王程， 竇文芳， 何麗麗

江南大學藥學院，江蘇 無錫 214122

槲皮素(3，3′，4′，5，7五羥基黃酮)是一種以C6-C3-C6為基本碳架的黃酮類化合物，廣泛分布在植物中的花、葉、果實中，多以糖苷的形式存在[1]。目前國內外有許多關于槲皮素藥理活性的研究，發(fā)現其具有豐富的藥理活性，包括抗氧化及清除氧自由基[2]、抗炎[3]、抗癌[4]、降低血糖和保肝[5-7]等作用。但槲皮素的水溶性很差，幾乎不溶于水，在小腸吸收表面不易被主動吸收，生物利用度低[8]；Stahlhut等[9]發(fā)現體外槲皮素不穩(wěn)定，易降解，在培養(yǎng)基中所加入的槲皮素24 h內完全降解。為解決這一問題，目前主要利用糖基化、甲基化和羥基化反應來提高槲皮素分子的穩(wěn)定性和水溶性，進而提高其生物利用度[10]。其中糖基化反應是應用最為廣泛的化學反應。目前，槲皮素的糖苷化合物主要通過三種方式獲得：從天然植物中提取、化學合成和酶法合成[11-12]。其中酶法合成因其具有催化效率高、專一性強、 副產物少且對環(huán)境污染小等優(yōu)點逐漸受到關注，而酶法合成主要利用糖基轉移酶進行催化。

糖基轉移酶是一類能夠催化單糖、雙糖和糖復合物中糖鏈合成的一類酶。該類酶主要負責將活性供體(通常為NDP-糖)的單糖轉移到糖、蛋白質、脂質及各種雜環(huán)化合物上，從而形成特異的糖苷鍵[13]。由于多數糖苷類化合物存在于植物中，植物來源的糖基轉移酶研究較多。隨著對糖基轉移酶的研究不斷深入，近年來也發(fā)現很多來源于微生物的糖基轉移酶能夠催化合成多種糖苷類化合物。Liang等[14]發(fā)現枯草芽孢桿菌中的糖基轉移酶UGT109A1可以催化人參皂苷的C3-OH、C12-OH和C20-OH糖基化產生非天然人參皂苷。Pandey等[15]發(fā)現來自地衣芽孢桿菌DSM13的UDP-糖基轉移酶 YjiC可在體外作用于23種類黃酮。

本文主要研究來源于大腸桿菌的糖基轉移酶GT-1、GT-2以及蘇云金芽孢桿菌BTGT-1 3種糖基轉移酶對槲皮素的糖基化修飾，進而又對槲皮素及其糖苷的水溶性進行測定，并采用LPS誘導RAW264.7細胞作為體外炎癥模型[16-18]研究槲皮素及其糖苷產物的體外抗炎活性作用，以期為以后槲皮素糖基化工業(yè)化制備提供新的思路，為槲皮素的深入研究以及新藥研發(fā)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株與質粒EscherichiacoliBL21，重組表達載體pGEX4T-1/GT-1、pGEX4T-1/GT-2、pGEX4T-1/BTGT-1由實驗研究前期構建完成。糖基轉移酶GT-1、GT-2基因來源于大腸桿菌埃希菌，BTGT-1基因來源于蘇云金芽孢桿菌。3種糖基轉移酶的基因組數據來源于NCBI數據庫(https.//www.ncbi.nlm.nih.gov/)。小鼠單核巨噬細胞RAW264.7由無錫懷信生物科技有限公司饋贈。

1.1.2試劑與儀器 槲皮素購自成都德銳可生物科技有限公司；其他實驗試劑購自上海國藥集團；UDP-葡萄糖、槲皮素-N-乙酰-氨基葡萄糖、UDP-N-乙酰-氨基葡萄糖均由實驗室合成；異槲皮苷對照品、胎牛血清、高糖培養(yǎng)基DMEM、脂多糖LPS、CCK-8、NO試劑盒購自Sigma-Aldrich(中國)公司；IL-6、IL-1β 試劑盒購自杭州聯科生物科技股份有限公司；高效液相色譜儀(安捷倫公司，規(guī)格：1260)；超高相液相色譜串聯四級桿飛行時間質譜聯用儀(型號：MALDI SYNAPT MS，生產廠家：美國沃特世公司)。

