劉 曉 楊 佳 張 馨 馬苗苗 楊靜莉

(東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040)

大青楊(PopulusussuriensisKom.)屬楊柳科(Salicaceae)是一種速生落葉喬木，廣泛分布于中國(guó)北方、朝鮮和西伯利亞。大青楊材質(zhì)韌性較好，抗腐蝕性強(qiáng)，木質(zhì)緊密凈白，是造紙業(yè)和建筑業(yè)的優(yōu)質(zhì)原材料。隨著自然環(huán)境的日漸惡化，大青楊表現(xiàn)出多種優(yōu)良性狀，比如其育種周期短，適應(yīng)性強(qiáng)，因此廣泛應(yīng)用于人工造林和退耕還林。楊樹(shù)在三北地區(qū)是主要的經(jīng)濟(jì)樹(shù)種與綠化樹(shù)種，但是其生長(zhǎng)發(fā)育經(jīng)常受到干旱、鹽堿等逆境脅迫的限制[1]。因此對(duì)于研究大青楊抗逆的基因工程會(huì)越來(lái)越受到重視。

由于植物的固著性，它們無(wú)法移動(dòng)以避免不利的環(huán)境，因此它們不得不應(yīng)對(duì)各種惡劣的環(huán)境因素。為了在這些應(yīng)激源中生存，植物發(fā)展出各種自我保護(hù)機(jī)制，例如合成具有不同功能的功能蛋白。功能蛋白的表達(dá)主要受特異性轉(zhuǎn)錄因子的控制。轉(zhuǎn)錄因子編碼基因被認(rèn)為是導(dǎo)致植物多樣性和進(jìn)化的重要原因之一。轉(zhuǎn)錄因子及其同源轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的鑒定對(duì)于操縱調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以獲得目標(biāo)分子所需的特性是十分必要的[2]。此外，轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄起始率的控制來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育[3]。

基本區(qū)域亮氨酸拉鏈(bZIP)家族是最保守的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，并廣泛分布于多數(shù)真核生物中。迄今為止，它們已被發(fā)現(xiàn)廣泛存在擬南芥、水稻、番茄、玉米、高粱、胡蘿卜等多種植物[4～10]。bZIP轉(zhuǎn)錄因子根據(jù)bZIP保守域命名，該域由60～80個(gè)氨基酸組成，包含兩個(gè)功能區(qū)域：基本區(qū)域和亮氨酸拉鏈[11]。根據(jù)堿性結(jié)構(gòu)域以及其他保守的結(jié)構(gòu)域，同時(shí)依照擬南芥的77個(gè)bZIP類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子基因家族成員劃分的A、B、C、D、E、F、G、H、I和S類(lèi)10個(gè)亞家族[12]，有報(bào)道將214條楊樹(shù)bZIP轉(zhuǎn)錄因子根據(jù)其保守域氨基酸序列劃分為A、B、C、D、E、F、G、H、I、S及其他等11個(gè)亞族[1]。

bZIP轉(zhuǎn)錄因子作為關(guān)鍵的調(diào)控因子在植物的各種生物過(guò)程和應(yīng)激反應(yīng)中起作用[13]。GEN研究發(fā)現(xiàn)bZIP轉(zhuǎn)錄因子參與了植物對(duì)生物脅迫和非生物脅迫的應(yīng)激反應(yīng)，包括病原體防御[14～15]，激素和糖信號(hào)[16～17]，光響應(yīng)[18～19]，耐鹽耐旱[8,20]等。例如，在擬南芥(A.thaliana)中，轉(zhuǎn)錄因子AtbZIP1-AtbZIP75可以調(diào)控多種生物過(guò)程，如脅迫信號(hào)，光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[21]。玉米ZmbZIP72基因在擬南芥中過(guò)表達(dá)提高了非生物脅迫的耐受性[22]。在大豆中GmbZIPs，表現(xiàn)出明顯的抗鹽性和抗旱性[23]。此外，bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族bZIP73的提高了水稻在寒冷的氣候條件下的適應(yīng)性[24]。bZIP家族的FmABI5基因參與了水曲柳對(duì)高鹽、干旱、低溫與甘露醇的響應(yīng)[25]。BebZIP2和BebZIP6基因參與了慈竹對(duì)冷和干旱等非生物脅迫的響應(yīng)[26]。

