劉銘， 劉輝， 李娜， 陳瀟， 胡光春， 劉嵐錚

濟南市疾病預防控制中心細菌性疾病檢驗所，濟南 250021

近年來，隨著生活水平的提高和捕撈技術的發(fā)展，海產(chǎn)品消費量逐漸提高，與之相關的疾病也呈現(xiàn)上升趨勢。2011—2015年全國食源性疾病監(jiān)測網(wǎng)1 668起微生物性食源性疾病暴發(fā)事件中，有515起由副溶血性弧菌導致，每年均位列所有病原首位，致使8 446人發(fā)病[1-5]，且近兩年事件數(shù)和發(fā)病人數(shù)仍呈上升趨勢(數(shù)據(jù)未公開)。海洋作為一個巨大的“微生物庫”，我們對其相關微生物還所知甚少。根據(jù)宏基因組學分析結果，海洋微生物有100萬種，我們目前分離到的海洋微生物不足1%[6-7]，因此對其中潛在的致病風險尚不知曉。

帶魚(Trichiurusspp.)為集群于近底層的廣溫性洄游魚類，其廣泛分布于中國、朝鮮半島、日本、印度尼西亞、菲律賓、印度、非洲東岸及紅海等海域。我國帶魚的漁獲量最高，其中東海帶魚為海洋漁業(yè)生產(chǎn)中漁獲量最高的經(jīng)濟魚種之一，產(chǎn)量多年來一直居我國海洋捕撈魚類產(chǎn)量的首位，同時也是東?！八拇鬂O業(yè)”中唯一還能形成較大漁汛的傳統(tǒng)捕撈對象，在東海漁業(yè)生產(chǎn)中占據(jù)重要地位[8]。帶魚作為我國主要海產(chǎn)品之一，消費量較大，與人的日常生活關系密切。目前其病原學相關研究主要集中于常見病原菌，如霍亂弧菌、副溶血性弧菌、單核細胞增生李斯特氏菌、腸出血性大腸桿菌[9]。而帶魚在水中有晝夜垂直移動的習慣，深海與表層均是其活動范圍，關于帶魚所攜帶的自身特有或海洋特有的病原微生物狀況和風險均未知。本研究通過基于16S rRNA基因高通量測序技術與多種統(tǒng)計方法，分析我國東海帶魚腸道內容物中細菌群落的多樣性，對明確帶魚腸道菌群結構、發(fā)現(xiàn)潛在致病的新病原具有積極的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗材料 于2018年9月在我國東海海域(27。N，121。E)捕獲的10條體態(tài)完好的帶魚冰鮮運輸至實驗室。帶魚體長75.5～86.0 cm，重量248.7～396.5 g。

1.1.2試劑 QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit購自德國QIAGEN公司，GeneJET膠回收試劑盒購自美國Thermo Scientific公司，Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫試劑盒購自美國Thermofisher公司，無水乙醇(優(yōu)級純)購自天津科密歐公司，Phusion high-fidelity PCR Mastermix購自NEB(北京)有限公司。

1.1.3儀器與設備 超純水機購自英國ELGA公司，5424R離心機和金屬恒溫器購自德國Eppendorf公司，超微量核酸檢測儀購自BioDrop公司。

1.2 方法

1.2.1樣品處理 在超凈工作臺上，用75%(體積分數(shù))酒精擦拭魚體表面，然后從肛門處成弧形剪開魚腹部，展現(xiàn)并分離腸道，用75%酒精棉球擦拭腸管外壁，輕輕擠出腸道內容物，置于無菌1.5 mL EP管中，分別編號為Tri911.1～Tri911.10，并對其立即進行DNA提取。

1.2.2DNA提取及核酸濃度測定 參照QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit試劑盒說明書所述方法對10份帶魚腸道內容物進行DNA提取，并進行瓊脂糖凝膠電泳和DNA濃度檢測，以確保所提取DNA質量能夠滿足后續(xù)擴增要求。