1.2 方法

1.2.1重組蛋白的誘導表達與純化 分別挑取實驗研究前期構建的重組菌BL21/pGEX4T-1-GT-1、BL21/pGEX4T-1-GT-2、 BL21/pGEX4T-1-BTGT-1單菌落接種至50 mL 液體LB培養(yǎng)基中(氨芐終濃度100 μg·mL-1)，37 ℃培養(yǎng)過夜。按1% 接種至500 mL 液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8，加入終濃度為0.2 mmol·L-1的IPTG，25 ℃誘導過夜。離心收集菌體(8 000 r·min-1, 10 min,4 ℃)，-80 ℃保存菌體備用。稱取10 g菌體，加入Binding buffer(PBS:140 mmol·L-1NaCl，2.7 mmol·L-1KCl，10 mmol·L-1Na2HPO4，8 mmol·L-1KH2PO4)。采用超聲波破碎后，離心收集上清，通過 GST標簽柱，Elution buffer (50 mmol·L-1Tris-HCl，10 mmol·L-1還原型谷胱甘肽，pH 8.0)洗脫目的蛋白，蛋白純化產物經SDS-PAGE電泳分析。

1.2.2酶法催化槲皮素的糖基化 以槲皮素為糖基受體，UDP-葡萄糖、UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖為糖基供體。25 mL 反應體系包括：槲皮素0.5 mmol·L-1，糖基供體 1 mmol·L-1，MgCl2100 mmol·L-1，Tris-HCl 10 mmol·L-1，糖基轉移酶0.13 mg·mL-1，DTT 15 mmol·L-1。30 ℃水浴6 h，槲皮素含量經HPLC檢測,并且以異槲皮苷為對照品，對產物進行鑒定。

1.2.3槲皮素糖苷產物液相色譜-質譜聯用(LC-MS) 對純化的槲皮素糖苷產物進行質譜檢測分析。采用負離子化方式，毛細管電壓3.5 kV，加熱溫度100 ℃，檢測槲皮素糖苷分子量。

1.2.4槲皮素和槲皮素糖苷產物的水溶性比較 分別稱取槲皮素和槲皮素糖苷凍干粉各10 mg，加入50% DMSO溶液10 mL，配置成濃度1 mg·mL-1母液，按照濃度1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、50.00 μg·mL-1濃度梯度稀釋，通過HPLC檢測，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制槲皮素和槲皮素糖苷的濃度標準曲線。稱取過量槲皮素和槲皮素糖苷，加入蒸餾水，超聲30 min，室溫放置72 h，離心，取飽和溶液上清，HPLC檢測上清槲皮素和槲皮素糖苷含量，根據標準濃度曲線，計算其水溶液溶解度。

1.2.5槲皮素和槲皮素糖苷產物體外細胞抗炎活性研究 探究槲皮素和槲皮素糖苷對脂多糖LPS 誘導小鼠巨噬細胞瘤細胞系 RAW264.7 分泌炎癥因子NO、 IL-1β和IL-6的影響，評價其抗炎效果。

①CCK法[19]檢測槲皮素和槲皮素糖苷產物對RAW264.7細胞毒性作用。細胞經過復蘇和傳代培養(yǎng)后，將對數生長期的RAW 264.7細胞接種于96孔板中，密度為0.8×104個·孔-1，每孔100 μL，不接種細胞組設置3個復孔作為空白對照。過夜培養(yǎng)待細胞狀態(tài)穩(wěn)定貼壁后去上清，分別加入100 μL終濃度為10、20、30、40、50 μmol·L-1的槲皮素和槲皮素糖苷樣品(溶于細胞培養(yǎng)基)，每個濃度3個復孔;不加藥組和空白組各3個復孔，分別加新鮮細胞培養(yǎng)基，每孔100 μL，孵育24 h。每孔加入10 μL CCK-8，37 ℃，5% CO2孵育1～2 h。酶標儀450 nm測得吸光度(OD值)。并計算細胞存活率，計算公式為：

