張 嬌 王 旋 張良波 劉志雄

(長(zhǎng)江大學(xué)園藝園林學(xué)院，荊州 434025)

甜蕎(FagopyrumesculentumMoench.)為蓼科(Polygonaceae)蕎麥屬(FagopyrumMill)食藥同源的雜糧作物,是蕎麥屬中2個(gè)栽培種之一[1]。甜蕎籽粒除含大量蛋白質(zhì)、纖維素、脂肪、淀粉等營(yíng)養(yǎng)成分外，還含硒、銅等礦物質(zhì)元素及蘆丁等生物活性成分[2～3]，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，且具保健功效，現(xiàn)越來(lái)越受人們的青睞。

甜蕎屬特殊異花授粉植物，自然群體中pin型和thrum型花植株1∶1分離，同型花自交不親和，異型花間才能正常授粉結(jié)實(shí)，人工雜交困難，產(chǎn)量低[4～5]。尋找同型花和異型花間均能正常授粉結(jié)實(shí)的甜蕎新種質(zhì)，對(duì)于開(kāi)展甜蕎雜交育種、提高甜蕎產(chǎn)量、新品種培育等均具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。課題組在前期育種實(shí)踐中，從甜蕎品種“北早生”群體中發(fā)現(xiàn)了長(zhǎng)雌蕊長(zhǎng)雄蕊“l(fā)pls”(Long pistil and long stamen,lpls)自然變異的單株，通過(guò)隔離授粉和單粒傳法獲得了遺傳性狀穩(wěn)定、親和性好、同型花、異型花間均能正常授粉結(jié)實(shí)的自然變異株系，成為開(kāi)展甜蕎育種工作的重要種質(zhì)資源(圖1)。深入系統(tǒng)研究甜蕎lpls突變體花、籽粒發(fā)育的過(guò)程與分子調(diào)控機(jī)制，對(duì)于該種質(zhì)的可持續(xù)性利用有重要的意義。

圖1 甜蕎3種花型圖 A.thrum型花(短花柱長(zhǎng)雄蕊)；B.pin型花(長(zhǎng)花柱短雄蕊)；C.lpls突變體花(長(zhǎng)花柱長(zhǎng)雄蕊)Fig.1 Three flower types of F.esculentum A.thrum flower with short pistil and long stamen; B.pin flower with long pistil and short stamen; C.lpls flower with long pistil and long stamen

在模式植物擬南芥中，AP2基因主要參與花器官和果實(shí)的發(fā)育調(diào)控，促進(jìn)花分生組織形成[6～8]。本實(shí)驗(yàn)以甜蕎長(zhǎng)雌蕊長(zhǎng)雄蕊突變體lpls為材料，通過(guò)同源克隆結(jié)合RACE技術(shù)從甜蕎突變體lpls花芽中克隆出了1個(gè)甜蕎AP2同源基因的cDNA序列，在分析其結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(quantitative Real-time PCR，qPCR)檢測(cè)其在甜蕎突變體lpls不同營(yíng)養(yǎng)組織和生殖結(jié)構(gòu)中的表達(dá)，以期為后續(xù)驗(yàn)證該基因在調(diào)控甜蕎花發(fā)育的生物學(xué)功能上提供一定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，并為進(jìn)一步分析甜蕎籽粒及花發(fā)育分子機(jī)制，及遺傳改良積累資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2018年3月21日，挑選顆粒飽滿的甜蕎‘lpls’的籽粒播種于花盆中(21 cm×14 cm×20 cm)。待5月盛花期時(shí)，分別從不同植株(≥3)上采集根、莖、幼葉、同時(shí)剝離花被片、雄蕊和雌蕊，以及發(fā)育4 d的甜蕎果實(shí)于液氮中速凍后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 甜蕎lpls型花植株總RNA的提取及cDNA合成

取100 mg左右植物材料采用EASY spin植物總RNA提取試劑盒(艾德萊北京)分別提取甜蕎的根、莖、幼葉、花被片、雄蕊、雌蕊和發(fā)育4 d的果實(shí)的RNA。采用HiScriptⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(諾唯贊南京)試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，方法參照說(shuō)明書(shū)。

1.2.2 甜蕎FaesAP2B基因的克隆

根據(jù)NCBI(https://www.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的本課題組前期克隆的甜蕎FaesAP2基因序列(KM386628.1)，在其5′非翻譯區(qū)(5′UTR)設(shè)計(jì)克隆FaesAP2B基因的特異性擴(kuò)增引物GSPAP2B，以甜蕎花芽cDNA為模板，用3′-Full RACE Core Set Ver.2.0試劑盒(TaKaRa)擴(kuò)增甜蕎FaesAP2B基因的cDNA序列全長(zhǎng)，擴(kuò)增PCR程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸60 s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離、回收目的片段，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、陽(yáng)性克隆鑒定、測(cè)序獲得甜蕎FaesAP2B基因的全長(zhǎng)序列，實(shí)驗(yàn)所用引物見(jiàn)表1。

