李小玲,劉 榮,華智銳

(商洛學院 生物醫(yī)藥與食品工程學院,陜西 商洛 726000)

干旱是常見的非生物脅迫因子之一,嚴重影響植物的產(chǎn)量和質量。根據(jù)相關報道,每年因干旱造成的全球農(nóng)作物產(chǎn)量損失率達50%以上,而全球氣候變暖又加劇了干旱對農(nóng)作物的破壞。植物的抗旱性除受多基因控制外還受到其它環(huán)境因子的影響,其機理較為復雜,目前,還缺乏有效的提高作物抗旱性的方法。因此,干旱對農(nóng)作物造成的損失在所有非生物脅迫中占首位。

黃芩(ScutellariabaicalensisGeorigi)屬于唇形科黃芩屬多年生草本植物,以根入藥,具有清熱降火、涼血安胎、解毒等多種功效,是我國常用大宗中藥材之一[1]。近年來,中藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展帶動了黃芩的規(guī)范化栽培及市場需求量。但由于全球氣候變暖,高溫少雨、大氣水分及土壤水分缺乏使土地失墑問題愈發(fā)突出,導致黃芩種子吸水能力顯著下降,嚴重影響了黃芩的產(chǎn)量及質量。如何提高干旱條件下植物的產(chǎn)量,是科研工作者長期以來急需解決的問題。研究發(fā)現(xiàn),在干旱脅迫下植物會產(chǎn)生大量的活性氧和自由基,破壞植物體內的生物大分子,引起細胞膜脂質過氧化作用及導致細胞結構的損傷。因此,尋找一種化控措施來提高黃芩在干旱地區(qū)生產(chǎn)中的抗旱性至關重要,對于擴大黃芩人工栽培具有重要的意義。

殼聚糖(CTS)又稱為脫乙酰甲殼素,學名聚氨基葡萄糖,它是由甲殼素經(jīng)脫乙酰化作用得到的直鏈狀高分子化合物[2]。甲殼素是許多低等動植物(蝦、蟹、昆蟲、真菌、藻類等)的重要組成成分,天然無害、環(huán)保、可生物降解，不僅具有良好的生物相容性[3],而且具有良好的成膜性、附著性和吸濕性[4],可以被廣泛應用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、生物等領域。研究表明,抽穗期玉米花絲和穗軸經(jīng)CTS處理能有效提高種子的貯藏蛋白和醇溶蛋白含量,可作為一種新型蛋白質生物調節(jié)劑應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中[5]。CTS及其寡糖都屬于天然產(chǎn)物,對植物無任何毒副作用。眾多研究表明,CTS可作為一種新型的植物生長調節(jié)劑,促進植物生長,增強植物的抗逆能力[6-9],在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方面具有廣闊的應用前景。

近年來,前人針對黃芩的種質資源、化學成分、質量以及藥理作用等方面開展了大量研究[10],但目前有關殼聚糖對黃芩種子萌發(fā)及幼苗抗旱性的影響研究尚未見報道。前人已開展殼聚糖對玉米[9]、小麥[11]、蘋果[12]等植物抗旱性的影響研究,而在藥用植物中的相關研究報道較少。因此,本試驗以商洛黃芩為材料,研究了外源殼聚糖對黃芩種子萌發(fā)及干旱脅迫下的幼苗生理特征的影響,旨在探索CTS對黃芩種子萌發(fā)及幼苗抗旱性的影響,為將CTS作為抗旱劑應用到黃芩抗旱栽培中提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用黃芩種子及幼苗于2018年4月中旬購自洛南藥材種植基地,為一年生黃芩幼苗;CTS購自陜西博諾生物技術有限公司,含量≥99.5%,分析純試劑AR級。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料預處理 選取成熟飽滿、大小一致的黃芩種子,用1.0%的次氯酸鈉消毒5 min,然后用蒸餾水沖洗并自然晾干,備用;將所購買的黃芩幼苗移栽至直徑約15 cm的花盆中,進行預培養(yǎng),在戶外溫度下培養(yǎng)1個月左右,在此期間,定時澆水和松土以保持土壤濕潤。

