武曉陽，隆文杰，陳 丹，周國雁，杜 娟，伍少云，蔡 青

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所/云南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部 西南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650223)

糯玉米起源于中國，所以中國擁有非常豐富多彩的糯玉米地方品種，尤其是中國的西南地區(qū)，如云南及其周邊地區(qū)更是中國糯玉米的起源中心和遺傳多樣性中心[1-4]。糯玉米在云南的4個(gè)玉米生態(tài)種植區(qū)，即滇中溫暖、滇西北冷涼、滇南暖熱和滇東北溫涼生態(tài)區(qū)[5]都有分布，農(nóng)家品種數(shù)量眾多，約占收集、保存的云南地方玉米種質(zhì)資源樣品數(shù)的10%以上，達(dá)400多份，且類型多樣，籽粒色澤變化豐富。其中滇中和滇南玉米生態(tài)區(qū)是云南糯玉米品種多樣性和性狀多樣性的中心。這種多樣性可能與聚居在云南、尤其是南部和西南部多個(gè)少數(shù)民族的糯食文化，以及這些地理區(qū)域的特殊生態(tài)、地理和立體農(nóng)業(yè)氣候有一定關(guān)聯(lián)。這些豐富多樣的云南糯玉米地方種質(zhì)資源是開展糯玉米研究的物質(zhì)基礎(chǔ)，深入分析其waxy基因的等位變異類型與組成，發(fā)掘新基因，對(duì)針對(duì)性保護(hù)和利用攜帶珍稀基因的遺傳資源材料具有重要意義和實(shí)用價(jià)值。糯玉米(ZeamaysL. var.certainKulesh)是在中國境內(nèi)被成功馴化的特殊栽培類型，因其籽粒胚乳淀粉幾乎全部為支鏈淀粉而導(dǎo)致籽?；虻矸郾憩F(xiàn)為糯性[6-7]或粘性，此糯性受隱性waxy單基因的控制。普通玉米的waxy基因能正常表達(dá)GBSSⅠ蛋白并合成直鏈淀粉，而糯玉米因waxy基因突變造成GBSSⅠ蛋白失活、直鏈淀粉合成受阻，便產(chǎn)生糯性籽粒和糯性支鏈淀粉。玉米的waxy基因定位于9號(hào)染色體，全長約4.5 kb，包含有14個(gè)外顯子[8]。

箭頭表示插入突變，下劃線表示缺失突變。圖1 waxy基因的突變位點(diǎn)

目前，在糯玉米中已發(fā)現(xiàn)超過50種以上的waxy基因突變類型(圖1)，但絕大多數(shù)都是插入或缺失突變，因此玉米waxy基因的等位突變不僅呈現(xiàn)出多樣性，而且插入/缺失突變也是其基因突變的主要形式[9]。在中國糯玉米地方品種中，糯性基因wx-D7和wx-D10是序列缺失造成的突變類型,其中wx-D7是其第7外顯子存在有30 bp的序列缺失，而wx-D10是其第10外顯子有15 bp的序列缺失[10，11]?；騱x-Cin4、wx-124和wx-Reina都發(fā)現(xiàn)存在于云南糯玉米地方種質(zhì)資源中，而且都是由轉(zhuǎn)座子插入造成的突變類型，其中，wx-Cin4是由一個(gè)466 bp的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Cin4插入waxy基因的第6外顯子當(dāng)中造成的插入突變，wx-124是由一個(gè)116 bp的MITE(Miniature Inverted-repeat Transposable Element)類轉(zhuǎn)座子“124”插入waxy基因的第7外顯子當(dāng)中造成的插入突變，wx-Reina則是在waxy基因的第10內(nèi)含子中插入了一個(gè)約5.4 kb的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Reina[12，13]。在我們前期研究中，雖然現(xiàn)在已基本明確，在大量豐富的云南糯玉米地方種質(zhì)資源中，基因wx-D10和wx-Reina有相當(dāng)高的分布頻率，分別有約50%和 30%的云南糯玉米地方種質(zhì)資源攜帶有這兩個(gè)基因，是云南糯玉米地方種質(zhì)資源的糯性優(yōu)勢基因或高頻率基因。同時(shí)，基因wx-D7、wx-Cin4和wx-124在云南糯玉米地方種質(zhì)資源當(dāng)中出現(xiàn)的頻率相當(dāng)?shù)?，只在少?shù)或個(gè)別云南地方糯玉米品種中存在，是稀有基因或低頻基因。然而，除已明確攜帶有上述5個(gè)waxy基因的材料外，還有約占云南糯玉米地方品種數(shù)1/5的100份左右材料帶有未知的waxy基因。因此，深入分析這些資源的waxy基因突變類型及其分子特征，有助于了解和掌握整個(gè)云南糯玉米地方品種的waxy基因構(gòu)成、分布，探討云南糯玉米waxy基因與生態(tài)地理、立體農(nóng)業(yè)氣候和民族飲食文化之間的協(xié)同進(jìn)化關(guān)系。本文通過現(xiàn)代分子生物學(xué)方法的克隆、測序等手段，研究分析了攜帶未知糯性基因的云南糯玉米地方種質(zhì)資源waxy基因的突變形式及其分子特征，以期發(fā)掘新基因，為有針對(duì)性地保護(hù)和利用具稀有或低頻基因的種質(zhì)資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