表1 引物名稱及序列

1.2.3 蛋白序列比對(duì)與分子系統(tǒng)發(fā)育分析

將甜蕎FaesAP2B基因開(kāi)放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)編碼的氨基酸序列在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST同源搜索(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，下載甜蕎FaesAP2B同源蛋白序列。選取其中已公布的22種來(lái)自不同植物的AP2同源蛋白(表2)，用MEGA 5.0軟件的ClustalW程序，對(duì)選取的序列進(jìn)行同源比對(duì)，選Neighbor-Joining(鄰位相連法，NJ法)，采用1000次的自展(Bootstrap)重復(fù)，構(gòu)建分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖2)，用Bioedit7.0軟件將甜蕎FaesAP2B轉(zhuǎn)錄因子與大麥HvAP2、辣椒CaAP2、芍藥PIAP2、蘋(píng)果MadoAP2這4個(gè)AP2同源蛋白序列進(jìn)行序列比對(duì)與結(jié)構(gòu)分析。

表2 構(gòu)建分析系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的AP2同源蛋白

Table 2 AP2 homologous proteins for phylogentic tree construction

蛋白名稱Protein種名SpeciesGenbank登錄號(hào)Genbank accession numberLcAP2綠獨(dú)行菜Lepidium campestre L.AGI62074.1HvAP2大麥Hordeum vulgare Linn.AGX92954.1OitaAP2意大利紅門蘭Orchisi talica Poir.AGV39618.1CaAP2辣椒Capsicum annuum Linn.AJC11183.1PIAP2芍藥Paeonia lactiflora Pall.AGI61068.1MadoAP2蘋(píng)果Malus pumila Mill.ADE41133.1ViviAP2葡萄Vitis vinifera Linn.NP_001267881.1DcOAP2木石斛Dendrobium crumenatum Sw.AAZ95247.1CiarAP2鷹嘴豆Cicer arietinum Linn.XP_004511904.1ZmAP2玉米Zea mays L.ABR19870.1MtAP2蒺藜苜蓿Medicago truncatula Gaertn.KEH31465.1 FaesAP2B甜蕎Fagopyrum esculentum Moench.QCT84045.1OsAP2水稻Oryza sativa Japonica L.CAJ86049.1KjAP2棣棠Kerria japonica(Linn.) DC.AXR86367.1CacaAP2木豆Cajanus cajan(Linn.) Millsp.XP_020237263.1AtAP2擬南芥Arabidopsis thaliana(L.) Heynh.NP_001190938.1PtAP2L1黑松Pinus thunbergii ParlatoreBAD16603.1LmAP2L1落葉松Larix gmelinii(Ruprecht) KuzenevaABM26974.1NiatAP2煙草Nicotiana tabacum Linn.OIT36841.1AdAP2蔓花生Arachis duranensisXP_015963905.1CrAP2蘇鐵Cycas revoluta Thunb.BAE48512.1PsAP2牡丹Paeonia suffruticosa Andr.ALI57167.1

1.2.4 甜蕎FaesAP2B基因的表達(dá)分析

用HiScript?Ⅱ QRT SuperMix for qPCR(+g DNA wiper)(Vazyme)試劑盒，除去上述7種組織總RNA中殘存的基因組DNA再反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。具體操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。根據(jù)熒光定量引物設(shè)計(jì)的原則在甜蕎FaesAP2B基因的特異性位置設(shè)計(jì)上下游引物QFaesAP2BF和QFaesAP2BR(表1)，以蕎麥Faesactin(GenBank登錄號(hào)：HQ398855.1)為內(nèi)參基因，內(nèi)參基因引物分別為QFaesactinF和QFaesactinR(表1)。逆轉(zhuǎn)錄分別合成上述7種組織的cDNA，濃度稀釋10倍后作為模板，使用ChamQ? SYBR? qPCR Master Mix(Vazyme)試劑盒，進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，檢測(cè)甜蕎FaesAP2B基因在甜蕎lpls突變體根、莖、幼葉、花被片、雄蕊、雌蕊以及發(fā)育4 d的果實(shí)中表達(dá)的組織特異性和相對(duì)表達(dá)量的變化。3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，擴(kuò)增體系及PCR程序參照說(shuō)明書(shū)?；虻南鄬?duì)表達(dá)量利用2-ΔΔCT方法計(jì)算[9]。采用SPSS17.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用最小顯著性差異法(Least significant difference，LSD)對(duì)甜蕎FaesAP2B基因的表達(dá)水平進(jìn)行顯著性差異分析，并用Microsoft Office Excel軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜蕎FaesAP2B基因全長(zhǎng)cDNA克隆