近年來(lái)，關(guān)于bZIP轉(zhuǎn)錄因子的研究主要集中在農(nóng)作物和草本植物中，但是對(duì)于木本植物的研究較少[1]。本文以木本植物大青楊為對(duì)象，利用生物信息學(xué)技術(shù)分析預(yù)測(cè)bZIP1基因的功能及結(jié)構(gòu)，并分析了該基因在滲透脅迫下的表達(dá)模式。

1 材料與方法

1.1 植物材料

采用本實(shí)驗(yàn)室保存的無(wú)菌的大青楊組培苗，放置在25℃組培室，光周期為16 h/8 h，培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基，直至株高8～10 cm用于以下試驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大青楊RNA的提取及cDNA的合成

將植物材料放入液氮中研磨，利用北京諾博萊德科技有限公司供應(yīng)的QIAGEN RNeasy?Plant Mini Kit(50)，提取大青楊總RNA,使用南京諾唯贊生物生產(chǎn)的HiScript? Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反轉(zhuǎn)錄成功后的cDNA放置在-20℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 大青楊PubZIP1基因的克隆

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)干旱脅迫下大青楊轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，篩選獲得多個(gè)干旱響應(yīng)的bZIP轉(zhuǎn)錄因子成員。本研究對(duì)其中與毛果楊基因Potri.005G170500.1同源的一個(gè)成員做進(jìn)一步的功能研究，并將其命名為PubZIP1(accession number:MG387125)。

在PubZIP1基因序列兩端分別設(shè)計(jì)引物，由庫(kù)美生物公司合成正向引物F:5′-GAGATTCTTTTAGAGCATG-3′以及反向引物R:5′-GACTAAGTGGGTTCACGAGG-3′。以提取的大青楊RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模版，利用購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司2×Easy Taq PCR SuperMix克隆試劑盒進(jìn)行PCR，克隆出基因的全長(zhǎng)片段。PCR總反應(yīng)體系為20 μL，其中cDNA模版1 μL、正反向引物各1 μL、2×Easy Taq PCR SuperMix酶10 μL、去離子水7 μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共38個(gè)循環(huán)，72℃延伸2 min。電泳檢測(cè)目的條帶正確后，使用購(gòu)自康為世紀(jì)的快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，具體步驟見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。

PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，使用DL2000 DNA Marker目的片段比對(duì)，利用購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司的快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒膠回收目的片段。連接到PEASY-T1載體，利用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌，菌液涂板，次日挑取單克隆，搖菌送測(cè)序。

1.2.3 植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-PubZIP1-GFP的構(gòu)建

1.2.3.1 設(shè)計(jì)載體的雙酶切引物

通過(guò)分析楊樹(shù)PubZIP1基因全長(zhǎng)序列及pCAMBIA1300-sGFP載體圖譜設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的引物。在載體圖譜的多克隆位點(diǎn)中找出載體全部可用的酶切位點(diǎn)，以確定可供選擇的限制性?xún)?nèi)切酶，然后將楊樹(shù)PubZIP1基因全長(zhǎng)CDS序列輸入到BioEdit軟件中，通過(guò)軟件分析的結(jié)果得出該基因不可用的酶切位點(diǎn)，選取二者共有的限制性?xún)?nèi)切酶作為最終酶切位點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)選取BamHⅠ和SalⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)，正向酶切引物F:GCGGATCCATGAGCTCTACGTCAACTC，反向酶切引物R：GCGTCGACTAGTGGGTTCACGAGGACAAG。