含未知waxy等位基因的云南糯玉米地方品種共10份(表1)及對(duì)照材料普通(非糯)玉米自交系B73，取自國家科技資源共享服務(wù)平臺(tái)—國家作物種質(zhì)資源庫(云南)暨 “云南省作物種質(zhì)資源保存庫”。10份實(shí)驗(yàn)材料涵蓋滇南(元江縣、瀾滄縣、廣南縣和元陽縣)、滇中(宜良縣、保山市隆陽區(qū)、雙柏縣)、滇西北(瀘水縣、華坪縣)和滇東北(宣威市)4個(gè)云南玉米的生態(tài)區(qū)。

表1 實(shí)驗(yàn)材料的信息

1.2 突變點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)

為檢測帶有未知糯性基因的云南糯玉米地方品種的waxy基因突變位點(diǎn)，首先從幼葉提取實(shí)驗(yàn)材料的基因組DNA[15]，然后用可以覆蓋整個(gè)waxy基因的11對(duì)分子標(biāo)記(表2)來檢測10份實(shí)驗(yàn)材料的基因組DNA。PCR反應(yīng)體系為50 μL，包括1×PCR buffer、1 U Taq酶(TaKaRa公司)、0.2 mmol/L的dNTPs、0.4 μmol/L的兩端引物和50 ng的基因組DNA。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃持續(xù)5 min；35個(gè)循環(huán)，包括94 ℃持續(xù)1 min、57 ℃持續(xù)1 min和72 ℃持續(xù)1～3 min；最后72 ℃持續(xù)5 min。

1.3 xuanwei的序列測定

染色體步移采用簡化的熱交錯(cuò)不對(duì)稱PCR(Tail-PCR)方法[13]，其擴(kuò)增過程簡化為兩輪反應(yīng)。第一輪Tail-PCR反應(yīng)使用的引物為上游特異引物和在5′-端增加結(jié)合點(diǎn)的隨機(jī)引物。其PCR采用普通PCR反應(yīng)體系，而Tail-PCR反應(yīng)程序?yàn)椋菏紫龋?4 ℃持續(xù)5 min；然后包括94 ℃持續(xù)1 min，58 ℃持續(xù)1 min和72 ℃持續(xù)3 min的5個(gè)循環(huán)；接著為94 ℃持續(xù)1 min，且每秒降低0.5 ℃并在30 ℃下持續(xù)1 min，72 ℃持續(xù)3 min；再包括94 ℃持續(xù)1 min，58 ℃持續(xù)1 min，72 ℃持續(xù)3 min，94 ℃持續(xù)1 min，50 ℃持續(xù)1 min和72 ℃持續(xù)3 min的15個(gè)循環(huán)；最后72 ℃持續(xù)5 min。第二輪Tail-PCR反應(yīng)使用的引物是下游特異引物和結(jié)合到隨機(jī)引物5′-端的引物。反應(yīng)體系仍采用普通PCR反應(yīng)體系，但其模板為第一輪Tail-PCR的產(chǎn)物1 μL，反應(yīng)后的PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖檢測，并直接測序。

用已測序的普通玉米自交系B73的基因組序列作為參考序列，以分段式方法克隆大片段xuanwei。分3段完成xuanwei的PCR擴(kuò)增，其中對(duì)前后兩段的擴(kuò)增使用結(jié)合到waxy基因和xuanwei的引物，所獲得的PCR產(chǎn)物被用于直接測序。中間一段的擴(kuò)增采用巢式PCR法。其中，第一輪擴(kuò)增使用結(jié)合到waxy基因序列的引物，而第二輪擴(kuò)增則以第一輪擴(kuò)增結(jié)束后的1 μL PCR產(chǎn)物為模板，用結(jié)合到xuanwei的引物來擴(kuò)增，最終的PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖檢測和直接測序。