同源克隆的方法結(jié)合RACE技術(shù)，從甜蕎lpls突變體花芽中分離出一個(gè)AP2同源基因。其cDNA序列全長(zhǎng)1 788 bp，其中5′UTR長(zhǎng)51 bp，3′UTR長(zhǎng)357 bp，其包含1個(gè)長(zhǎng)1 380 bp完整的ORF，編碼1個(gè)由459個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子，命名為FaesAP2B(FagopyrumesculentumAP2B)，GenBank登錄號(hào)為MK290847.1。

2.2 蛋白序列比對(duì)與分子系統(tǒng)發(fā)育分析

系統(tǒng)發(fā)育分析如圖2所示，結(jié)果表明甜蕎FaesAP2B與其他被子植物AP2蛋白聚為一類，說(shuō)明其屬于AP2同源蛋白。且甜蕎FaesAP2B與其他雙子葉植物的AP2蛋白距離較近，表明其于雙子葉植物AP2親緣關(guān)系較近，而與禾本科、蘭科等單子葉植物以及松科等裸子植物分隔較遠(yuǎn)，親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。與經(jīng)典分類學(xué)研究結(jié)果基本一致。

蛋白序列比對(duì)結(jié)果如圖3所示，該蛋白含有2個(gè)高度保守的AP2結(jié)構(gòu)域，第1個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域位于第132～197號(hào)氨基酸之間，由66個(gè)氨基酸殘基組成；第2個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域位于第223～279號(hào)氨基酸之間，由57個(gè)氨基酸殘基組成。第1個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域前還存在1個(gè)由10個(gè)氨基酸殘基組成的高度保守的核定位信號(hào)區(qū)，位于第121～130號(hào)氨基酸殘基之間。該蛋白的氨基酸序列與其他4種植物的AP2同源蛋白的氨基酸序列除在2個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域和核定位信號(hào)區(qū)基本相同外，其編碼的氨基酸與另外4種植物的AP2同源蛋白的氨基酸序列存在較大差異，這表明AP2同源基因的功能在不同植物中存在一定差異。

2.3 甜蕎FaesAP2B基因的表達(dá)分析

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)甜蕎FaesAP2B基因在甜蕎長(zhǎng)雌蕊長(zhǎng)雄蕊突變體“l(fā)pls”的根、莖、葉、被片、雄蕊、雌蕊以及發(fā)育4 d的果實(shí)中的表達(dá)量。檢測(cè)結(jié)果顯示如圖4，F(xiàn)aesAP2B基因在甜蕎突變體lpls的7種不同組織中均有表達(dá)，且甜蕎FaesAP2B在花被片、雌蕊、雌蕊和發(fā)育4 d的果實(shí)中的表達(dá)量均極顯著高于其在根、莖和葉等營(yíng)養(yǎng)器官中的表達(dá)量(LSD，P<0.01)。其中，甜蕎FaesAP2B在雄蕊中的表達(dá)量最高，且極顯著高于在其他6個(gè)器官中的表達(dá)量(LSD，P<0.01)，但該基因在其根、莖、葉間的表達(dá)量無(wú)顯著性差異。

圖2 FaesAP2B蛋白與其他植物AP2同源蛋白分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù) 分支上的數(shù)字表示執(zhí)行1 000次重復(fù)計(jì)算獲得的自展百分比。Fig.2 Phylogenetic analysis of FaesAP2B with other AP2 like proteins Number represents the Bootstrap percentage values calculated by 1 000 replicates.

圖3 FaesAP2B蛋白序列比對(duì)與結(jié)構(gòu)分析 方框?yàn)楹硕ㄎ恍盘?hào)區(qū)，下劃線表示AP2結(jié)構(gòu)域。其中FaesAP2B、HvAP2、CaAP2、MadeAP2、PIAP2分別為甜蕎、大麥、辣椒、蘋(píng)果、芍藥的AP2同源蛋白；點(diǎn)表示相同的氨基酸。Fig.3 Alignment of the putative amino acid sequence of FaesAP2B with other homologous proteins sequences Putative nuclear localization signals of FaesAP2 in front of the first AP2 domain are boxed; Underlined regions represent AP2domains. FaesAP2B,HvAP2,CaAP2,PIAP2,MadoAP2 of AP2 homologous proteins from Fagopyrum esculentum Moench.,Hordeum vulgare Linn.,Capsicum annuum Linn.,Malus pumila Mill.,Paeonia lactiflora Pall.,respectively; Dots represent the same amino acid.

