楊艷玲，程世鵬，任林柱

（1.中國農業(yè)科學院特產研究所，吉林長春 130122；2.吉林大學動物科學學院，吉林長春 130062）

水貂冠狀病毒（mink coronavirus，MCoV）最早流行于美國的猶他州，1987年我國從北美進口種貂時帶入該病毒[1]。近年來，我國山東省水貂養(yǎng)殖場中曾有MCoV感染發(fā)生，但感染率不高，致死率較低。MCoV主要引起水貂流行性卡他性胃腸炎，主要臨床表現(xiàn)為：腹瀉，排灰白色、綠色及粉黃色黏液狀稀便，有的排黑紅色、沒有明顯套管樣稀便；同時伴有食欲不振、嘔吐、精神萎靡、口渴、鼻鏡干燥、被毛欠光澤、消瘦、皮膚缺乏彈性等癥狀；體溫一般不高，多因脫水發(fā)生自體中毒而死亡[2]。

人冠狀病毒HCoV-19為2019年在我國武漢市引起人嚴重呼吸道感染的新型冠狀病毒，最初被命名為2019-nCov，后被國際病毒分類委員會更名為SARS-Cov-2。但是，由于SARS-Cov-2與SARS-Cov不同，將該病毒命名為SARS-Cov-2容易引起歧義，因此現(xiàn)在我國科學家將該病毒命名為HCoV-19[3-6]。

為進一步明確我國貂源冠狀病毒與新型冠狀病毒（HCoV-19）的遺傳進化關系，本研究比較了NCBI上公布的3株水貂冠狀病毒、5株雪貂冠狀病毒以及人冠狀病毒HCoV-19 和SARS-Cov的全基因組、ORF1a、ORF1ab以及病毒表面蛋白Spike的序列同源性，并分析了其遺傳進化關系以及組成病毒的所有結構和非結構蛋白的種類、基因位置及氨基酸數(shù)量。

1 材料與方法

1.1 基因序列

下載并整理NCBI上公布的3株水貂冠狀病毒、5株雪貂冠狀病毒、1株人源新型冠狀病毒HCoV-19（GenBank登錄號NC_045512）和1株人源SARS-Cov（GenBank登錄號AY274119）的全基因組序列。3株水貂冠狀病毒包括：1株中國株（GenBank登錄號MF113046）[2]，2株美國株（GenBank登錄號HM245926、NC_023760）[7]；5株雪貂冠狀病毒包括：2株美國株（GenBank登錄號KX512810、KX512809），2株日本株（GenBank登錄號LC215871、LC119077）[8]，1株荷蘭株（GenBank登錄號NC030292）。

1.2 序列同源性及遺傳進化關系分析

根據(jù)下載的10株冠狀病毒基因組序列，分別整理每一株冠狀病毒的全基因組序列、ORF1a、ORF1ab和病毒表面蛋白Spike的編碼基因序列及其蛋白序列，并利用DNAMAN軟件進行序列同源性比對及進化樹繪制。

同時，對冠狀病毒結構蛋白和非結構蛋白的種類、基因位置及氨基酸數(shù)量進行統(tǒng)計整理，用于分析不同冠狀病毒株的全基因組成差異。

2 結果與分析

2.1 病毒分類

根據(jù)國際病毒分類委員會（ICTV）對冠狀病毒的分類標準，HCoV-19屬于巢病毒目冠狀病毒科正冠狀病毒亞科Betacoronavirus屬Sarbecovirus亞屬類SARS病毒種，而水貂冠狀病毒MCoV屬于α冠狀病毒，與雪貂冠狀病毒同屬于α冠狀病毒2亞屬。為此，在病毒分類上，水貂冠狀病毒、雪貂冠狀病毒與新型冠狀病毒HCoV-19不是同一屬的冠狀病毒。

2.2 全基因組相似性

比較了NCBI上公布的3株水貂冠狀病毒、5株雪貂冠狀病毒、HCoV-19和SARS-Cov的全基因組序列相似性。結果顯示，貂源冠狀病毒與HCoV-19的基因組序列相似性為68.42%，其中水貂冠狀病毒中國分離株與HCoV-19的全基因組相似性為50.57%，與SARS-Cov的相似性為50.34%（表1）。以上分析表明，HCoV-19與貂源冠狀病毒的基因組相似性較低。

