巫偉峰 沈璽龍 陳 哲 楊鼎元 李永霞 王 瑤 張群英*

(1.貴州省植物園，貴陽 550000； 2.中國科學(xué)院廬山植物園，九江 332900)

懸鉤子屬(Rubus)是薔薇科(Rosaceae)的一個大屬，又稱樹莓屬，共1 000余種[1]，主要分布在北半球溫帶地區(qū)，少數(shù)生長在熱帶和南半球。我國是懸鉤子屬植物野生資源非常豐富的國家，有194種，88變種，其中特有種138種[2]，種類之多僅次于北美起源中心。在懸鉤子屬植物的遺傳與繁殖過程中存在無融合生殖、多倍化、頻繁雜交等現(xiàn)象，這導(dǎo)致其遺傳背景復(fù)雜，物種的分類與鑒定困難較大[3]。目前，國際上懸鉤子屬的植物學(xué)分類以Focke[4～6]的12亞屬劃分最受認(rèn)可。而在中國，Yu等將中國懸鉤子屬植物分為8組[7](多數(shù)與Focke系統(tǒng)的屬相對應(yīng))，并被廣泛應(yīng)用于我國懸鉤子屬植物的物種鑒定[3]。這兩種分類系統(tǒng)都基于形態(tài)學(xué)差異，在實際應(yīng)用中易受專業(yè)性強(qiáng)、植株生長環(huán)境及發(fā)育階段影響等問題的限制，較大影響了懸鉤子屬植物物種鑒定效率。

近年新興的DNA條形碼技術(shù)，利用一個或幾個標(biāo)準(zhǔn)DNA序列實現(xiàn)對物種的分類與鑒別[8]。因其簡便、通用性高、穩(wěn)定性好、不受生長環(huán)境和生長發(fā)育階段的限制等特點被廣泛用于分子系統(tǒng)學(xué)和物種鑒定[9～12]、生物多樣性[13]和生態(tài)學(xué)[14]等研究，是傳統(tǒng)鑒定方法的有效補充[15]，這為懸鉤子屬植物的快速鑒定提供了可能。目前，在DNA條形碼研究報道中應(yīng)用較多的標(biāo)準(zhǔn)序列有ITS、ITS2、matK、psbA-trnH、rbcL、rpoC1等[16]。其中matK和rbcL在2009年被國際條形碼協(xié)會植物工作組提出作為陸地植物通用的條形碼序列，并建議將葉綠體基因片段psbA-trnH和核糖體DNA ITS作為補充條形碼[17]。2011年，中國植物條形碼研究組通過對1 757種植物的psbA-trnH、ITS/ITS2及rbcL+matK序列或序列組合進(jìn)行鑒別能力評價，提出將ITS/ITS2序列作為種子植物的核心條形碼，psbA-trnH作為輔助條形碼序列[18]。在懸鉤子屬植物研究中，陳小露等利用ITS2序列對茅莓根及其混偽品進(jìn)行了鑒定，成功區(qū)分了茅莓根與其混偽品[19]。Wang等將3個葉綠體基因組片段rbcL、rpl20-rps12和trnG-trnS，3個核基因組片段nrITS、GBSSI-2和PEPC共6個DNA片段組合重構(gòu)了中國懸鉤子屬系統(tǒng)發(fā)育樹[3]。呂群丹等基于ITS2序列對畬藥擱公扭根及其同屬易混種進(jìn)行了分子鑒定，成功鑒別了擱公扭根基源植物及其9種同屬易混種[20]。但迄今未見懸鉤子屬植物DNA條形碼篩選的相關(guān)報道。

NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫是國際上權(quán)威的序列數(shù)據(jù)庫，其收集的數(shù)據(jù)具有來源廣泛、認(rèn)可度高、標(biāo)準(zhǔn)化等特點，是基因克隆與表達(dá)分析、分子標(biāo)記挖掘、基因功能預(yù)測等生物學(xué)研究最常用的數(shù)據(jù)共享平臺。其中也收集了大量物種的條形碼序列，這為不同物種DNA條形碼通用序列的初步篩選與評估提供了可靠的數(shù)據(jù)源，有利于縮減DNA條形碼篩選周期、節(jié)約成本。本研究通過barcoding gap、遺傳變異、建樹等分析方法，基于GenBank數(shù)據(jù)初步評估了ITS、ITS2、matK、rbcL、trnH-psbA、trnL-trnF6個DNA條形碼候選序列對懸鉤子屬植物的鑒別能力，旨在篩選獲得適用于懸鉤子屬植物的DNA條形碼通用序列，為懸鉤子屬植物的DNA條形碼分子鑒定研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載懸鉤子屬ITS、ITS2、matK、rbcL、trnH-psbA、rtnL-trnF相關(guān)序列。其中18種的ITS、ITS2序列各50條，15種的葉綠體matK序列45條，20種的葉綠體rbcL序列60條，11種的葉綠體trnH-psbA序列30條，14種的葉綠體rtnL-trnF序列42條。