細胞存活率=(A加藥-A空白)/(A不加藥- A空白)×100%

②槲皮素和槲皮素糖苷產物對RAW264.7 分泌NO、IL-1β和IL-6的影響。取對數生長期的RAW 264.7細胞接種于24孔板中，密度為5×105個·孔-1，每孔0.5 mL。過夜培養(yǎng)待細胞狀態(tài)穩(wěn)定貼壁后去上清，分別加入0.5 mL終濃度為10、20、30 μmol·L-1的槲皮素和槲皮素糖苷樣品(溶于細胞培養(yǎng)基)，10 μmol·L-1地塞米松作為陽性對照(溶于細胞培養(yǎng)基)，每個濃度3個復孔，不加藥組3個復孔作為空白對照，孵育4 h，棄上清，每孔加入0.5 mL終濃度為1 μg·mL-1的LPS(溶于不含血清的細胞培養(yǎng)基)，37 ℃，5% CO2孵育15 h。離心收集上清備用。分別用NO試劑盒和IL-1β、IL-6 ELISA試劑盒檢測NO、IL-1β和IL-6含量。

2 結果與分析

2.1 重組蛋白的誘導表達與純化產物的SDS-PAGE電泳分析

已知GST標簽大小為26 kD， GT-1、GT-2、 BTGT-1 3種目的蛋白與GST標簽的融合蛋白大小分別為54.8、60.5、56.4 kD。純化產物通過SDS-PAGE電泳分析，3種純化蛋白條帶大小與預期一致；GT-1酶濃度較低，僅為0.32 mg·mL-1，GT-2和BTGT-1濃度分別為1.71、1.22 mg·mL-1。

圖1 3種糖基轉移酶的純化SDS-PAGE 結果Fig.1 Purification SDS-PAGE results of three glycosyltransferases

A：槲皮素與UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖反應圖譜；B：異槲皮苷標準品；C：GT-1催化槲皮素和UDP-葡萄糖反應圖譜；D為：GT-2催化槲皮素和UDP-葡萄糖反應圖譜；E：BTGT-1催化槲皮素和UDP-葡萄糖反應圖譜。

2.2 槲皮素糖基化反應

HPLC檢測結果顯示，由圖2 C、D、E可以看出，當以UDP-葡萄糖為糖基供體時，反應6 h，HPLC圖譜顯示在10.2 min左右為槲皮素，3.7 min左右出現新的吸收峰，表明酶促反應生成了新的物質。且3種糖基轉移酶催化生成的產物吸收峰位置相同，表明生成同一物質。圖2A顯示當以UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖為糖基供體時，沒有新的物質生成。以上表明3種糖基轉移酶僅能催化槲皮素和UDP-葡萄糖發(fā)生糖基化反應，表明3種酶的催化底物選擇專一性強。經計算得出GT-1、GT-2和BTGT-1催化反應的產物生成率分別為5.33%、 15.18%和63.82%。整個反應過程中副產物少，且生成單一產物。另通過對比槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖(異槲皮苷)對照品 (圖2B)，二者在370 nm下吸收峰的保留時間分別為3.66和3.68 min，可以判斷反應生成的槲皮素糖苷為異槲皮苷。

2.3 槲皮素糖苷的質譜分析

為進一步確定酶催化槲皮素和UDP-葡萄糖發(fā)生糖基化反應，對酶促反應液做液相-質譜(LC-MS)檢測分析。結果如圖3所示，已知槲皮素分子量為302，葡萄糖分子量為180，當以UDP-葡萄糖為糖基供體時，槲皮素與葡萄糖結合形成糖苷鍵，生成1分子水(H2O)，因此槲皮素糖苷的分子量為464。因檢測使用負離子源會失去氫，分子量減1，而反應液中有槲皮素殘留，故圖譜上在463.2出現特異峰，為槲皮素-葡萄糖苷。檢測結果證明酶催化槲皮素和UDP-葡萄糖生成槲皮素-葡萄糖苷。

圖3 槲皮素糖苷產物的LC-MS檢測Fig.3 Determination of quercetin glycoside by LC-MS

2.4 槲皮素和槲皮素糖苷產物的水溶性測定

水溶性檢測結果如表1所示。在異槲皮苷和槲皮素-N-乙酰-D-氨基葡萄糖水溶性相對于槲皮素分別提高了13.8倍和15.4倍。由此可以得出槲皮素經糖基化后，其水溶性得到較大提高。