2.3 基因組遺傳進化關系

貂源冠狀病毒與HCoV-19的全基因組遺傳進化分析顯示，8株貂源冠狀病毒與2株人源冠狀病毒（HCoV-19和SARS-Cov）不屬于同一種冠狀病毒分支，而且遺傳進化關系較遠。2株人源冠狀病毒（HCoV-19和SARS-Cov）屬于同一種冠狀病毒下的同一分支，親緣關系較近；8株貂源冠狀病毒屬于同一種冠狀病毒分支，但是其中的3株水貂冠狀病毒和5株雪貂冠狀病毒又各自形成一個獨立分支，即水貂冠狀病毒與雪貂冠狀病毒不屬于同一分支（圖1）。為此，通過全基因組遺傳進化關系分析，可以明確貂源冠狀病毒與新型冠狀病毒HCoV-19不在同一分支，親緣關系較遠。

表1 水貂冠狀病毒中國分離株與其他冠狀病毒的同源性 %

圖1 貂源冠狀病毒與HCoV-19全基因組進化關系

2.4 ORF1a和ORF1ab一致性

冠狀病毒ORF1a和ORF1ab非結構蛋白序列一致性是國際病毒分類委員會對冠狀病毒種屬分類的依據(jù)。如果兩個冠狀病毒的序列一致性大于90%這個閾值，則表示兩個冠狀病毒屬同一種。通過對水貂冠狀病毒和人冠狀病毒ORF1a基因序列的分析發(fā)現(xiàn)，水貂冠狀病毒與HCoV-19的ORF1a基因相似性為46.96%，ORF1ab基因相似性為52.44%；與SARS-Cov的ORF1a基因相似性為47.39%，ORF1ab相似性為52.24%。水貂冠狀病毒與HCoV-19的ORF1a蛋白相似性為 72.02%，ORF1ab蛋白相似性為76.53%；與SARS-Cov 的ORF1a蛋白相似性為72.46%，ORF1ab蛋白相似性為 76.69%（表1）。ORF1a和ORF1ab的基因遺傳進化關系分析顯示：貂源冠狀病毒與人源冠狀病毒不屬于同一種，親緣關系較遠，而HCoV-19和SARS-Cov屬于同一分支。另外，雪貂冠狀病毒和水貂冠狀病毒同屬一個種下的不同分支（圖2～3）。通過對ORF1a和ORF1ab一致性分析，進一步明確了貂源冠狀病毒和人源冠狀病毒不是同一種冠狀病毒。

圖2 貂源冠狀病毒與HCoV-19的ORF 1ab進化分析

2.5 Spike蛋白同源性

圖3 貂源冠狀病毒與HCoV-19的ORF 1a進化分析

刺突糖蛋白（Spike glycoprotein，S glycoprotein）是病毒與人源細胞上血管緊張素轉換酶2（ACE2）受體結合，幫助病毒進入宿主細胞的重要成分，是冠狀病毒疫苗設計、治療性抗體研究、臨床診斷試劑開發(fā)及抗病毒藥物發(fā)現(xiàn)的關鍵靶點，也是冠狀病毒進化過程中比較容易變異的主要成分。本研究分析了不同貂源冠狀病毒以及HCoV-19、SARS-Cov的S蛋白編碼基因同源性。結果顯示：貂源冠狀病毒與HCoV-19的S蛋白編碼基因相似性為47.36%，與SARS-Cov的相似性為46.15%；HCoV-19和SARS-Cov兩株冠狀病毒的S蛋白編碼基因相似性為74.29%；3株水貂冠狀病毒間的S蛋白相似性為85%，5株雪貂冠狀病毒間的S蛋白相似性為88.4%；水貂與雪貂冠狀病毒間的S蛋白相似性為74.86%。Spike 蛋白遺傳進化分析顯示：貂源冠狀病毒與HCoV-19不屬于同一分支，遺傳進化關系較遠；3株水貂冠狀病毒的S蛋白和5株雪貂冠狀病毒的S蛋白屬于同一種下的兩個分支（圖4）?？梢姡踉垂跔畈《九cHCoV-19 的Spike蛋白同源性較低，遺傳進化關系較遠。

