張曉云,任 可,李維蛟

(1.云南中醫(yī)藥大學/云南省道地瀕危中藥材繁育與栽培工程技術(shù)研究中心,云南 昆明 650500； 2.云南農(nóng)業(yè)大學,云南 昆明 650500)

0 引言

云南重樓[ParispolyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.) Hand.-Mazz.],為百合科重樓屬植物,是《中華人民共和國藥典》2015版收錄的重樓的原材料[1],屬于我國特有的一種名貴藥用植物,主要分布在云南部分地區(qū),生于海拔1400～3100 m的常綠闊葉林、云南松、竹林、灌叢、草坡背陰處或陰濕山谷中,為陰生植物[2]。云南重樓是藥用重樓的植物來源之一,以干燥根莖入藥,具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚的功效,是抗病毒沖劑、云南白藥、四川白藥、宮血寧、奪命丹等一些重要中成藥的主要原料?，F(xiàn)代研究表明,該藥具有止血、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等廣泛的藥理活性[3]。云南重樓的主要藥用成分為甾體皂苷類物質(zhì),其具多種生理活性,有很高的藥用價值和開發(fā)潛力[4,5]。重樓作為我國許多重要中成藥的原料,需求量逐年增加,但由于其生長緩慢,繁殖系數(shù)低等,其蘊藏量大大減少,已逐漸難以滿足生產(chǎn)所需。近年來的研究表明,許多植物的內(nèi)生真菌可以產(chǎn)生與寄主藥用植物相同的藥用成分。目前對云南重樓內(nèi)生真菌的研究還非常淺薄,研究主要集中在篩選產(chǎn)甾體皂苷菌株及其他活性菌株方面[6,7],而對其內(nèi)生真菌的分離、鑒定以及多樣性等方面的研究則鮮有報道。我們從云南重樓根、根狀莖、葉3個部位的組織塊中分離出內(nèi)生真菌,并通過ITS序列分析對這些內(nèi)生真菌進行了屬及種的鑒定，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

云南重樓采集于云南省曲靖市師宗縣,栽培于云南中醫(yī)藥大學實驗大棚中,經(jīng)鑒定,均為藥用植物云南重樓(圖1)。

1.2 實驗方法

1.2.1 云南重樓內(nèi)生真菌的分離純化 選擇健康的云南重樓,將其主根、莖和葉三個部位剪離分開,分別將主根、莖及葉的組織塊表面洗凈,拭干表面水分,迅速移至超凈工作臺上利用植物病原分離的快速消毒裝置(授權(quán)公告號:CN202620294U)進行表面消毒。在無菌操作臺下按如下步驟進行:切取同一個植物組織若干份,每一份植物組織塊長為3～5 mm；選取濾紙或者透氣性及耐水性好的紙巾,剪取邊長為3～4 cm的紙塊,將剪取好的植物組織塊用剪好的紙塊包住,嚴格按照植物病原分離的快速消毒裝置說明書中所述的步驟對植物組織進行表面消毒(首先用75%乙醇進行處理,莖處理30 s，主根處理50 s，葉處理30 s；然后用0.1%升汞進行處理,對莖、主根、葉分別處理5、15、3 min)。將組織塊小塊接種于PDA培養(yǎng)基上,每皿接種2塊,置28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～30 d,當觀察到培養(yǎng)基上有從組織塊內(nèi)部向周圍長出菌絲時,采用尖端菌絲挑去法把真菌轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)、轉(zhuǎn)接,待純化后編號,備用。在分離過程中設(shè)置對照組,將經(jīng)表面消毒的組織塊在空白培養(yǎng)基上涂搽,使組織塊各表面接觸到培養(yǎng)基,與接種好的培養(yǎng)皿一起培養(yǎng)；若對照培養(yǎng)皿上未長出菌落,則說明表面消毒徹底。

