(qū)；宿主廣泛，以牛、羊、馬、犬、兔、鼠等哺乳動物及鳥類為主[6]；而波斯銳緣蜱作為雞蜱蟲的優(yōu)勢種，孫明等[7-8]于2015年7月在民勤縣蘇武鎮(zhèn)農戶所養(yǎng)殖的家禽上已發(fā)現；其余兩種蜱蟲，近幾年未有相關文獻報道。

在國內外已有的文獻中，駱駝泰勒蟲（Theileria camelensis）僅為單峰駝的一種寄生蟲，也是唯一一種寄生于駱駝的蜱傳性寄生蟲病[9]，主要分布于埃及和利比亞，在埃及的流行率為30%，在利比亞的流行率為6.5%，在伊朗也有發(fā)現[10-12]，但沒有相關的流行病學數據公布。最近，對約旦單峰駝血液的分子研究[13]揭示了單峰駝中存在馬巴貝斯蟲（Babesia caballi）和馬泰勒蟲（T.equi），但是紅細胞的顯微鏡檢查并沒有發(fā)現巴貝斯蟲及泰勒蟲。在感染泰勒蟲的駱駝體表獲得的硬蜱中，嗜駝璃眼蜱（Hyalomma dromedarii）為優(yōu)勢種。蒙古國雙峰駝上寄生有亞洲璃眼蜱（Hy.asiaticum）、草原革蜱、達吉斯坦革蜱（De.daghestanicus）和短小扇頭蜱（Rh.pumilio）的報道[14]，阿富汗[15]、伊朗[16]也有亞洲璃眼蜱叮咬駱駝的報道。此次流行病學調查在駱駝體表的蜱體內檢出雙芽巴貝斯蟲病原，說明當地存在通過蜱傳播梨形蟲病的風險。本次調查雖然在駱駝抗凝血樣品中并未檢出梨形蟲病病原，但這并不能說明該地駱駝中不存在梨形蟲病流行，很有可能與此次樣本的采樣數量過小有關。

盡管國內外關于駱駝梨形蟲病的報道不多，但駱駝體表的蜱蟲作為動物梨形蟲病病原或其他媒介動物疫病的貯存宿主，給公共衛(wèi)生和人畜安全帶來了嚴重威脅。有文獻證實，駱駝上的蜱在環(huán)形泰勒蟲病、東海岸熱、牛心水病傳播中起重要作用[17]，璃眼蜱和革蜱被列為馬梨形蟲病的傳播媒介[18-19]；在我國內蒙古地區(qū)，草原革蜱和亞洲璃眼蜱是人西伯利亞立克次氏體的傳播媒介。而本次在駱駝體表的蜱體內檢出雙芽巴貝斯蟲，同樣警示蜱作為動物梨形蟲病病原的傳播媒介，在叮咬宿主繁衍后代的同時也可傳播疫病，如不采取有效的防治措施，將給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重影響。

綜上所述，PCR技術具有快速、敏感、特異性高的優(yōu)點，為駱駝蜱及梨形蟲病的臨床診斷和流行病學調查提供了有效的技術手段。此次調查，也是甘肅省基層獸醫(yī)機構首次利用分子生物學檢測手段，開展動物梨形蟲病病原檢測，將有助于全省基層獸醫(yī)實驗室提高動物疫病檢測能力。