石驍昵　李婷　馬宇熙

摘要：目的? 研究超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-MS/MS）法測(cè)定蔬菜中多菌靈含量的不確定度。方法? 色譜柱為Waters ACQUITY BEH C18，1.7μm，柱溫：35℃;進(jìn)樣量5 μl;流動(dòng)相：A為乙腈，B為0.05%甲酸水;流速：0.3 ml。梯度洗脫條件：0～5 min 30% A，70% B;5～6 min 95% A，5% B;6～7 min 30% A，70% B，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)不確定來(lái)源進(jìn)行分析，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線模型，計(jì)算各變量的不確定度、合成不確定度、擴(kuò)展不確定度。結(jié)果? 超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定蔬菜中多菌靈含量的不確定度，影響最大的是標(biāo)準(zhǔn)溶液配制稀釋過(guò)程中產(chǎn)生的不確定度。相對(duì)不確定度為0.233，在置信度為95%時(shí)，覆蓋因子k=2，擴(kuò)展不確定度為4.66%。結(jié)論? UPLC-MS/MS法測(cè)定多菌靈含量對(duì)測(cè)量不確定貢獻(xiàn)最大的是標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和稀釋過(guò)程中產(chǎn)生的不確定度，其次是標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合時(shí)產(chǎn)生的不確定度。因此在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要嚴(yán)格操作規(guī)程，減少人為誤差。

關(guān)鍵詞：多菌靈;蔬菜;超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用;不確定度

中圖分類(lèi)號(hào)：TQ450.7? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.03.054

文章編號(hào)：1006-1959（2020）03-0162-03

Evaluation of Uncertainty in Determination of Carbendazim in Vegetables by UPLC-MS/MS

SHI Xiao-ni，LI Ting，MA Yu-xi

（Urumqi Center for Disease Control and Prevention，Urumqi 830026，Xinjiang，China）

Abstract：Objective? To study the uncertainty of determination of carbendazim in vegetables by ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry （UPLC-MS/MS）. Methods? The chromatographic column was Waters ACQUITY BEH C18， 1.7 μm， column temperature： 35 °C; injection volume was 5 μl; mobile phase： A was acetonitrile， B was 0.05% formic acid water; flow rate： 0.3 ml.Gradient elution conditions： 0～5 min 30% A， 70% B; 5～6 min 95% A， 5% B; 6～7 min 30% A， 70% B. Multi-reaction monitoring mode was used for detection. Analyze the sources of uncertainty， establish a standard curve model， and calculate the uncertainty， synthetic uncertainty， and expanded uncertainty of each variable.Results? The uncertainty of the determination of carbendazim in vegetables by ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry combined with the most significant factor was the uncertainty generated during the preparation and dilution of standard solutions. The relative uncertainty is 0.233.When the confidence is 95%， the coverage factor k=2 and the expanded uncertainty is 4.66%.Conclusion? The most significant contribution to the measurement uncertainty of the determination of carbendazim by the UPLC-MS/MS method is the uncertainty generated during the preparation and dilution of the standard solution， followed by the uncertainty generated during the fitting of the standard curve. Therefore， it is necessary to strictly operate procedures during the experiment to reduce human error.

Key words：Carbendazim;Vegetables;Ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry; Uncertainty

在我國(guó)植物殺菌劑已廣泛使用于水果蔬菜種植，其中多菌靈是一種廣譜性殺菌劑，屬于內(nèi)吸性殺菌劑，通過(guò)吸收蔬菜體內(nèi)產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，從而起到殺菌作用。但多菌靈在人體內(nèi)蓄積，可能引起嘔吐等癥狀，且對(duì)生殖系統(tǒng)有很大影響[1]。多菌靈產(chǎn)生的積累性及生物毒性已經(jīng)引起國(guó)家的重視，為了保證蔬菜質(zhì)量安全，我國(guó)對(duì)農(nóng)藥殘留實(shí)施了嚴(yán)格的檢測(cè)，并對(duì)不同農(nóng)作物有一定的限值要求[2，3]，這就對(duì)多菌靈檢測(cè)結(jié)果的可信度和準(zhǔn)確度提出了很高的要求。多菌靈的檢測(cè)方法有高效液相色譜法、氣相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[4-6]，但以上方法的適用范圍較小，對(duì)于復(fù)雜基質(zhì)的農(nóng)藥殘留測(cè)定干擾較大。近年來(lái)隨著檢測(cè)技術(shù)的日益更新，超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-MS/MS）法在測(cè)定農(nóng)藥方面得到廣泛應(yīng)用[7-9]，UPLC-MS與MS聯(lián)用，可以充分發(fā)揮兩者的優(yōu)勢(shì)，與傳統(tǒng)的高效液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）相比，顯著提高了定量分析的重復(fù)性和可靠性以及定性分析的準(zhǔn)確性，較好地適應(yīng)了現(xiàn)代藥物研究對(duì)自動(dòng)化、高通量分析的需求，已成為藥物分析的重要方法之一[10]。本研究主要探討超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-MS/MS）法測(cè)定蔬菜中多菌靈含量的不確定度，現(xiàn)報(bào)道如下。