A:植株;B:葉片;C:莖;D:主根及須根。圖1 藥用植物云南重樓

1.2.2 云南重樓內(nèi)生真菌的傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定 對分離到的內(nèi)生真菌進行傳統(tǒng)形態(tài)學觀察,主要觀察并記錄菌落在平板上的生長速度、菌落形態(tài)、顏色、質(zhì)地、是否有色素分泌到培養(yǎng)基中。預先將蓋玻片插入PDA培養(yǎng)基中,待真菌長滿培養(yǎng)皿后,選取較好的插片,以無菌水為浮載劑制成玻片標本,然后在顯微鏡下觀察菌絲的粗細,分生孢子器的著生部位、形狀、類型、大小、產(chǎn)孢方式,以及分生孢子的出芽方式、是否有隔、大小、形狀、表面特征、色澤等形態(tài)特征。

1.2.3 云南重樓內(nèi)生真菌的分子生物學鑒定和檢測 用CTAB法提取全基因組DNA:用刮刀刮取平板培養(yǎng)7 d的菌落菌絲,置于1.5 mL離心管中,加500 μL經(jīng)65 ℃預熱的CTAB提取緩沖液及少量石英砂,用玻棒研磨5～10 min后,65 ℃水浴1 h;再加入500 μL氯仿-異戊醇(24∶1)充分混勻后,以12000 r/min離心15 min;取上清液,加入等體積的氯仿-異戊醇(24∶1),混勻后,在4 ℃下以12000 r/min離心15 min,重復抽提1次;加入2/3體積的異丙醇(400 μL),混勻,在出現(xiàn)沉淀后,在4 ℃下以10000 r/min離心2 min,重復洗滌1次;棄去液相,加入400 μL 70%乙醇,震蕩洗滌,以10000 r/min離心2 min,重復洗滌1次;在40～60 ℃下真空干燥DNA約10 min;加入100 μL TE緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA,pH 8.0)。在37 ℃下溶解DNA樣品,并于-20 ℃下保存。

用PCR擴增菌株的ITS區(qū)段，通用引物為ITS4、ITS5；以真菌基因組的DNA為模板,擴增菌株的ITS區(qū)段。PCR擴增體系為50 μL,含DNA模板1 μL、去離子水33.5 μL、10×PCR buffer 5 μL、10 μmol/L ITS4 1 μL、ITS5 1 μL、10 mmol/L dNTPs 4 μL、25 mmol/L MgCl24 μL、TaqDNA酶0.5 μL。PCR反應程序為：95 ℃預變性3 min；94 ℃變性40 s,52 ℃退火50 s,72 ℃延伸1 min,共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA凝膠電泳分離純化,將回收產(chǎn)物送昆明擎科生物有限公司測序。用每個菌株的ITS序列作為靶序列,在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中用Blast程序來搜索同源序列,挑選與菌株序列最相近的參考序列。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌的分離結(jié)果

從6個云南重樓樣品中共獲得26個真菌分離物,根據(jù)菌落的生長速率、形態(tài)、顏色,以及菌絲、分生孢子等顯微形態(tài)特征,將分離純化后的內(nèi)生真菌劃分為9類；從每類中選取1株具有代表性的菌株進行形態(tài)學觀察,共9株，編號為1～9，見圖2。采用濾紙片法將菌株保存在-20 ℃下。

A:1號菌; B:2號菌; C:3號菌; D:4號菌; E:5號菌; F:6號菌; G:7號菌; H:8號菌; I:9號菌。圖2 9類內(nèi)生真菌菌落的形態(tài)

2.2 內(nèi)生真菌分子鑒定結(jié)果

從云南重樓中共分離到內(nèi)生真菌26株,經(jīng)分子生物學鑒定，將它們分為8屬9種(表1)，其中優(yōu)勢菌種為1號菌和3號菌,分別被鑒定為尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)和博寧炭疽菌(Colletotrichumboninense),分離率分別為23.07%和19.23%;從根中分離到2株,鑒定為1屬1種,為球毛殼菌(Chaetomiumglobosum)(表2)。