1.2.2 黃芩種子的處理 先用少量2% HAC溶解CTS,再加蒸餾水配制成不同濃度(體積分數(shù))的CTS溶液。本試驗設1個對照和5個處理: CK，蒸餾水對照；處理T1，0.05% CTS; T2,0.10% CTS; T3,0.15% CTS; T4,0.20% CTS; T5.0.25% CTS。

將預處理的黃芩種子分別用不同濃度的CTS溶液浸種24 h,然后取出晾干；以等量蒸餾水浸種為對照(CK)。采用紙上發(fā)芽床法,在洗凈、烘干的培養(yǎng)皿(直徑9 cm)中鋪單層濾紙,并加入蒸餾水,整齊地放入50粒黃芩種子,置入人工氣候箱中培養(yǎng),培養(yǎng)溫度設為25 ℃/16 ℃(晝/夜)，相對濕度為75%,光照強度為1400 lx。每個處理重復3次,每天記錄發(fā)芽的種子數(shù)；定期補充蒸餾水,在第6天統(tǒng)計發(fā)芽勢,在第10天統(tǒng)計發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)。

1.2.3 黃芩幼苗的處理 試驗設2個對照和5個處理: CK1,蒸餾水對照; CK2,20% PEG6000，藥劑對照;處理T1,0.05% CTS+20% PEG6000; T2,0.10% CTS+20% PEG6000; T3,0.15% CTS+20% PEG6000; T4,0.20% CTS+20% PEG6000; T5,0.25% CTS+20% PEG6000。

將CK2、T1～T5中的黃芩幼苗用20% PEG6000[13,14]模擬干旱處理24 h后,用噴霧器將不同濃度的CTS噴于相應處理的黃芩幼苗葉片正反面,每天噴灑1次,共處理5 d,其中CK1、CK2施加蒸餾水。在間隔4 d后選取長勢良好的植株，測定黃芩幼苗葉片的葉綠素含量、保護酶(POD、SOD、CAT)活性、丙二醛(MDA)含量、脯氨酸含量和可溶性糖含量等生理指標,以篩選適宜的CTS濃度。

1.2.4 生理指標的測定 發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)的統(tǒng)計參照《國際種子檢驗規(guī)程》[15];葉綠素含量的測定參照張志良等[16]的分光光度法;SOD活性的測定參照李合生等[17]的氮藍四唑(NBT)光還原法;POD活性的測定參照李合生等[17]的愈創(chuàng)木酚法;CAT活性的測定參照李合生等[17]的紫外分光光度法;MDA含量的測定參照張志良等[16]的硫代巴比妥酸法;脯氨酸含量的測定參照李合生等[17]的茚三酮法;可溶性糖含量的測定參照李合生等[17]的苯酚法。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有試驗數(shù)據(jù)為3次重復測定值的平均值,用Excel 2010進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計,用SPSS 22.0進行統(tǒng)計學分析。

2 結果與分析

2.1 不同濃度殼聚糖對黃芩種子發(fā)芽勢的影響

由圖1可以看出：不同濃度的殼聚糖溶液浸種處理24 h后,黃芩種子的發(fā)芽勢與對照組CK相比差異顯著(P<0.05),并且在一定范圍內出現(xiàn)濃度效應,即隨著濃度的增加,發(fā)芽勢也逐漸增加,當殼聚糖濃度增加至0.15%時,發(fā)芽勢達到最大,且比對照組高出22.6個百分點；之后隨著殼聚糖濃度上升,其對黃芩種子萌發(fā)的促進作用逐漸下降?？梢?適宜濃度的殼聚糖溶液能顯著地提高黃芩種子的發(fā)芽勢。

標有不同字母的處理間在0.05水平下差異顯著。下同。圖1 不同濃度殼聚糖對黃芩種子發(fā)芽勢的影響

2.2 不同濃度殼聚糖對黃芩種子發(fā)芽率的影響

由圖2可見：經(jīng)不同濃度的殼聚糖溶液浸種處理24 h后,黃芩種子的發(fā)芽率與對照組CK相比差異顯著(P<0.05),且在一定范圍內呈現(xiàn)濃度效應,即隨著濃度的增加,發(fā)芽率逐漸增加；當殼聚糖溶液濃度增加至0.15%時,發(fā)芽率達到最大,且比對照組高出24.1個百分點；之后隨著殼聚糖濃度的上升,其對黃芩種子發(fā)芽的促進作用逐漸下降,但仍高于對照組CK的?？梢?適宜濃度的殼聚糖溶液能顯著地提高黃芩種子的發(fā)芽率。