1.2 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)GenBank注釋去除trnH-psbA和rtnL-trnF序列兩端的編碼區(qū)，及ITS序列兩端的18S和26S區(qū)段。并基于隱馬爾可夫模型HMMer真核生物注釋方法，去除序列兩端5.8S和26S區(qū)段獲得ITS2間隔區(qū)序列[21]。matK、rbcL為部分編碼序列。用ClustalX v2.1軟件[22]對序列進(jìn)行多序列比對，BioEdit軟件[23]對比對結(jié)果校正切齊。用SpeciesIdentifier軟件進(jìn)行g(shù)ap barcoding檢驗[24]。用MEGA X軟件[25]基于K2P模型分別計算種內(nèi)及種間遺傳距離、序列變異信息，并使用鄰接法(Neighbor-Joining,NJ)構(gòu)建NJ一致樹(空隙采用完全缺失處理，bootstrap進(jìn)行1000次重復(fù)抽樣檢驗獲得分支支持率)。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列特征

對6條候選序列分別進(jìn)行序列分析(表1)。ITS、matK、rbcL3個候選條形碼序列長度大于400 bp，ITS2、trnH-psbA、rtnL-trnF的序列長度小于400 bp。ITS、ITS2、rbcL的G+C含量介于40%～60%，matK、trnH-psbA、rtnL-trnF的GC含量小于40%，尤其是trnH-psbA的G+C含量介于22.1%～30.6%。變異位點占比最高的3個候選條形碼依次為trnH-psbA、ITS2、ITS。

2.2 種間與種內(nèi)遺傳變異評估

由表2所示，6個候選條形碼中trnH-psbA的總變異最高，遠(yuǎn)高于其他候選條形碼，總變異高低次序為trnH-psbA>ITS2>ITS>matK>rtnL-trnF。6個候選條形碼中種內(nèi)變異與種間變異差異最為明顯的是trnH-psbA，其次為matK、rbcL、rtnL-trnF。為了量化種間變異與種內(nèi)變異的差異程度，本研究引入“變異分辨率”的概念，百分比越高說明種內(nèi)變異與種間變異的差異越大，區(qū)分能力也越強(qiáng)。α表示變異分辨率(variation resolution)，α=(種間變異-種內(nèi)變異)/(種間變異+種內(nèi)變異)。α的大小次序為trnH-psbA>matK>rbcL>rtnL-trnF>ITS>ITS2。6個候選條形碼的種內(nèi)最大變異均大于種間最小變異。

表1 候選序列的序列結(jié)構(gòu)及變異信息

Table 1 Sequence structure and variation information of candidate sequences

序列名稱Sequence name序列長度Sequence length(bp)G+C含量G+C content(%)變異位點Variable sites(%)ITS569～57254.1～58.223.0ITS2193～19653.1～61.341.0matK65933.0～34.37.6rbcL50244.4～45.26.2trnH-psbA129～14922.1～30.648.4rtnL-trnF364～37829.1～30.610.5

圖1 種內(nèi)變異與種間變異的barcoding gap圖Fig.1 Barcoding gap diagram of intraspecific variation and interspecies variation

表2 候選條形碼的遺傳變異

圖2 基于matK、trnH-psbA構(gòu)建的NJ一致樹 A.基于matK構(gòu)建的NJ一致樹；B.基于trnH-psbA構(gòu)建的NJ一致樹 分支僅顯示50%以上的bootstrap value。Fig.2 NJ consistent tree based on matK,trnH-psbA The branch only shows more than 50% of the bootstrap value,A is an NJ consistent tree based on matK,and B is an NJ consistent tree based on trnH-psbA.

2.3 Barcoding gap評估

理想的DNA條形碼鑒定序列種內(nèi)遺傳變異應(yīng)明顯小于種間遺傳變異，兩者之間具有明顯的間隙，即barcoding gap[26]。如圖1所示，ITS、ITS2的種間與種內(nèi)變異頻率分布重疊較大，matK、rbcL、trnH-psbA、rtnL-trnF4個條形碼的種間與種內(nèi)變異分布頻率具有較明顯的間隙(gap)，其中matK和trnH-psbA的gap最明顯。

2.4 NJ一致樹分析

在物種的DNA條形碼分子鑒定中，NJ一致樹也是一種常用的條形碼評估方法，良好的條形碼序列能將不同物種材料進(jìn)行有效鑒別，形成單系性分支，并獲得高支持率。本研究分別基于6個候選條形碼構(gòu)建NJ一致樹，計算獲得各候選條形碼有效單系性(支持率>50%)比例分別為ITS：33%，ITS2：28%；matK：67%，trnH-psbA：64%，rbcL：30%，rtnL-trnF：43%。其中，matK和trnH-psbA的有效單系性比例最高，能有效區(qū)分60%以上的參試物種，相比ITS、ITS2、rbcL、rtnL-trnF對懸鉤子屬植物具有較高的鑒別能力，如圖2為matK、trnH-psbA構(gòu)建的NJ一致樹。