表2 用于檢測waxy基因外顯子區(qū)域插入片段的引物

1.4 wx-xuanwei的序列分析

利用基因結(jié)構(gòu)顯示系統(tǒng)(Gene Structure Display Server，GSDS)繪制waxy基因結(jié)構(gòu)圖[16]，而用基因組序列ZmB73_AGPv1_genome (http://ftp.maizesequence.org/current/assembly/)建立的本地Blast數(shù)據(jù)庫[17]分析轉(zhuǎn)座子在玉米基因組中的拷貝數(shù)。NCBI中的blast N被用于分析插入片段的類型和參考序列，而blast X和NCBI Conserved Domain Search(CDD)被用于分析轉(zhuǎn)座子的結(jié)構(gòu)域[18]，NCBI中的ORF finder則被用于分析開放閱讀框。軟件CLUSTAL X (1.8)被用于序列比對(duì)[19]。Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/)被用于引物的在線設(shè)計(jì)[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 waxy基因的檢測

為檢測具有未知等位基因的糯玉米資源，本研究開發(fā)了可以檢測整個(gè)野生型waxy基因的分子標(biāo)記(表2)。利用這些分子標(biāo)記進(jìn)一步檢測具有未知等位基因的10份糯玉米材料，發(fā)現(xiàn)其中一份材料糯包谷(232248)中在標(biāo)記waxy-22的PCR擴(kuò)增區(qū)域，也就是14個(gè)外顯子區(qū)域不能有效擴(kuò)增。初步認(rèn)為這一區(qū)域存在基因突變。

2.2 突變位點(diǎn)序列的測定

為了測定在宣威糯包谷中發(fā)現(xiàn)的waxy基因第14外顯子突變點(diǎn)的序列，采用簡化Tail-PCR方法進(jìn)行染色體步移。同時(shí)，PCR過程分兩步完成，第一步采用熱交錯(cuò)PCR預(yù)擴(kuò)增，第二步則將第一步獲得的PCR產(chǎn)物作為模板進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增。利用這種方法，獲得了突變位點(diǎn)約700 bp的序列。然后，通過blast N與B73基因組的序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)宣威糯包谷waxy基因的突變是由于未命名的LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的插入造成的，因而得到的序列是該轉(zhuǎn)座子的LTR結(jié)構(gòu)的部分序列。因此，宣威糯包谷waxy基因第14外顯子的突變點(diǎn)xuanwei也就是插入片段xuanwei。

利用轉(zhuǎn)座子LTR序列注釋出的B73基因組的同源序列(Chr2：23743198-23748113)作為設(shè)計(jì)擴(kuò)增該突變位點(diǎn)的參考序列，以便對(duì)該突變位點(diǎn)作進(jìn)一步地?cái)U(kuò)增和測序。由于LTR在玉米基因組中為多拷貝，直接擴(kuò)增將會(huì)影響其擴(kuò)增的特異性，因此使用waxy基因引物加轉(zhuǎn)座子結(jié)合引物擴(kuò)增插入片段xuanwei的兩端序列，而xuanwei中間部分的序列則采用巢式PCR擴(kuò)增。測序并拼接得到的完整的突變位點(diǎn)xuanwei的序列見圖2，為無義鏈序列。為在不同的云南糯玉米地方品種中發(fā)現(xiàn)有效檢測基因wx-xuanwei，并對(duì)其開展分布或頻率等深入研究，開發(fā)設(shè)計(jì)了1對(duì)特異顯性標(biāo)記。具有wx-xuanwei基因的糯玉米材料能擴(kuò)增出約100 bp的條帶(圖3)。該特異顯性引物的序列為：F:5′-TTGGCCGACTCTACTGGTTT-3′，R:5′-TTCTCCCAGTTCTTGGCAGT-3′。 F引物結(jié)合位點(diǎn)在轉(zhuǎn)座子的LTR序列上，R引物結(jié)合位點(diǎn)在waxy基因上。

2.3 基因wx-xuanwei的分子特征

云南糯玉米地方品種宣威糯包谷的waxy基因是由反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子xuanwei插入在waxy基因的第14內(nèi)外顯子區(qū)域形成的插入突變基因wx-xuanwei(圖1)，該轉(zhuǎn)座子為完整的LTR轉(zhuǎn)座子，具有5 bp的靶位點(diǎn)重復(fù)序列5′-CTGCC-3′。轉(zhuǎn)座子xuanwei的長度為4893 bp，具有兩個(gè)大的開放閱讀框，分別編碼Gag和Pol蛋白，其閱讀方向與waxy基因相反。該轉(zhuǎn)座子的兩端具有序列完全一致的兩個(gè)LTR結(jié)構(gòu)，是云南糯玉米地方種質(zhì)資源存在的一個(gè)新的插入點(diǎn)。通過結(jié)構(gòu)域CP、INT、RT和RNASE H的順序分析，該轉(zhuǎn)座子屬于Ty1-Copia類的長末端重復(fù)的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子(圖4)，在玉米基因組中的高倍數(shù)約為2個(gè)，是低拷貝類的轉(zhuǎn)座子家族成員之一。目前，在中國糯玉米waxy基因中發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)座子均屬于低拷貝家族的成員(表3)。