2.3 不同濃度殼聚糖對黃芩種子發(fā)芽指數(shù)的影響

由圖3可以看出：用不同濃度的殼聚糖溶液浸種處理黃芩種子24 h后,發(fā)芽指數(shù)呈上升的趨勢,與對照組CK差異顯著(P<0.05),且在一定濃度范圍內呈現(xiàn)遞增遞減趨勢；當殼聚糖溶液濃度上升至0.15%時,發(fā)芽指數(shù)達到最高峰,且比對照組CK高出61.3%；之后隨著殼聚糖濃度的上升,其對黃芩種子發(fā)芽的促進作用逐漸下降,但仍高于對照組CK?？梢?適宜濃度的殼聚糖溶液能顯著提高黃芩種子的發(fā)芽指數(shù)。

圖2 不同濃度殼聚糖對黃芩種子發(fā)芽率的影響

圖3 不同濃度殼聚糖對黃芩種子發(fā)芽指數(shù)的影響

2.4 不同濃度殼聚糖對干旱脅迫下黃芩幼苗葉片葉綠素含量的影響

從圖4中可以看出：對照組CK2與CK1相比,黃芩幼苗葉片葉綠素含量明顯下降18.8%,說明干旱脅迫顯然抑制了黃芩幼苗葉片中的葉綠素含量；在噴施不同濃度的殼聚糖溶液后,葉綠素含量趨于上升,與對照組CK1、CK2相比,差異顯著,且在一定范圍內存在濃度效應；當殼聚糖濃度為0.15%時,黃芩幼苗葉片中葉綠素含量最高,為2.75 mg/g,且比對照組CK1、CK2分別高出78.6%和120.0%,且差異顯著(P<0.05)；之后隨著殼聚糖濃度的上升,其對黃芩幼苗葉綠素合成的促進作用逐漸下降,但仍高于對照組。結果表明,噴施0.15%的殼聚糖對促進光合色素含量的升高有顯著作用,且能有效緩解干旱脅迫對黃芩幼苗光合色素的抑制效應。

2.5 不同濃度殼聚糖對干旱脅迫下黃芩幼苗SOD活性的影響

由圖5可知：與CK1相比，對照組CK2的黃芩幼苗SOD活性明顯上升,說明干旱脅迫可促進黃芩植株體內SOD活性的增加；當噴灑殼聚糖溶液后,黃芩幼苗的SOD活性也不斷增強,且在一定濃度范圍內存在濃度效應,當殼聚糖溶液濃度為0.15%時,SOD活性最大,為158.69 U/(g·min),且比對照組CK1、CK2分別高出40.7%和19.8%,差異達到了顯著水平(P<0.05)；之后隨著殼聚糖濃度的上升,其對SOD活性的促進作用逐漸下降,但仍高于對照組。結果表明,噴施0.15%的殼聚糖溶液可明顯提高黃芩幼苗中SOD活性,且有效緩解干旱脅迫對黃芩幼苗的傷害。

圖4 不同濃度殼聚糖對干旱脅迫下黃芩幼苗葉片葉綠素含量的影響

圖5 不同濃度殼聚糖對干旱脅迫下黃芩幼苗SOD活性的影響

2.6 不同濃度殼聚糖對干旱脅迫下黃芩幼苗POD活性的影響

由圖6可以看出：CK2與CK1相比,黃芩幼苗POD活性顯著上升25.1%；當殼聚糖濃度達到0.15%時,黃芩幼苗POD活性達到最高峰,為23.58 U/(g·min)，且比對照組CK1、CK2分別高出86.0%、48.7%，存在顯著性差異(P<0.05);當殼聚糖濃度大于0.15%時,黃芩幼苗POD活性逐漸下降,但仍高于對照組。結果表明,適宜濃度的殼聚糖處理能提高黃芩幼苗的POD活性,增強其在干旱脅迫下的代謝強度，且有效地緩解干旱脅迫對黃芩幼苗的傷害。