表1 3種化合物的標準濃度曲線Table 1 Standard concentration curves for three compounds

2.5 CCK法檢測槲皮素和槲皮素糖苷產物對RAW264.7細胞毒性作用

如表2所示，3種化合物濃度低于30 μmol·L-1時對細胞毒性作用與不加藥組相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。當濃度大于30 μmol·L-1時，3組的細胞存活率極顯著低于不加藥組(P<0.01)，同等濃度下2種槲皮素糖苷組細胞生存率高于槲皮素。表明在一定濃度范圍內，槲皮素經糖基化后對細胞毒性具有一定的減弱作用。

表2 3種化合物對RAW264.7的毒性作用Table 2 The toxic of three compounds on RAW264.7

注：*和**表示與不加藥組相比差異在P<0.05和P<0.01水平具有統(tǒng)計學意義。

2.6 3種化合物對LPS誘導RAW264.7細胞釋放NO、IL-1β、IL-6 的影響

細胞經致炎藥物LPS刺激15 h 后，NO、IL-1β、IL-6(表3)分泌量均極顯著高于空白對照組(P<0.01)。3種化合物組細胞經4 h 不同濃度的保護后再經LPS刺激15 h 后，當濃度為10、20、30 μmol·L-1時，NO、IL-1β、IL-6分泌量顯著低于LPS組(P<0.01)，但顯著高于空白對照組(P<0.01)，且呈劑量依賴性。表明在一定濃度范圍內，3種化合均具有一定的抗炎作用。

3 討論

利用微生物來源的3種糖基轉移酶GT-1、GT-2和BTGT-1對槲皮素進行糖基化修飾，發(fā)現3種酶僅能催化槲皮素和UDP-葡萄糖為底物生成槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖(異槲皮苷)，GT-1、GT-2和BTGT-1催化反應的產物生成率分別為5.33%、15.18%和63.82%。同時也對槲皮素、異槲皮苷和實驗室保存的槲皮素-N-乙酰-D-氨基葡萄糖進行水溶性以及體外細胞抗炎活性評價。發(fā)現槲皮素經糖基化后其水溶性得到較大提高，異槲皮苷和槲皮素-N-乙酰-D-氨基葡萄糖水溶性分別是槲皮素的13.8倍和15.4倍。同等濃度下槲皮素糖苷對RAW264.7 細胞的毒性作用低于槲皮素。且3種化合物在一定濃度范圍內對LPS誘導RAW264.7細胞釋放NO、IL-1β、IL-6 都有顯著的抑制作用，且呈劑量依賴性。表明3種化合物都具有一定的抗炎作用，該研究為槲皮素糖基化制備提供了新的思路，為槲皮素的新藥研發(fā)奠定了基礎。

表3 3種化合物對LPS誘導RAW264.7細胞釋放NO、IL-1β、IL-6 的影響Table 3 Effects of the three compounds on release of NO、IL-1β、IL-6 in LPS-reduced RAW264.7 cells

注：同列數據后不同大寫字母表示差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)

槲皮素作為黃酮類化合物中的代表化合物，廣泛存在于紅洋蔥、茶和蕓苔屬蔬菜以及許多種子、棉花和葉子中，具有豐富的藥理活性[1]，包括抗氧化、抗癌、抗炎、抗腫瘤、降低血壓等作用[2-5]。然而槲皮素的水溶性極差，幾乎不溶于水，生物利用度差[6]。可以考慮對槲皮素進行糖基化修飾提高其水溶性，進而提高槲皮素的生物利用度。而酶法合成槲皮素糖苷是一種高效的方法。RAW264.7是小鼠巨噬細胞，經LPS刺激可以產生多種炎癥因子如NO、IL-1β、IL-6等[20]，通過探究槲皮素及其糖苷對炎癥因子的影響評價其抗炎活性。

本研究利用基因來源于大腸桿菌的GT-1、GT-2以及蘇云金芽孢桿菌的BTGT-1 3種糖基轉移酶催化合成槲皮素糖苷，經誘導表達和純化獲得3種糖基轉移酶。研究發(fā)現3種糖基轉移酶都能夠催化以槲皮素和UDP-葡萄糖為底物生成槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖(異槲皮苷)，但不能催化槲皮素和UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖發(fā)生反應，結果表明3種酶的底物選擇專一性強。另通過對槲皮素及槲皮素糖苷水溶性和體外抗炎活性評價，發(fā)現槲皮素經糖基化后其水溶性得到較大提高。而體外細胞抗炎活性實驗發(fā)現槲皮素具有一定的抗炎活性，且經糖基化修飾后仍能保持其抗炎活性。