圖4 貂源冠狀病毒與HCoV-19 Spike蛋白的進化分析

2.6 全基因組的蛋白組成、基因位置和氨基酸數(shù)量

為進一步明確貂源冠狀病毒與人源冠狀病毒HCoV-19的結構差異，分別對1株水貂冠狀病毒中國分離株、1株水貂冠狀病毒美國分離株、1株雪貂冠狀病毒和1株人冠狀病毒HCoV-19武漢分離株的主要蛋白、各組分基因位置及氨基酸數(shù)量進行比對分析。結果顯示：4種不同冠狀病毒在蛋白組成上存在顯著差異，其中HCoV-19編碼的結構和非結構蛋白有12個，而水貂冠狀病毒僅有10個，雪貂冠狀病毒有9個。另外，相同蛋白編碼基因的位置相差也較大，尤其是N蛋白。HCoV-19的N蛋白在基因組28 274～29 533核苷酸之間，而水貂和雪貂的N蛋白位置比較相似，分別位于基因組26 454～27 584和26 368～27 492核苷酸之間。此外，氨基酸的數(shù)量差異也比較大，如ORF1a、ORF1ab、S蛋白等重要結構蛋白在貂源冠狀病毒與HCoV-19之間差異十分顯著（表2）。以上分析表明，貂源冠狀病毒與新型冠狀病毒的蛋白組成、基因位置和氨基酸數(shù)量均存在明顯差異。

3 討論

冠狀病毒是一類家族龐大的病原微生物，目前有α、β、γ和δ 4個屬[9-10]。而且感染宿主比較廣泛，包括多種野生動物、家養(yǎng)哺乳動物、家禽等。已知感染豬的冠狀病毒有6種，分別是豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬呼吸道冠狀病毒（PRCV）、豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒（SADS-CoV）、豬血凝性腦脊髓炎病毒（PHEV）和豬δ冠狀病毒（PDCoV）[11]。家禽冠狀病毒感染危害較大的是屬于γ冠狀病毒屬的雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）。此外，鴨冠狀病毒、鵝冠狀病毒和鴿冠狀病毒等在家禽中也有檢出。一些野禽可感染δ屬冠狀病毒（如鵝口瘡冠狀病毒HKU12等）[12]。牛冠狀病毒（BCoV）是β冠狀病毒屬的成員，主要引起犢牛胃腸炎、呼吸道疾病、奶牛冬季痢疾及牛運輸發(fā)熱性肺炎等[13]。有研究分別對豬冠狀病毒[11]、禽冠狀病毒[12]與人冠狀病毒HCoV-19進行了基因組相似性的比對及遺傳進化關系分析，結果均發(fā)現(xiàn)豬和禽的冠狀病毒與HCoV-19的基因組相似性僅為40%左右，相似性較低，這些冠狀病毒與人冠狀病毒的親緣關系也較遠。本研究分析發(fā)現(xiàn)，貂源冠狀病毒與人源冠狀病毒的全基因組相似性僅為68%，相似性較低，同時遺傳進化關系顯示，它們不在同一分支，而且親緣關系較遠。在病毒分類上，貂源冠狀病毒屬于α冠狀病毒[14]，而人冠狀病毒HCoV-19屬于β屬冠狀病毒[7]。本研究結果也顯示，它們不在同一分支。

表2 水貂冠狀病毒與人冠狀病毒全基因組蛋白的核苷酸位置及氨基酸數(shù)量

為明確貂源冠狀病毒與HCoV-19的親緣關系，對ORF1a和ORF1ab的氨基酸序列一致性進行了比對，結果發(fā)現(xiàn)貂源冠狀病毒與HCoV-19的ORF1a和ORF1ab氨基酸一致性分別為72.02%和76.53%。根據(jù)國際病毒分類委員會的冠狀病毒分類依據(jù)，ORF1a和ORF1ab的序列一致性需要大于90%這個閾值，才表示兩個冠狀病毒屬同一種。本研究的數(shù)據(jù)分析結果進一步說明，貂源冠狀病毒與人冠狀病毒HCoV-19不屬于同一種。同時，本研究還將貂源冠狀病毒與HCoV-19的全基因組組成、基因位置及氨基酸數(shù)量進行了比較分析，結果發(fā)現(xiàn)兩株冠狀病毒在基因組構成上的差異十分顯著，最明顯的是兩株冠狀病毒的構成成分。貂源冠狀病毒編碼的閱讀框有10個蛋白質，而HCoV-19有12個，且編碼基因在基因組中的位置也有較大差異，尤其是N蛋白差別很大。通過對全基因組的詳細對比分析發(fā)現(xiàn)，貂源冠狀病毒與毒HCoV-19不是同一種冠狀病毒。

4 結論

通過對HCoV-19武漢流行株和已經公布的水貂、雪貂冠狀病毒株進行全基因組系統(tǒng)分析，明確了貂源冠狀病毒與人冠狀病毒HCoV-19不是同一種冠狀病毒，而且親緣關系較遠；此次流行的人冠狀病毒由貂源冠狀病毒重組而成的可能性很小，可初步排除HCoV-19來源于水貂和雪貂的可能性。