1儀器與試劑

1.1儀器? Xevo-TQ-S Micro超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Waters公司），AE240天平（瑞士Mettler），KQ-500E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），3-30KS冷凍離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司），AH-20全自動(dòng)均質(zhì)器（睿科儀器有限公司），Milli-Q Integral 10超純水儀（美國(guó)Millipore公司）。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑? 乙腈：色譜純，德國(guó)Sigma公司;無(wú)水甲酸：色譜純，天津光復(fù)精細(xì)化工研究所;無(wú)水硫酸鎂、氯化鈉：優(yōu)級(jí)純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司;PSA CNW;GCB，Agela Technoiogies;0.22 μm微孔過(guò)濾膜，安譜。多菌靈：Dr.Ehrenstorfer GmbH，純度99.6%。

2方法

2.1樣品前處理

2.1.1樣品來(lái)源? 市售綠葉蔬菜韭菜、茼蒿、葉用萵苣、油麥菜、小白菜共35份。

2.1.2樣品前處理? 稱(chēng)取5 g小白菜樣品加入10 ml乙腈，充分震蕩后超聲10 min;加入1 g NaCl，再次充分震蕩1 min，再加入4 g無(wú)水MgSO4迅速渦旋1 min。以10000 r/min冷凍離心10 min，取上清液1.0 ml，加入400 mg PSA，10 mg GCB，渦旋1 min，10000 r/min離心5 min，取上清液，過(guò)膜，上機(jī)測(cè)定。

2.2儀器條件

2.2.1質(zhì)譜條件? 離子源：ESI正離子模式;離子源溫度：150℃;去溶劑氣流量：1000 L/h;去溶劑氣溫度：450℃;錐孔氣流量：50 L/h;監(jiān)測(cè)方式：MRM模式，掃描采集參數(shù)：母離子：192.1 m/z;定量離子/碰撞能量：132.1/28 V;定性離子/碰撞能量：160/18 V;錐孔電壓：33 V;保留時(shí)間：0.46 min。

2.2.2色譜條件? 色譜柱為Waters ACQUITY BEH C18，1.7 μm，柱溫：35℃;進(jìn)樣量5 μl;流動(dòng)相：A為乙腈，B為0.05%甲酸水;流速：0.3 ml。梯度洗脫條件：0～5 min 30% A，70% B;5～6 min 95% A，5% B;6～7 min 30% A，70% B。

2.3標(biāo)準(zhǔn)溶液配制? 稱(chēng)取10.04 mg Dr.Ehrenstorfer GmbH標(biāo)準(zhǔn)品，置于10.00 ml容量瓶，使用乙腈定容，配制成1 mg/ml多菌靈儲(chǔ)備液。取1.00 ml儲(chǔ)備液于100 ml容量瓶，用乙腈稀釋配制為濃度為10 μg/ml的中間液。取中間液適量，用空白基質(zhì)配制成測(cè)定濃度為0.5、1.0、5.0、10、20、40、80、100 μg/L的基質(zhì)系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

3結(jié)果

3.1測(cè)定結(jié)果計(jì)算? 本文中測(cè)定物質(zhì)為多菌靈，其含量按以下公式計(jì)算：Xmg/kg=

注：X：待測(cè)物濃度（mg/kg）;C：樣品中待測(cè)物濃度（μg/l）（儀器直讀）;V：樣品提取液體積10.00（ml）;M：樣品質(zhì)量5.00（g）。

3.2不確定度來(lái)源分析? 影響不確定的因素有以下3個(gè)方面：①多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品引入的不確定度，其中包括多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品稱(chēng)量、稀釋、定容引入的不確定度;②標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合引入的不確定度;③樣品制備和測(cè)定以及回收率引入的不確定度[11，12]。