2.7 不同濃度殼聚糖對干旱脅迫下黃芩幼苗CAT活性的影響

由圖7可知：CK2與CK1相比,CAT活性顯著上升11.5%,表明逆境脅迫下黃芩植株體內保護酶活性明顯上升；當噴灑殼聚糖溶液后,CAT活性在一定范圍內存在遞增遞減趨勢；當殼聚糖溶液濃度為0.15%時,CAT活性最高,為4.97 U/(g·min),與對照組CK1、CK2相比分別高出42.8%、28.1%,差異達顯著水平(P<0.05)；之后隨著殼聚糖濃度的上升,CAT活性顯著減弱,但仍高于對照組。由此表明,噴施0.15%的殼聚糖溶液可明顯提高黃芩幼苗中CAT活性,且有效緩解干旱脅迫對黃芩幼苗的傷害。

圖6 不同濃度殼聚糖對干旱脅迫下黃芩幼苗POD活性的影響

圖7 不同濃度殼聚糖對干旱脅迫下黃芩幼苗CAT活性的影響

2.8 不同濃度殼聚糖對干旱脅迫下黃芩幼苗MDA含量的影響

由圖8可知：CK2與CK1相比,黃芩幼苗葉片MDA含量顯著增加,表明干旱脅迫導致膜脂過氧化作用增強；當噴灑殼聚糖溶液后，MDA含量呈現(xiàn)先減后增的趨勢,在T3處理下達到最低谷值6.92 nmol/g,分別比對照組CK1、CK2降低了39.6%、47.2%,存在顯著差異(P<0.05)，且其它處理的MDA含量較對照CK2均有不同程度的降低,這說明噴施殼聚糖溶液能顯著抑制MDA的生成；之后隨著殼聚糖溶液濃度的上升,MDA含量明顯增加,且仍低于對照?？梢?當殼聚糖溶液濃度為0.15%時,黃芩幼苗受到干旱脅迫危害最小,抗旱性最強。

圖8 不同濃度殼聚糖對干旱脅迫下黃芩幼苗MDA含量的影響

2.9 不同濃度殼聚糖對干旱脅迫下黃芩幼苗脯氨酸含量的影響

由圖9可看出：CK2黃芩幼苗的脯氨酸含量較CK1顯著上升17.3%,說明黃芩幼苗在逆境情況下,體內脯氨酸含量明顯上升；當噴灑殼聚糖溶液后,脯氨酸含量也持續(xù)上升,且在一定濃度范圍內存在遞增遞減趨勢；當殼聚糖溶液濃度為0.15%時,脯氨酸含量達到最高峰,為10.75 μg/g,且比對照組CK1、CK2分別高出194.5%、151.1%,有顯著性差異(P<0.05)；隨著殼聚糖溶液濃度的增加,其對黃芩幼苗脯氨酸含量的促進作用逐漸下降,但仍高于對照組。結果表明,當CTS濃度為0.15%時,黃芩幼苗受到干旱脅迫危害最小,抗旱性最強。

圖9 不同濃度殼聚糖對干旱脅迫下黃芩幼苗脯氨酸含量的影響

2.10 不同濃度殼聚糖對干旱脅迫下黃芩幼苗可溶性糖含量的影響

由圖10可知：在20% PEG6000模擬干旱脅迫下黃芩幼苗葉片可溶性糖含量隨著殼聚糖濃度的增加呈現(xiàn)先升后降的趨勢；對照組CK2的黃芩幼苗可溶性糖含量較CK1明顯提高1.92個百分點；當殼聚糖濃度為0.15%時,可溶性糖含量達到最高,為9.56%,且比對照組CK1、CK2分別高出5.14、3.22個百分點,差異達顯著性水平(P<0.05)；隨著殼聚糖溶液濃度的進一步上升,其對黃芩幼苗可溶性糖含量的促進逐漸下降,但仍高于對照組。結果表明,當殼聚糖濃度為0.15%時,滲透調節(jié)物質可溶性糖含量最高,可降低植物組織水勢,提高植物的吸水能力,從而顯著提高黃芩幼苗的抗旱性。