1.2.316S rRNA基因擴增和測序 DNA擴增和測序交由天津諾禾致源生物信息公司進行。過程簡述如下：根據(jù)16S rRNA基因序列特點和Ion S5TMXL平臺測序要求，針對V3-V4區(qū)域設計帶Barcode的特異引物341F：5′-C C T A Y G G G R B G C A S C AG-3′，806R：5′-G G A C T A C H V G G G T W T C T A AT-3′進行擴增[10]。PCR反應使用Phusion high-fidelity PCR Mastermix進行，反應條件為：94 ℃預變性2.5 min；94 ℃變性40 s，50 ℃退火55 s，72 ℃延伸90 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸15 min。PCR產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測；根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進行等量混樣，充分混勻后使用1×TAE濃度2%的瓊脂糖凝膠電泳純化PCR產(chǎn)物，剪切回收目標條帶。使用GeneJET膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。然后用Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫試劑盒進行文庫構建，經(jīng)Qubit定量和文庫檢測合格后，使用Ion S5TMXL進行上機測序。

1.2.4數(shù)據(jù)處理與分析 對測序所得原始數(shù)據(jù)進行去雜、拼接，對所有的優(yōu)質序列使用Uparse軟件(版本7.0.1001)以相似度97%進行OTU分類。選取OTUs代表性序列，用Mothur方法與SILVA數(shù)據(jù)庫進行物種注釋分析(設定閾值為0.8～1.0)，獲得分類學信息并分別在各個分類水平統(tǒng)計各樣本的群落組成。使用MUSCLE軟件(版本3.8.31)進行快速多序列比對，得到所有OTUs序列的系統(tǒng)發(fā)生關系。最后對各樣本的數(shù)據(jù)進行均一化處理，進一步通過QIIME軟件(版本1.9.1)和R語言(版本2.15.3)進行α多樣性和β多樣性分析。

2 結果與分析

2.1 基于16S rRNA測序的腸道內容物菌群多樣性

對東海帶魚腸道內容物樣品16S rRNA數(shù)據(jù)分析，10個測序樣經(jīng)質控，每樣品平均得到 74 914 條有效數(shù)據(jù)，平均長度為418～427 nt。從稀釋曲線來看，隨著樣品量的不斷增大，在樣品量大于45 000時，稀釋曲線趨于平坦，說明測序數(shù)據(jù)量合理，且測序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映樣本中絕大多數(shù)的微生物多樣性信息。

根據(jù)97%的相似度進行OTU分類，獲得 1 221 個OTUs。10個樣本分別得到159、282、490、214、314、263、275、680、332和495個OTUs。其中，注釋到數(shù)據(jù)庫的OTU數(shù)目為1 218(99.75%)，注釋到門水平的比例為89.03%，綱水平的比例為86.90%，目水平的比例為80.18%，科水平的比例為73.87%，屬水平的比例為53.24%。在門水平上，占主導地位的為柔膜菌門(Mollicutes)、變形菌門(Gammaproteobacteria)和螺旋體門(Spirochaetia)，結果見圖1。

圖1 每個樣本中微生物在門水平上的群落結構組成分布(豐度排前 10)Fig.1 Bacterial community composition at phylum level in each samples (abundance in Top 10)

在屬水平上的優(yōu)勢菌屬為支原體屬(Mycoplasma)、弧菌屬(Vibrio)和發(fā)光桿菌屬(Photobacterium)。不同分類水平上豐度排前10位的基于最大排序法以分布直方圖展示。各樣本中平均豐度排前10的屬見圖2，其中支原體屬相對豐度分別為7.49%、79.18%、38.64%、67.13%、46.99%、60.71%、87.27%、17.51%、67.37%和13.51%。

圖2 每個樣本中微生物在屬水平上的群落結構組成分布(豐度排前10)Fig.2 Bacterial community composition at genus level in each samples (abundance in Top 10)