M為marker，1、2為突變型， 3、4為野生型。圖3 等位基因wx-xuanwei特異分子標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果

圖4 等位基因wx-xuanwei的序列及結(jié)構(gòu)特征

3 討論

玉米是原產(chǎn)于美洲[21]大陸的作物，在400～500年前才傳入中國[22]，而且糯玉米是由普通硬粒玉米[23]或爆裂玉米[24]發(fā)生基因突變并被選擇、馴化而來的，已是學(xué)術(shù)界公認(rèn)的觀點(diǎn)。但是糯玉米在中國的種植歷史有200多年[2,25]。說明玉米在從美洲引入中國后的100～200年時(shí)間里就發(fā)生了基因突變，并且這種突變就恰巧被當(dāng)時(shí)處在“糯稻栽培區(qū)”或“糯稻文化圈”又或者“糯食文化圈”的中國西南地區(qū)的壯、侗、布依、傣[26]等少數(shù)民族注意到，且把這種突變類型選擇并保留了下來。這些少數(shù)民族是由他們的先人百越人在明、清時(shí)期發(fā)展而來的[27]，而百越人是中國最早的稻谷栽培者[28]，當(dāng)然也應(yīng)該是最早的糯稻栽培者和食用者。所以，這些少數(shù)民族也許是從他們的祖先那里學(xué)習(xí)、借鑒了食用、祀用糯稻方面的經(jīng)驗(yàn)與知識(shí)，把與糯稻一樣帶有粘性的糯玉米當(dāng)新鮮食物祭祖、祭神，以及食用等，從而使玉米的糯性突變型糯玉米得以保留、延續(xù)，并積累、形成數(shù)以百計(jì)的地方品種或種質(zhì)資源。從這個(gè)角度看，中國西南地區(qū)，尤其是云南及周邊地區(qū)的少數(shù)民族的糯食文化與知識(shí)是中國糯玉米形成的主要?jiǎng)恿Α?/p>

表3 不同waxy等位基因中轉(zhuǎn)座子在B73基因組中的拷貝數(shù)

DNA序列的缺失和插入是造成玉米waxy基因突變的主要原因，而在插入突變中轉(zhuǎn)座子插入是造成糯性玉米waxy基因突變的一種主要形式[9]。所以，根據(jù)轉(zhuǎn)座子在基因組內(nèi)跳躍的媒介的不同，將其分為DNA轉(zhuǎn)座子和RNA轉(zhuǎn)座子。MITE類型的轉(zhuǎn)座子[22]即屬于DNA轉(zhuǎn)座子。RNA轉(zhuǎn)座子也叫反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，可進(jìn)一步劃分為長末端重復(fù)(LTR)的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子和非長末端重復(fù)(Non-LTR)的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。長末端重復(fù)的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的5′-末端和3′-末端具有長的正向重復(fù)序列，在跳躍過程中LTR序列由同一條DNA模板合成，而隨著時(shí)間的推移，其兩端的LTR會(huì)發(fā)生一定頻率的突變，使得兩端序列不一致。因此，根據(jù)基因組堿基變化速率可以計(jì)算轉(zhuǎn)座子的插入時(shí)間[29]。

插入在基因wx-xuanwei中的轉(zhuǎn)座子xuanwei屬于Ty1-Copia[30](表3)，因而基因wx-xuanwei與wx-xuanwei一樣都具有相同的LTR結(jié)構(gòu)，均屬于新的突變位點(diǎn)。但是，與wx-xuanwei不同，wx-Reina在云南糯玉米地方品種或種質(zhì)資源中屬于優(yōu)勢或高頻基因，約30%的云南糯玉米地方品種都帶有該基因，而wx-xuanwei目前只發(fā)現(xiàn)于宣威糯包谷之中，因而與wx-Cin4、wx-124和wx-D7一樣，在云南糯玉米地方品種中都屬于稀有或低頻基因。這些基因在地方品種的傳播過程中更容易丟失，因此在保存過程中值得更加關(guān)注。

4 結(jié)論

wx-xuanwei基因是由反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子或RNA轉(zhuǎn)座子插入玉米waxy基因，在云南糯玉米地方品種中形成的突變型新等位基因和低頻基因。另外9個(gè)研究材料的情況依然需要進(jìn)一步鑒定。