對優(yōu)勢菌種1號菌和3號菌以及從主根中分離出的9號菌進行形態(tài)鑒定和分子鑒定。1號菌的形態(tài)特征如圖2A所示,菌落為類圓形,有突起；菌落粉白色,略帶有紫色；菌落背面白色,有少數(shù)較大黑點；菌落生長速度快，絮狀菌絲白色質(zhì)密。將該真菌菌株的ITS全序列(圖3)提交到GenBank,與其它真菌的ITS全序列進行比對,發(fā)現(xiàn)1號菌株與尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)序列的相似度達99%。綜合形態(tài)和分子鑒定結(jié)果,確定1號菌株為尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)。

表1 云南重樓內(nèi)生真菌的種類

3號菌的形態(tài)特征如圖2C所示,菌絲白色質(zhì)密,菌落類圓形,粉白色,有多數(shù)黑色團狀突起,背面黃色,可見多數(shù)小黑點,生長速度快。將該真菌的ITS全序列(圖4)提交到GenBank核酸序列庫中,與GenBank中其它真菌的ITS全序列進行比對,發(fā)現(xiàn)3號菌株與博寧炭疽菌(Colletotrichumboninense)序列的相似度為99%。綜合形態(tài)和分子鑒定結(jié)果,確定3號菌株為博寧炭疽菌(C.boninense)。

表2 云南重樓不同部位內(nèi)生真菌的數(shù)量與種類分布

圖3 1號菌的ITS全序列

圖4 3號菌的ITS全序列

9號菌的形態(tài)特征如圖2I所示,菌絲淺黃色,氣生菌絲發(fā)達,菌落類圓形,生長速度較快,背面白色。將該真菌的ITS全序列(圖5)提交到GenBank核酸序列庫,與其中其它真菌的ITS全序列進行比對,發(fā)現(xiàn)9號菌與球毛殼菌(Chaetomiumglobosum)序列的相似度為99%。綜合形態(tài)和分子鑒定結(jié)果,確定9號菌株為球毛殼菌(C.globosum)。

3 討論

本實驗對云南重樓的內(nèi)生真菌進行了分離、鑒定分析,由于所分離云南重樓的數(shù)量、年齡、分離手段的限制,樣品中絕大多數(shù)內(nèi)生真菌并未被分離出來，尤其是主根及莖中內(nèi)生真菌的分離率極低甚至為0%,需要進一步研究和摸索培養(yǎng)條件。其實造成菌種分離困難的因素有很多,如:培養(yǎng)基單一,不同真菌對生存環(huán)境的要求不盡相同;其次,有些真菌專一性很強,不能在人工培養(yǎng)條件下生長,即使使用不同的培養(yǎng)基也不能把植物組織中所有的內(nèi)生真菌分離出來,而且有些內(nèi)生真菌是非可培養(yǎng)的,只有在混合培養(yǎng)時才能生長,純培養(yǎng)反而對其生長不利[7]。

內(nèi)生真菌的鑒定較困難,部分內(nèi)生真菌在人工培養(yǎng)基上不產(chǎn)生可育性孢子,甚至導致菌絲體死亡而造成菌種丟失。已有的研究結(jié)果表明,內(nèi)生真菌中不產(chǎn)孢菌株的比例高達41.3%,因此對于這些菌株須結(jié)合ITS序列分析進行鑒定[8]。2013年王茜等[2]從云南重樓中分離出749株內(nèi)生真菌,其中從根中分離出133株,從葉中分離出231株；分離到的內(nèi)生真菌以鐮刀菌屬(Fusarium)和刺盤孢屬(Colletotrichum)為優(yōu)勢種群,分別占總菌株數(shù)的11.62%、8.95%。本實驗中的優(yōu)勢菌為鐮刀菌屬真菌尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)和刺盤孢屬真菌博寧炭疽菌(Colletotrichumboninense),分離率分別為23.07%和19.23%,與王茜等的研究結(jié)果相似。與之相比,本實驗分離出3個不同的菌株,分別為蘭伯特盤菌屬菌株、柔金絲和Pallidocercosporacrystallina。但此次實驗因中途超凈工作臺被黑根霉污染,并沒有成功將從根狀莖中長出的內(nèi)生真菌純化出來。