3 討論

評價不同序列的barcoding gap是判斷不同條形碼優(yōu)劣的標(biāo)準(zhǔn)之一[13,27]。理想的DNA條形碼序列檢測到的種間遺傳變異應(yīng)明顯大于種內(nèi)遺傳變異，在遺傳變異分布頻率圖中(即barcoding gap檢測圖)種內(nèi)變異與種間變異之間具有明顯的gap[26]。本研究的遺傳變異分析顯示，6個候選條形碼中種內(nèi)變異與種間變異差異較大的有trnH-psbA、matK、rbcL和rtnL-trnF，變異分辨率分別為97.32%、83.33%、79.07%、64.95%，matK、trnH-psbA、rbcL和rtnL-trnF的barcoding gap也較為明顯?？梢?，從遺傳變異的角度來看matK、trnH-psbA、rbcL和rtnL-trnF4個候選條形碼對懸鉤子屬植物具有較強(qiáng)的鑒別潛能。除利用遺傳變異分析種內(nèi)變異與種間變異的差異程度、檢測barcoding gap外，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)行樹進(jìn)行物種單系性分析也是篩選DNA條形碼的一條重要途徑[13]。本研究通過構(gòu)建NJ一致樹，結(jié)果顯示matK的單系性比例最高(67%)，其次為trnH-psbA(64%)，而rtnL-trnF的單性系比例為43%，rbcL僅30%。因此，從建樹分析角度來看，以matK、trnH-psbA作為懸鉤子屬物種鑒定的條形碼是較優(yōu)選擇。綜合考慮，筆者認(rèn)為matK、trnH-psbA2個條形碼序列在懸鉤子屬的物種鑒定中具有較大的鑒定潛力。陳小露等曾利用ITS2序列對茅莓根及其混偽品(粗葉懸鉤子、山莓、銹毛莓、空心泡、百花懸鉤子、插田泡等)進(jìn)行鑒別，NJ建樹分析顯示茅莓及其混偽品能夠表現(xiàn)良好的單系性，ITS2對茅莓、粗葉懸鉤子、山莓、銹毛莓、空心泡、百花懸鉤子、插田泡具有較好的鑒別能力[19]。而本研究中ITS2在NJ一致樹中的單系性比例僅28%，其中山莓(R.corchorifolius)(79%)、山楂葉懸鉤子(R.crataegifolius)(89%)、R.odoratus(100%)、北懸鉤子(R.arcticus)(58%)獲得較好的區(qū)分，但茅莓(R.parvifolius)、銹毛莓(R.reflexus)、插田泡(R.coreanus)沒有獲得有效鑒別，這與取樣的范圍相關(guān)，GenBank數(shù)據(jù)來源范圍的擴(kuò)大可能會降低條形碼的鑒別力。

越來越多的研究表明靠單一片段不太可能實現(xiàn)對所有植物物種進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定[28～30]。因此篩選條形碼不能僅關(guān)注單個片段，必要時可以考慮增加片段數(shù)量(即片段組合策略)。Kress等2005年在其研究中最早提出片段組合觀點，并建議將ITS+trnH-psbA作為被子植物鑒定的條形碼組合[31]；2007年Kress和Erickson又提出使用rbcL+trnH-psbA組合對陸生植物進(jìn)行識別與鑒定[32]；2009年，國際生命條形碼聯(lián)盟植物工作組建議將rbcL+matK組合作為陸地植物的核心條形碼[17]；近年我國學(xué)者也在DNA條形碼研究領(lǐng)域做了大量突出的研究工作，2011年中國植物條形碼研究組通過對1 757種植物的psbA-trnH、ITS/ITS2及rbcL+matK序列或序列組合進(jìn)行鑒別能力評價，提出將ITS/ITS2序列作為種子植物的核心條形碼，psbA-trnH作為輔助條形碼序列[18]。從本研究的遺傳變異、NJ一致樹等分析結(jié)果來看，單個片段無法實現(xiàn)對懸鉤子屬植物100%的鑒別。6個候選條形碼中matK和trnH-psbA對懸鉤子屬植物的鑒別潛力最大，而ITS、ITS2、rbcL、trnL-trnF對懸鉤子植物的鑒別潛力相對較差，但也具有一定的鑒別力。因此，筆者認(rèn)為在對懸鉤子屬植物進(jìn)行DNA條形碼鑒定時可以適當(dāng)增加片段數(shù)量，將具有較高鑒別潛力的matK和trnH-psbA作為懸鉤子屬植物鑒定的核心條形碼，而鑒別潛力相對較弱的ITS、ITS2、rbcL、rtnL-trnF作為輔助條形碼。