1.2.3.2 目的基因PCR擴(kuò)增及膠回收

酶切引物合成后，以連接PEASY-T1-PubZIP1陽(yáng)性質(zhì)粒為模板PCR擴(kuò)增。在120 V電壓下，電泳檢測(cè)目的條帶是否正確，若條帶正確則利用購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司2×Easy Taq PCR SuperMix克隆試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后使用快速瓊脂糖凝膠回收試劑盒對(duì)其進(jìn)行膠回收，并按照康為世紀(jì)公司的快速DNA產(chǎn)物純化試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作步驟進(jìn)行純化。

1.2.3.3 pCAMBIA1300-GFP質(zhì)粒的提取

在無(wú)菌的150 mL小瓶中加入20 mL含50 mg·mL-1的卡那霉素(Kan)LB液體培養(yǎng)基，再加入15 μL轉(zhuǎn)入pCAMBIA1300-GFP質(zhì)粒的大腸桿菌菌液，放置于37℃搖床上160 r·min-1震蕩培養(yǎng)14 h，使用北京康為世紀(jì)生物科技有限公司的質(zhì)粒小提試劑盒提取pCAMBIA1300-GFP質(zhì)粒。

1.2.3.4 目的基因與載體的雙酶切反應(yīng)及純化

將膠回收產(chǎn)物和pCAMBIA1300-GFP質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行BamH/SalⅠ雙酶切，酶切體系如下表4(100 μL)：反應(yīng)條件為37℃，酶切反應(yīng)時(shí)間為2～3 h。最后使用康為世紀(jì)公司的快速DNA產(chǎn)物純化試劑盒對(duì)酶切產(chǎn)物分別進(jìn)行純化。雙酶切總反應(yīng)體系為100 μL，其中pCAMBIA1300-GFP質(zhì)粒50 μL、0×T Buffer 10 μL、bamH 5 μL、SalⅠ 5 μL、去離子水30 μL。

1.2.3.5 大腸桿菌的轉(zhuǎn)化及PCR檢測(cè)

將連接產(chǎn)物通過(guò)熱激法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，抽取200 μL菌液到無(wú)菌的含50 mg·L-1Kan的LB固體培養(yǎng)基平板中，用酒精燈燒過(guò)的無(wú)菌涂棒涂至均勻。在37℃搖床中倒置過(guò)夜培養(yǎng)后，用無(wú)菌的鑷子夾取無(wú)菌的小槍頭挑取單克隆菌落搖菌，然后進(jìn)行菌液PCR及電泳檢測(cè)，并將陽(yáng)性的菌液抽取500 μL送去公司測(cè)序，剩余菌液和50%甘油按1∶1比例混勻加入無(wú)菌的1.5 mL離心管中，充分混勻放入液氮快速冷凝，-80℃冷凍保存。測(cè)序比對(duì)正確后的菌液使用高純度質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒pCAMBIA1300-PubZIP1-GFP。

1.2.4 大青楊PubZIP1基因生物信息學(xué)及進(jìn)化樹(shù)分析

利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)在線(xiàn)軟件分析大青楊PubZIP1基因的開(kāi)放閱讀框；通過(guò)http://www.bio-soft.net/sms/index.html查詢(xún)?cè)摶虻耐春塑账峒鞍被嵝蛄?；利用ExPASy服務(wù)器中的Protparam(https://web.expasy.org/protparam/)工具分析蛋白的理化性質(zhì)；根據(jù)ExPASy(https://web.expasy.org/protscale/)服務(wù)器中的ProtScale程序分析大青楊PubZIP1蛋白的疏水性；通過(guò)在線(xiàn)軟件NPS@(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_gor4.pl)預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。通過(guò)TMHMM Server v.2.0對(duì)蛋白進(jìn)行跨膜區(qū)分析；使用SignalP 3.0 server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/)對(duì)蛋白進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，并預(yù)測(cè)該蛋白質(zhì)N端信號(hào)肽的有無(wú)及其酶切位點(diǎn)；使用COILS Server對(duì)肝蛋白卷曲螺旋預(yù)測(cè)分析；NCBI在線(xiàn)預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)域；通過(guò)http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html進(jìn)行氨基酸多序列比對(duì)；通過(guò)http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl網(wǎng)址進(jìn)行氨基酸結(jié)構(gòu)比對(duì)；利用MEGA5.05軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.5 亞細(xì)胞定位