植物內(nèi)生真菌普遍存在于植物界,它們長期生活在宿主植物體內(nèi),其數(shù)量和種類因寄主和環(huán)境的不同而有顯著差異[9,10]。內(nèi)生真菌與宿主協(xié)同進化,在演化過程中形成了密切的互惠共生關(guān)系,對宿主的一生有著不可代替的作用。經(jīng)研究,內(nèi)生真菌具有促進宿主植物的生長發(fā)育和生物量積累,增強宿主植物的抗病蟲害能力,提高宿主植物的抗逆性等生物學作用[11,12]。此外,內(nèi)生真菌能夠通過分泌化感物質(zhì)抑制其他各植物的生長,從而提高宿主在群落中的競爭能力[13]。近年來,對內(nèi)生真菌的相關(guān)研究越來越火熱,內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物的研究也深受學者們的喜愛。經(jīng)研究,內(nèi)生真菌能產(chǎn)生豐富的代謝產(chǎn)物,主要為萜類、生物堿類、芳香類、肽類等化合物,且具有抗菌、抗腫瘤、抗氧化、殺蟲、促生長、提高免疫活性及抗病毒等生物活性[13,14]。植物內(nèi)生真菌是一個巨大的微生物新資源,在未來會有多方面的發(fā)展和應用,是人類擁有的寶貴財富,在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥以及新能源開發(fā)等領(lǐng)域的應用也越來越廣泛。雖然對植物內(nèi)生真菌的研究在不斷地深入,也取得了一些成果，但是,植物內(nèi)生真菌的研究現(xiàn)在還處于起步階段,還有許多問題需要進行深入系統(tǒng)的研究。

近年來，不斷有學者從重樓中分離出有價值的內(nèi)生真菌,如:曹曉冬等從云南重樓根狀莖中分離到133株內(nèi)生真菌,對其中的7株真菌進行了生物學性狀觀察和甾體化合物含量測定,結(jié)果表明2號、8號和12號真菌能合成大量的甾體化合物,培養(yǎng)液中甾體化合物的產(chǎn)率分別為208.62、144.97和198.79 mg/L[15]；宣群等[16]從云南重樓的根中分離到1株內(nèi)生真菌菌株,該菌株對白色念珠菌有較強的抑制作用,被鑒定為無孢菌群；孫靜賢從云南重樓的內(nèi)生真菌中篩選到了具有抗金黃色葡萄球菌活性的菌株[17],為屬于粘鞭霉屬的墻粘鞭霉(Gliomastixmurorum),此外他還發(fā)現(xiàn)該屬G.luzulae的次生代謝產(chǎn)物中含有抗生素環(huán)孢菌素C。已有的實驗結(jié)果證明能從重樓內(nèi)生真菌及其代謝物中獲得重樓的活性成分；植物內(nèi)生真菌幾乎存在于所有的植物中,且大多數(shù)內(nèi)生真菌還沒有被研究,因此今后有必要深入挖掘植物內(nèi)生真菌中的生物活性物質(zhì),這些生物活性物質(zhì)在農(nóng)藥、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域?qū)⒕哂袕V闊的應用前景。本實驗結(jié)果可為植物內(nèi)生真菌的進一步研究提供理論依據(jù),也有助于研究云南重樓內(nèi)生真菌與其生理活性物質(zhì)的關(guān)系及其內(nèi)生真菌多樣性的開發(fā)利用。