圖4 FaesAP2B基因在甜蕎不同組織器官中的表達(dá)量Fig.4 Expression of FaesAP2B in different organs of F.esculentum

3 討論

在模式物種擬南芥中，AP2基因是典型的A功能基因，是唯一一類不屬于MADs-box基因家族的花發(fā)育基因[10]。其控制第1、2輪(花萼、花瓣)花器官的發(fā)育，并抑制C類基因在外2輪花器官中表達(dá)[11～12]。擬南芥AP2基因具有編碼AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族的特有的結(jié)構(gòu)域，AP2/ERF超基因家族存在于所有植物中，其中，ERF亞類氨基酸序列中只包含1個(gè)高度保守的AP2結(jié)構(gòu)域，而AP2亞類含有2個(gè)串聯(lián)的AP2結(jié)構(gòu)域，每個(gè)功能結(jié)構(gòu)域有60～70個(gè)氨基酸組成，且高度保守[13～14]。AP2/ERF超級(jí)基因家族在植物花器官發(fā)育、花序分生組織發(fā)育的調(diào)控以及胚、胚乳、果實(shí)種子的發(fā)育，種子大小控制等方面發(fā)揮重要作用，與作物種子器官的產(chǎn)量與質(zhì)量有密切關(guān)系[15～16]。同時(shí)，還參與植物生長(zhǎng)激素的響應(yīng)調(diào)節(jié)以及在逆境脅迫的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用[17～19]。

作為A類基因，AP2在植物花分生組織形成、花器官發(fā)育的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用。在強(qiáng)ap2突變體擬南芥中，其花瓣缺失，第1輪和第2輪花器官數(shù)量減少，并且第1輪花萼同源轉(zhuǎn)變成心皮狀結(jié)構(gòu)，而在弱ap2突變體擬南芥中，其花萼葉化，花瓣雄蕊化[20～21]。這些現(xiàn)象說(shuō)明AP2基因在控制擬南芥的花被(花萼和花瓣)發(fā)育起著重要的作用。此外也有研究發(fā)現(xiàn)AP2不僅僅在花器官中表達(dá)，在莖、葉中也有表達(dá)[22～23]。在辣椒中，AP2同源基因CaAP2在其葉、根莖、果皮中均檢測(cè)到了該基因的表達(dá)，且主要在營(yíng)養(yǎng)分生組織階段發(fā)揮作用，而在成花過(guò)渡階段表達(dá)量下降[24]。同樣，AP2同源基因在美味獼猴桃(Actinidiadeliciosa(A.Chev.) C.F.Liang et A.R.Ferguson)和睡蓮(NymphaeatetragonaGeorgi)的營(yíng)養(yǎng)器官及生殖器官也都有表達(dá)，這與甜蕎FaesAP2B基因的表達(dá)模式類似。且過(guò)表達(dá)的睡蓮AP2基因NsAP2還可以影響GA的生物合成途徑從而改變節(jié)間長(zhǎng)度。另外，NsAP2異位表達(dá)也可使擬南芥花瓣數(shù)量增加[25～26]；在芍藥中，AP2的同源基因PIAP2主要調(diào)控心皮和萼片的發(fā)育，而在花瓣和雄蕊中維持低水平表達(dá)[27]；矮牽牛(Petuniahybrida(J.D.Hooker) Vilmorin)的AP2同源基因PHAP2A過(guò)表達(dá)可以恢復(fù)擬南芥ap2-1突變體表型，但當(dāng)該基因被敲除后發(fā)現(xiàn)并沒(méi)有相應(yīng)的突變體表型，這說(shuō)明其可能存在功能冗余[28]；而在玉米中，檢測(cè)到AP2-like基因在18種組織中均有表達(dá)[29]；在落葉喬木雜交落葉松中，AP2的同源基因LmAP2L1可調(diào)控體胚發(fā)生后期胚胎的萌發(fā)[30]。甘薯(Dioscoreaesculenta(Lour.) Burkill)中，AP2同源基因則作為轉(zhuǎn)錄因子在甘薯非生物脅迫抵抗能力上發(fā)揮重要作用[31]；而在大麥中，HvAP2基因由mir172調(diào)控，參與穗分化以及節(jié)間長(zhǎng)度的調(diào)控，并與大麥花序的大小以及形狀，且過(guò)量HvAP2 mRNA可抑制節(jié)間生長(zhǎng)并增加穗密度[32]。以上研究結(jié)果都表明AP2同源基因在不同物種中，其表達(dá)模式以及功能不盡相同。但總的來(lái)說(shuō)主要在花和果實(shí)的發(fā)育中發(fā)揮重要作用。

在本研究中，我們通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)甜蕎FaesAP2B基因在花器官及果實(shí)中表達(dá)量較高，尤其是雄蕊中，另外在生殖器官外的組織中也檢測(cè)到了甜蕎FaesAP2B基因的表達(dá)，這些結(jié)果表明，甜蕎FaesAP2B基因可能參與調(diào)控甜蕎花及果實(shí)的發(fā)育，且主要在雄蕊的發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。另外，其作用不只局限于花發(fā)育,還可能參與了甜蕎整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。其具體功能仍需進(jìn)一步研究。