3.2.1多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品稱(chēng)量引入的不確定度[ur （m ）]? 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)所用天平的檢定證書(shū)，檢定分度值e=0.1 mg，最大允許誤差為0.5e，即為0.05 mg。按均勻分布，包含因子k=，標(biāo)準(zhǔn)品稱(chēng)量引起的不確定度為ur=，式中M為標(biāo)準(zhǔn)品稱(chēng)取量（mg），因此標(biāo)準(zhǔn)品稱(chēng)量引入的不確定度為ur （m ）=0.00287。

3.2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度[ur （C ）]? ①容量瓶引起的不確定度：配制標(biāo)準(zhǔn)溶液所需的容量瓶為10 ml和100 ml。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)所用玻璃器皿的檢定證書(shū)，其中10 ml（V1）A級(jí)容量瓶和100 ml（V2）A級(jí)容量瓶最大允許誤差α均為±0.02ml，因質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)室溫度控制恒定，故試劑及標(biāo)準(zhǔn)都在相同的環(huán)境條件下，可以忽略由溫度引入的不確定度。按均勻分布，包含因子k時(shí)容量瓶引入的不確定度為ur （V ）=，x為容量瓶體積（ml），即10 ml容量瓶ur （V1 ）=0.001154，100 ml容量瓶引起的不確定度ur （V2 ）==0.000116。②移液器引起的不確定度：配制標(biāo)準(zhǔn)溶液所需的移液器量2～10 μl（p1），50～200 μl（p2），200～1000 μl（p3），根據(jù)檢定證書(shū)移液器的允許誤差α分別為±0.10 μl，±1.6μl，±8μl，按照均勻分布，k=，不確定度為分別為ur （p ）=，x為移液器最大量程（μl）。即3種移液器引入的不確定度分別為ur （p1 ）==0.005773，ur（p2 ）==0.004618，ur（p3 ）==0.004618。

由①②可得：在配制標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)，使用1次10 ml容量瓶，2次100 ml容量瓶，2～10 μl移液器使用2次（1次5 μl，1次10 μl），50～200 μl移液器使用3次（1次50 μl，1次100 μl，1次200 μl），200～1000 μl移液器使用4次（1次400 μl，1次800 μl，2次1000 μl），其相對(duì)不確定度是：

3.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度[ur （b ）]? 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線共8個(gè)點(diǎn)（m=8），每個(gè)點(diǎn)測(cè)定3次，共測(cè)定24次，結(jié)果見(jiàn)表1。

共擬合3條標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：a為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，b為標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距平均值。三條曲線分別為y1=7282.72x+76548;y2=7466.96x+68572;y3=7346.91x+80467。b=75196， a=7358.86。

x為基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的理論平均值， x=32.0625，j為每組基質(zhì)曲線的序號(hào)（j=1、2、3），i為測(cè)定基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的序數(shù)（i=1，2，3……N）：自相關(guān)的方差為SXX=

3.3樣品測(cè)量重復(fù)性和回收率引入的不確定度做一份空白樣品的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)量為0.10 mg/kg，每份樣品測(cè)定6次，計(jì)算出多菌靈含量（mg/kg）及回收率（%）、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（%），結(jié)果見(jiàn)表2。

3.3.1回收率引入的不確定度[ur （R ）]u （R ）==0.390856，其中S（R）為回收率的標(biāo)準(zhǔn)偏差，回收率相對(duì)不確定度ur （R ）==0.004367，其中 R為回收率的平均值。

3.3.2樣品重復(fù)性引入的不確定度[ur （y ）]ur （y ）==0.004789，其中S（X）為樣品測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)偏差， X為樣品測(cè)定平均值。

3.4合成不確定度? 多菌靈測(cè)定的相對(duì)不確定度為：u=0.233095。

3.5相對(duì)擴(kuò)展不確定度? 置信區(qū)間95%，對(duì)于本實(shí)驗(yàn)包含因子選擇k=2，則擴(kuò)展不確定度U= ur（X）×k =0.46619。

4總結(jié)

使用UPLC-MS/MS測(cè)定蔬菜中的多菌靈含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對(duì)不確定度為0.233，在置信度為95%時(shí)，覆蓋因子k=2，擴(kuò)展不確定度為4.66%，小于16.8%的要求值。通過(guò)對(duì)以上各分量不確定度的研究，發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)中對(duì)測(cè)量不確定影響的最大分量是標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和稀釋過(guò)程中產(chǎn)生的不確定度，其次是標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合時(shí)產(chǎn)生的不確定度。因此在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)實(shí)驗(yàn)所用量器的檢定，嚴(yán)格操作規(guī)程，減少人為誤差，從而達(dá)到減小測(cè)定結(jié)果的不確定度，保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確。

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收稿日期：2019-10-29;修回日期：2019-11-12

編輯/杜帆