構(gòu)建PubZIP1基因融合綠色熒光蛋白(GFP)瞬時(shí)表達(dá)載體(pBI121-PubZIP1-GFP)，并利用氯化銫—溴化乙錠超高速梯度密度離心方法進(jìn)行質(zhì)粒提取。將提取的質(zhì)粒包裹金粉，用基因槍(PDS-1000/He Particle Delivery System)轟擊洋蔥表皮，并用激光共聚焦顯微鏡(Olympus-FV1000MPE)觀察亞細(xì)胞定位情況。

1.2.6 大青楊PubZIP1基因的表達(dá)模式分析

采用1/2MS固體培養(yǎng)基，將大青楊幼苗培養(yǎng)24 d左右，選擇生長(zhǎng)良好且一致的5 cm高的組培苗作為試驗(yàn)材料。

分別提取3株未受脅迫的生長(zhǎng)狀況良好的大青楊的根莖葉的RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以根為對(duì)照組，使用大青楊PtrActin基因作為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)內(nèi)參引物由庫(kù)美生物公司合成正向引物PtrActin-F:5′-TGTTGCCCTTGACTATGAGCAGGA-3′以及反向引物PtrActin-R:5′-ACGGAATCTCTCAGCTCCAATGGT-3′，長(zhǎng)度為165 bp。

將生長(zhǎng)良好、狀態(tài)相似的大青楊組培苗插入添加7% PEG6000的1/2MS固體培養(yǎng)基中模擬干旱脅迫，在脅迫0、6、12、24 h時(shí)分別提取根莖葉部位的RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA(每個(gè)脅迫時(shí)間段選取3個(gè)獨(dú)立植株)。以未處理的根部的表達(dá)量為對(duì)照組，分別用提取的各個(gè)脅迫時(shí)間段的cDNA為模版，通過(guò)熒光定量PCR儀(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)使用南京諾唯贊生物生產(chǎn)的ChamQTMUniversal SYBR? qPCR Master Mix進(jìn)行qRT-PCR分析，用2-ΔΔCT計(jì)算法計(jì)算其相對(duì)表達(dá)量。PCR總反應(yīng)體系為20 μL，其中cDNA模版1 μL、正反向引物各1 μL、2×Easy Taq PCR SuperMix酶10 μL、去離子水7 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 大青楊PubZIP1基因的克隆

以大青楊為材料分別提取根、莖、葉和總RNA(圖1)。利用總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以2000 Marker為對(duì)照，擴(kuò)增該基因的CDS序列，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為1 083 bp(圖2)。

圖1 大青楊RNA的提取 M. DNA Mareker DL2000；1～5.RNA產(chǎn)物Fig.1 The RNA production of P.ussuriensis Kom. M.DNA Mareker DL2000；1-5.RNA production

圖2 大青楊PubZIP1基因的克隆 M. DNA Mareker DL2000；1～5.PubZIP1克隆產(chǎn)物Fig.2 PCR production of PubZIP1 M.DNA Mareker DL2000；1-5.PCR production of PubZIP1