圖10 不同濃度殼聚糖對干旱脅迫下黃芩幼苗可溶性糖含量的影響

3 討論

種子的發(fā)芽率(勢)及發(fā)芽指數(shù)代表著種子的活力指標,是衡量種子質量的重要指標。在本試驗中,用不同濃度的殼聚糖溶液浸種處理黃芩種子,其各項萌發(fā)指標都以在0.15% CTS處理下最佳；而當CTS濃度高于0.15%時,其萌發(fā)指標逐漸下降。說明殼聚糖能夠明顯提高種子發(fā)芽的呼吸速率,并隨著殼聚糖濃度的增大而提高,使種子內的物質加速轉化,進而促進種子的萌發(fā)。而隨著殼聚糖濃度的不斷增加,種子的呼吸速率過快,促使大量的能量以熱量的形式散失,降低了殼聚糖的促進作用。

葉綠素是植物光合作用中非常重要的色素,其含量的高低決定了植物光合能力的強弱。在本試驗中,用20% PEG6000模擬干旱處理黃芩幼苗,導致其葉綠素含量明顯下降,這說明干旱脅迫會對植物光合器官造成傷害。當噴灑殼聚糖溶液后,葉綠素含量得到顯著提高,且濃度為0.15%時效果最佳,表明殼聚糖可抑制逆境脅迫對植物的傷害,提高黃芩幼苗葉綠素含量,進而促進其光合能力,促進干物質和能量的積累,有利于后期黃芩幼苗的生長發(fā)育。

超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)是植物組織中重要的保護酶,與植物的衰老和抗逆性密切相關。當植物受到逆境脅迫時,體內產(chǎn)生大量活性氧自由基,而保護酶SOD可以催化超氧物陰離子自由基,生成O2和H2O2。為了避免H2O2對細胞的氧化損傷,通過CAT將生成的H2O2分解為O2和H2O。本研究發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫下黃芩幼苗保護酶活性顯著高于對照組,這與段輝國等[18]、郭東會等[19]、張俊風等[20]的研究結果一致。在本試驗中,用殼聚糖溶液處理干旱脅迫下黃芩幼苗后,其保護酶活性都得到明顯提高,且在殼聚糖溶液濃度為0.15%時效果最佳。表明殼聚糖可抑制逆境脅迫對植物的傷害,延緩黃芩的衰老,增強其抗逆性,促進黃芩幼苗的生長發(fā)育。

當植物遭受逆境脅迫時,其細胞中活性氧自由基的產(chǎn)生和清除之間的平衡遭到破壞,自由基迅速積累,造成膜脂過氧化,產(chǎn)生大量的丙二醛(MDA)。因此,MDA含量能反映黃芩幼苗葉片生物膜受傷害的程度及其抗旱性的強弱。在干旱脅迫下,黃芩幼苗葉片中的MDA含量得到明顯的提升,而經(jīng)過殼聚糖溶液處理后,MDA含量顯著降低，均低于對照組,且以0.15%濃度的效果最佳,說明殼聚糖可緩解膜脂過氧化的過程,降低丙二醛的含量。

脯氨酸和可溶性糖是植物細胞中重要的滲透調節(jié)物質,與植物抗逆性密切相關。脯氨酸能夠有效保持細胞質基質與環(huán)境的滲透平衡,預防水分丟失,并能保護膜結構的完整性?？扇苄蕴峭ㄟ^調節(jié)植物組織滲透勢,在逆境下維持植物生長。在本試驗中,用殼聚糖處理干旱脅迫下的黃芩幼苗,其脯氨酸、可溶性糖的含量均高于對照組,且以0.15%濃度時效果最佳。這與顧麗嬙等[21]、從心黎等[22]的研究結果基本一致。說明干旱情況下施加殼聚糖可有效地提高脯氨酸、可溶性糖含量,降低對幼苗的干旱脅迫。

綜上所述，適宜濃度(0.15%)的殼聚糖處理可抑制黃芩幼苗MDA含量的增加,提高種子的萌發(fā)率，增強植物細胞內保護酶活性，增加光合色素和滲透調節(jié)物質的含量，從而防止或降低膜脂過氧化作用對質膜的傷害。本試驗結果可為黃芩的抗旱性研究提供參考,也可為利用殼聚糖作為化控措施來增強黃芩的耐旱性提供理論依據(jù)。本研究開展了外源CTS噴施最佳濃度試驗,但主要針對盆栽苗開展研究,而對于黃芩大田栽培中相關生理生化指標的研究還有待進一步開展。