2.2 α多樣性分析

對不同樣本在97%一致性閾值下的α多樣性分析指數(shù)(Shannon、Simpson、Chao、ACE、goods coverage)進行統(tǒng)計，對樣品微生物物種的豐富程度和多樣性進行評估，結果見表1(均一化時選取的數(shù)據(jù)量：cutoff=43 885)。各樣品的coverage都達到了0.999以上，即樣品文庫覆蓋率高，序列未被檢出的可能性小，本次測序結果能夠較真實地反映樣品中的微生物群落。其中Tri911.3、Tri911.8和Tri911.10樣本的Chao指數(shù)和ACE指數(shù)較高，顯示其微生物群落豐度較高；Tri911.1、Tri911.3、Tri911.8和Tri911.10樣本的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)較高，顯示其微生物多樣性較高。

表1 α多樣性分析指數(shù)Table 1 α diversity index of each samples

2.3 β多樣性分析

對樣品進行主成分分析(principal component analysis， PCA)，結果見圖3。橫坐標為PC1，其貢獻率為26.17%。縱坐標為PC2，貢獻率為25.82%。這2個主成分是樣品微生物群落結構組成差異的主要因子。除Tri911.3、Tri911.10和Tri911.8外，大部分樣品距離較近，樣品的群落組成相似。

圖3 10份帶魚腸道內容物樣品的PCA分析Fig.3 Principal component analysis (PCA) of 10 hairtail fish intestinal contents samples

3 討論

對魚類腸道菌群的研究主要集中在淡水養(yǎng)殖魚類和大黃魚、大菱鲆等海洋經(jīng)濟魚類上，以期通過對其腸道菌群的研究來提高魚類的抗病能力，提高漁業(yè)產(chǎn)量[11]。本研究主要關注東海帶魚腸道菌群與人類新發(fā)傳染病之間的關系。有研究報道，魚類的腸道內容物中，以變形菌門為主，在不同種魚類中占腸道菌群的90%[12-13]，其中弧菌目(包括弧菌屬和發(fā)光桿菌屬)占70%[14]。而本研究發(fā)現(xiàn)柔膜菌門在其腸道菌群中為優(yōu)勢菌門，其中支原體屬為優(yōu)勢菌屬，相對豐度為50.95%。Holben等[15]運用16S rDNA測序技術對挪威和蘇格蘭養(yǎng)殖的大馬哈魚(Salmosalar)以及野生的大馬哈魚腸道菌群進行研究，發(fā)現(xiàn)支原體屬(Mycoplasma)占主要成分，在挪威和蘇格蘭養(yǎng)殖大馬哈魚腸道菌群中相對豐度分別為25%和81%，在野生大馬哈魚中的相對豐度為96%，該研究首次報道了在魚腸道菌群中發(fā)現(xiàn)支原體，且為主要成分，其認為雖然支原體具有致病性，但在該魚中是正常菌群的一部分，并在其健康和生理上可能發(fā)揮著某種未知的作用；Bano等[16]運用DGGE方法對來自美國加州5處鹽沼的長嘴蝦虎魚(Gillichthysmirabilis)中的腸道菌群進行研究也發(fā)現(xiàn)支原體占優(yōu)勢地位，并認為其與該魚為共生關系，但對其他物種來說可能為潛在的病原體；Li等[17]運用16S rRNA高通量測序的方法對我國揚子江上游30條不同性別和體重的圓口銅魚(Coreiusguichenoti)的腸道內容物菌群進行研究，發(fā)現(xiàn)在屬水平上雌性魚主要以支原體屬為主，且與體重無關，可能與該魚食性以及雌魚體內特殊的代謝活動有關。本研究結果與上述對不同種魚類腸道微生物菌群的研究結果存在相似性，說明支原體在魚腸道菌群中大量存在是可能的，且為腸道正常菌群的一部分，但對宿主以外，特別是與其密切接觸的生物來說支原體可能為潛在的病原菌[16]。