2.2 大青楊PubZIP1基因編碼的氨基酸序列及其理化特性

2.2.1 大青楊PubZIP1基因編碼的氨基酸序列

通過(guò)在線(xiàn)查詢(xún)得知大青楊PubZIP1基因共編碼360個(gè)氨基酸(圖3)。利用ExPASy服務(wù)器中的Protparam工具分析蛋白的理化性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)氨基酸的數(shù)量為360，分子質(zhì)量為40 645.82，理論等電子點(diǎn)為6.68，總共包括5 670個(gè)原子，分子式為C1772H2812N530O543S13，在組成蛋白的20種氨基酸中，亮氨酸(Leu)所占比例最高，占10.8%，(Cys)所占比例最低，占0.3%，不包括含硒半胱氨酸(Sec)和吡咯賴(lài)氨酸(Pyl)。蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為47.52，脂肪指數(shù)為81.67，總平均親水性為-0.531。

2.2.2 大青楊PubZIP1基因的理化特性2.2.2.1 大青楊PubZIP1基因編碼的蛋白疏水性

根據(jù)ExPASy服務(wù)器中的ProtScale程序分析大青楊PubZIP1蛋白的疏水性，計(jì)算基于K-D法的蛋白質(zhì)疏水性。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第285位的氨基酸為纈氨酸(Val)，疏水性最大，分值為1.833；第70位的氨基酸為谷氨酸(Glu)，親水性最大，分值為-2.522。根據(jù)圖4中數(shù)據(jù)，分值為負(fù)值的氨基酸數(shù)量大于分值為正值的氨基酸數(shù)量，表示親水性大于疏水性，因而推測(cè)該蛋白為親水性蛋白。

2.2.2.2 大青楊PubZIP1基因編碼的蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)及功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

通過(guò)在線(xiàn)預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，如圖5所示該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是由α-螺旋(62.50%)，無(wú)規(guī)卷曲(29.72%)，延伸鏈(5.56%)，β-折疊(2.22%)組成。

2.2.2.3 對(duì)蛋白跨膜區(qū)進(jìn)行分析

通過(guò)TMHMM Server v.2.0對(duì)蛋白進(jìn)行跨膜區(qū)分析(圖6)。發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜表面并沒(méi)有典型的跨膜螺旋區(qū)，也沒(méi)有氨基酸位于細(xì)胞膜內(nèi)，參考該蛋白的疏水性區(qū)域分析結(jié)果，表明該蛋白并不是一個(gè)與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)的膜受體蛋白。

圖3 大青楊PubZIP1基因序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.3 Nucleotide and deduced polypeptide sequences of PubZIP1

圖4 PubZIP1蛋白的疏水性預(yù)測(cè)Fig.4 Hydrophobicity analysis prediction PubZIP1 protein

2.2.2.4 蛋白信號(hào)肽及蛋白卷曲螺旋預(yù)測(cè)分析

使用SignalP 3.0 server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/)對(duì)蛋白進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)N端沒(méi)有信號(hào)肽。預(yù)測(cè)結(jié)果如圖7所示。使用COILS Server對(duì)蛋白卷曲螺旋預(yù)測(cè)分析，分析結(jié)果如圖8所示，檢測(cè)不到該蛋白具有卷曲螺旋結(jié)構(gòu)。

2.2.2.5 蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

通過(guò)NCBI在線(xiàn)分析蛋白的功能結(jié)構(gòu)域，分析結(jié)果如圖9所示。經(jīng)過(guò)分析得出該蛋白包括bZIP結(jié)構(gòu)域和DOG1結(jié)構(gòu)域。bZIP結(jié)構(gòu)域由第163到239的77個(gè)氨基酸構(gòu)成bZIP結(jié)構(gòu)域，bZIP結(jié)構(gòu)域廣泛存在于植物蛋白中。它們?cè)谌藢俸彤愘|(zhì)二聚體的網(wǎng)絡(luò)中起作用，調(diào)節(jié)一系列不同的細(xì)胞過(guò)程，包括細(xì)胞存活、學(xué)習(xí)和記憶、脂質(zhì)代謝和癌癥進(jìn)展等。它們?cè)趯?duì)刺激或壓力信號(hào)的反應(yīng)中扮演重要角色，如細(xì)胞因子、基因毒性藥物或生理應(yīng)激。DOG1結(jié)構(gòu)域由第77到129的53個(gè)氨基酸組成。