支原體是一類廣泛存在于人和動物體內，隸屬支原體科，柔膜菌綱，革蘭氏陰性[18-20]，為能夠在宿主之外進行自我復制的最小和最簡單的生命形式。到目前為止，支原體包含超過100個物種，其中許多為人類和各類動物的病原菌，引起了醫(yī)學和獸醫(yī)領域的廣泛關注[21-23]。雖然多年來支原體一直被認為是宿主特異性的，但某些菌株在人與動物宿主間的交叉感染已被報道[19]。Hu等[24]報道了1994—2007年，血營養(yǎng)支原體(Hemotrophicmycoplasma)導致了我國人畜共患病的爆發(fā)，其在豬、牛、羊和狐貍以及與其密切接觸的農民和獸醫(yī)中廣泛流行。支原體可能通過粘膜表面的親密接觸和物質轉移而被宿主獲得[19]。而支原體通過皮膚創(chuàng)傷進入健康個體可能會對其構成潛在的危險，即使支原體在其自然宿主中不具有致病性。Hill[25]曾報道了一名微生物學家操作豚鼠時，拇指意外被含有支原體(Mycoplasmacaviae)的液體感染，造成了整個手的充血腫脹和疼痛。而該支原體發(fā)現(xiàn)于豚鼠中但對嚙齒類動物沒有致病性。Baker等[26]曾報道了一名被海豹咬傷的水族館馴獸師的手指感染了支原體Mycoplasmaphocacerebrale造成疼痛和腫脹，而該支原體也從咬人的海豹前牙中分離出來，證實了支原體通過傷口從海豹傳染至人的過程。有報道稱動物支原體經(jīng)常從免疫功能低下的人群中分離出來，并對其造成感染[27-28]，且通常是由易感人群與家畜持續(xù)和密切接觸造成的。Armstrong等[29]曾報道了一位因子宮頸轉移癌接受抗腫瘤(和免疫抑制)化療的病人，患上了一種與她的寵物狗類似的呼吸道疾病?；颊咴c狗有過非常密切的接觸史。在狗和人的喉嚨里都有犬支原體(Mycoplasmacanis)，且都對這種支原體有血清學的反應。McCabe等[30]曾報道了一名獸醫(yī)在貓抓傷后患有軟組織蜂窩織炎，而從該獸醫(yī)感染的手中唯一分離出來的是一種未知的支原體，后來被證明是貓呼吸道支原體菌群的一部分。上述報道表明支原體在動物和人之間通過咬傷、抓傷和密切接觸傳播的可能，從而成為人潛在的病原菌。因此，支原體在人和動物不同物種之間轉移是可能的。

鑒于支原體廣泛地分布于動物中，目前對于動物是如何獲得支原體的尚待進一步研究。在處理相關生物材料時應考慮支原體可能通過交叉污染傳播的潛在危害。許多關于支原體跨物種屏障傳播的報道可反映出由于支原體的高突變率，其對不同宿主的適應性可能比之前認為的要更強。此外有免疫缺陷或遭受生理變化(如壓力)的人或動物，可能更容易感染外來支原體，從而產(chǎn)生潛在的致病后果[19]。

總之，本研究通過16S rRNA高通量測序技術發(fā)現(xiàn)帶魚腸道菌群中支原體為優(yōu)勢菌，且相對豐度較高。而作為人們經(jīng)常食用的魚類品種之一，在對帶魚進行處理和加工過程中，其腸道內容物極易暴露在環(huán)境中，存在支原體通過氣溶膠或接觸傳播污染的可能[31]。在目前沒有相關有效疫苗的情況下[32]，從而對人，尤其是免疫功能低下或手部有傷口的人群可能會造成潛在感染。因此，下一步需要擴大樣本量對我國東海帶魚腸道菌群做深入研究，明確支原體污染來源，在引起人們的關注和重視的同時做好相應的防護措施。