圖5 PubZIP1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5 Predicted secondary structure prediction of PubZIP1 protein

圖6 PubZIP1蛋白的跨膜區(qū)分析Fig.6 Transmembrane region prediction of PubZIP1 protein

2.2.2.6 氨基酸序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

通過(guò)在線(xiàn)比對(duì)氨基酸序列，將大青楊PubZIP1基因推導(dǎo)的氨基酸序列與其他植物相同基因的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果顯示，大青楊(Populusussuriensis)PubZIP1與棉花(Gossypiumhirsutum)、煙草(Nicotianatabacum)、甜椒(Capsicumannuum)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)等物種同源蛋白序列有高度保守性(圖10)。通過(guò)MEGA5.05軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建(圖11)，大青楊(Populusussuriensis)與蘿藦(Ricinuscommunis)、紅茄苳(Rhizophoramucronata)有較近的遺傳距離，所以預(yù)測(cè)他們有更近的親緣關(guān)系。而與蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)、大豆(Glycinesoja)、桑樹(shù)(Morusnotabilis)、煙草(Nicotianatabacum)、甜椒(Capsicumannuum)遺傳距離較遠(yuǎn)，因此預(yù)測(cè)他們親緣關(guān)系更遠(yuǎn)。

2.2.2.7 大青楊PubZIP1基因的亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)結(jié)果

利用基因槍分別將金粉包裹的pCAMBIA1300-PubZIP1-GFP質(zhì)粒和pCAMBIA1300-GFP質(zhì)粒通過(guò)基因槍轟擊洋蔥內(nèi)表皮，將洋蔥內(nèi)表皮放置在1/2MS培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)24 h后，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)(圖12)，對(duì)照pCAMBIA1300-GFP空載體在整個(gè)洋蔥細(xì)胞均能看到綠色熒光，為組成型表達(dá)；pCAMBIA1300-PubZIP1-GFP的融合表達(dá)載體在35S啟動(dòng)下PubZIP1-GFP融合蛋白發(fā)出熒光，這進(jìn)一步證明PubZIP1定位在細(xì)胞核中，具有轉(zhuǎn)錄因子的一般特征。

圖7 PubZIP1蛋白的信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig.7 Signal peptide prediction of the PubZIP1 protein

圖8 PubZIP1蛋白的卷曲螺旋預(yù)測(cè)Fig.8 Coiled coils prediction of PubZIP1 protein

圖10 大青楊PubZIP1氨基酸與其他植物氨基酸序列比對(duì)(框選為保守區(qū)域)Fig.10 P.ussuriensis alignment analysis of PubZIP1 conservative structure domain in different plants(boxes selected as conservative areas)

圖11 不同植物PubZIP1基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(鄰接法)及保守區(qū)域 A.系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；B.氨基酸序列保守區(qū)域Fig.11 Molecular phylogenetic tree analysis of PubZIP1 in plant species A.Molecular phylogenetic tree; B.The conserved region of amino acid sequence

圖12 大青楊PubZIP1基因的亞細(xì)胞定位Fig.12 Subcellular localization analysis of the PubZIP1 gene

圖13 大青楊PubZIP1基因在PEG6000處理下不同時(shí)間段的組織特異性表達(dá)情況Fig.13 Quantitative real-time PCR analysis of the expression pattern of PubZIP1 gene in different tissues after 7% PEG6000 treatment

2.2.2.8 大青楊PubZIP1基因的表達(dá)模式分析

分別檢測(cè)PubZIP1基因在不同PEG6000脅迫時(shí)間下大青楊根、莖、葉中的表達(dá)量(圖13)，以脅迫0 h的PubZIP1基因在大青楊根部中的表達(dá)量為對(duì)照組，分析結(jié)果表明脅迫后PubZIP1基因在大青楊根中的表達(dá)量呈下降趨勢(shì)。而在大青楊莖和葉片中的表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，尤其是在葉片中明顯被誘導(dǎo)表達(dá)。預(yù)測(cè)該基因可能主要在葉片中表達(dá)并行使功能。

3 討論

植物的生長(zhǎng)和發(fā)育經(jīng)常受到各種不利的生物和非生物脅迫(如干旱、高鹽和低溫)的影響。植物本質(zhì)上是固著的，因此它們發(fā)展出一系列有效的機(jī)制來(lái)感知并對(duì)這些環(huán)境壓力做出充分的反應(yīng)，例如，通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子與它們的啟動(dòng)因子中存在的特定順式作用元件結(jié)合，對(duì)應(yīng)激反應(yīng)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控。本研究從大青楊中克隆獲得PubZIP1轉(zhuǎn)錄因子，該基因包括有1 083 bp的CDS序列，共編碼360個(gè)氨基酸。通過(guò)對(duì)PubZIP1氨基酸序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及保守區(qū)域可知，分析得出該蛋白包括bZIP結(jié)構(gòu)域和DOG1結(jié)構(gòu)域。通過(guò)預(yù)測(cè)不含有指導(dǎo)蛋白轉(zhuǎn)移的信號(hào)肽和跨膜運(yùn)輸結(jié)構(gòu)。蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是由α-螺旋(62.50%)、無(wú)規(guī)卷曲(29.72%)，構(gòu)成，其次還有少量延伸鏈(5.56%)，β-折疊(2.22%)。通過(guò)亞細(xì)胞定位技術(shù)，證明該基因位于細(xì)胞核中。

研究發(fā)現(xiàn)，bZIP在不同植物中參與抗旱脅迫，例如：小麥中bZIP類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子編碼的基因Wa-bi5，其表達(dá)量在干旱脅迫下明顯上調(diào)，轉(zhuǎn)Wa-bi5基因的煙草對(duì)干旱的耐受性也顯著增強(qiáng)[27]；在擬南芥中bZIP轉(zhuǎn)錄因子ABF3/ABF4可以提高植株的抗旱性[28]；在大豆中克隆的GmbZIP-32基因在干旱和高鹽脅迫下表現(xiàn)出不同程度的響應(yīng)應(yīng)答[29]；桑樹(shù)MnbZIP基因?qū)儆赽ZIP轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)熒光定量PCR法對(duì)MnbZIP在干旱、高鹽和低溫條件下的表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果表明，該基因表達(dá)量在這幾種脅迫下都有上調(diào)[30]。我們對(duì)生長(zhǎng)狀態(tài)相同的大青楊分別使用模擬抗旱的7% PEG6000處理不同時(shí)間，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法分析PubZIP1在PEG6000脅迫下的表達(dá)情況。結(jié)果表明，在PEG處理下PubZIP1在葉片部位和莖部的表達(dá)量明顯被誘導(dǎo)上調(diào)，在根部的表達(dá)量明顯被誘導(dǎo)下調(diào)。表明PubZIP1可能參與了大青楊對(duì)滲透脅迫的信號(hào)傳導(dǎo)，屬于逆境脅迫下的調(diào)控因子。

本研究初步證明大青楊PubZIP1基因具有一定的抗旱能力，但是關(guān)于其信號(hào)傳導(dǎo)與調(diào)控機(jī)制的研究需進(jìn)一步的研究。由于大青楊物種的基因組測(cè)序并未完成，所以需要進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)更多的基因組信息及其結(jié)構(gòu)和功能。本文從大青楊中克隆出PubZIP1基因，并通過(guò)生物信息學(xué)和非生物因素脅迫等方法預(yù)測(cè)基因結(jié)構(gòu)和功能。不僅為大青楊基因組的測(cè)序完成提供更多的數(shù)據(jù)，同時(shí)為大青楊bZIP1基因的抗旱研究提供理論基礎(chǔ)。