關 韜 劉 超 李開隆 夏德安 馬旭俊

(東北林業(yè)大學林木遺傳育種國家重點實驗室，哈爾濱 150040)

環(huán)境溫度的季節(jié)性波動影響植物生長和發(fā)育的各個方面，嚴重限制植物的繁殖和地理分布[1]。在自然環(huán)境的溫度變化中，低溫是影響植物生長發(fā)育的重要條件[2]。在植物的整個成長過程中，低溫會對其產生許多不利影響，在早期生長的關鍵時期尤為明顯。短期內的溫度突然下降或低溫期的延長將影響植物的光合作用，使植物的光能吸收效率和利用效率有所下降。植物的正常生長發(fā)育受其影響，導致產量和品質下降[3]。通過植物基因工程的方法改良植物是提高其低溫耐受能力的重要手段之一[4]。植物對壓力的反應是生理、生化和結構的變化，而許多基因的表達也會發(fā)生變化。在真核生物中，基因表達的表觀遺傳調控在各種發(fā)育過程和應激反應中起著至關重要的作用。其中一個重要的表觀遺傳調控是染色質修飾[5]。

組蛋白去乙?；?HDAC)在酵母、動物和植物中廣泛存在，是一個超基因家族。根據(jù)植物與酵母HDAC序列的同源性比較，可以把植物HDAC分為RPD3/HDA1、SIR2和HD2三個亞家族。RPD3/HDA1亞家族成員的酶活性取決于細胞中是否含有Zn2+，屬于Zn2+依賴型組蛋白去乙?；?。植物在整個生長發(fā)育過程中，隨著RPD3/HDA1亞家族基因表達水平的上調或下降，植物的表型也會發(fā)生相應改變[6～7]。該家族中的組蛋白去乙酰化酶參與調節(jié)植物在生物脅迫(病蟲害)和非生物脅迫(高鹽，干旱，低溫等)下的應激反應[8～11]。

本實驗室前期克隆了毛果楊組蛋白去乙?；窻PD3/HDA1亞家族基因HDA902[12]。表達分析表明，HDA902基因的表達受非生物脅迫的影響，低溫可誘導HDA902基因的表達[13]。在此基礎上，構建了植物過表達載體pROK Ⅱ-HDA902，并采用農桿菌介導法將其轉化到野生型煙草中，獲得轉基因植株。對HDA902轉基因煙草耐低溫能力進行分析，進而明確HDA902在低溫脅迫應答反應中的功能。

1 材料與方法

1.1 植物表達載體構建

利用RT-PCR方法，從毛果楊葉片中克隆組蛋白去乙?；窻PD3/HDA1亞家族基因HDA902(XM_002313528)?；厥詹⒓兓疨CR擴增片段，與載體pMDl9-T Vector連接，轉化大腸桿菌，得到重組質粒pMD19-HDA902并測序。對pMD19-HDA902和pROKⅡ空質粒進行雙酶切，使用的限制性核酸內切酶為XbaⅠ和KpnⅠ?；厥詹⒓兓康钠?，利用T4連接酶連接過夜，并通過熱激法將連接產物轉化到大腸桿菌中。然后提取大腸桿菌質粒用于雙酶切鑒定。植物表達載體通過熱激法轉化農桿菌EHA105，然后繼續(xù)擴大培養(yǎng)陽性單克隆菌落用于提取重組質粒進行雙酶切鑒定，所需限制性核酸內切酶為XbaⅠ和KpnⅠ。

1.2 農桿菌轉化煙草及轉基因植株的獲得

利用農桿菌介導法進行煙草的遺傳轉化。首先獲得煙草組織培養(yǎng)幼苗，用滅菌過的剪刀將葉片切成2 cm×2 cm大小的正方形。將煙草葉片浸沒于重組農桿菌菌液中10 min，然后用吸水紙輕輕擦拭葉片，吸收多余的菌液。將侵染過和未侵染過的煙草葉片放在相同的共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，在室溫下進行暗培養(yǎng)。將暗培養(yǎng)3 d后的煙草葉片轉移至含抗生素的篩選分化培養(yǎng)基上，而未侵染過的煙草葉片則置于不含抗生素的普通分化培養(yǎng)基上(作為對照)，將少許未侵染過的葉片放于抗性篩選培養(yǎng)基中以驗證抗生素是否失效。侵染后的葉片被放置在光周期為16 h光照/8 h黑暗，溫度為23～25℃的培養(yǎng)室中，定期更換抗性篩選培養(yǎng)基，每7天為1個周期，直到獲得轉基因煙草。

1.3 轉基因煙草的分子檢測

提取野生型和轉基因煙草的總RNA，然后利用反轉錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit(Takara)，將總RNA反轉錄成cDNA。按照試劑盒說明，利用RT Primer Mix引物(含有Oligo dT Primer和Random 6 mers)進行反轉錄。反轉錄時，20 μL體系里使用的RNA量是1 000 ng。以野生型和轉基因煙草的cDNA為模板，以GGCCTCCATCATGCTAAGAA作為HDA902基因的正向引物，以CAGAACACGCTCATGCACTT作為反向引物，進行半定量RT-PCR檢測。在RT-PCR反應中，以18S rRNA基因作為內參照基因，其特異性引物序列為：正向引物TCAACTTTCGATGGTAGGATAGTG；反向引物CCGTGTCAGGATTGGGTAATTT。PCR(20 μL)反應體系：2×Taq PCR StarMix with loading Dye 10 μL；ddH2O 7 μL；正反向引物(10 μmol·L-1)各1 μL；模板DNA(100 ng·μL-1)1 μL。PCR反應條件：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)26次；72℃延伸10 min，16℃保溫。

1.4 轉基因煙草的耐低溫能力分析

選取野生型煙草WT-1和生長狀態(tài)良好且轉基因表達量較高的HDA902轉基因煙草Tr-10、Tr-17株系(純系)作為低溫處理的植物材料。首先用75%乙醇清洗煙草種子，時間不超過30 s，然后用30%次氯酸鈉溶液對種子進行5 min的消毒，消毒后用無菌蒸餾水清洗種子3～5次，最后將經過消毒處理的種子均勻鋪在1/2 MS培養(yǎng)基上。經4℃低溫春化2 d后，將種子放于25℃、16 h光照/8 h黑暗的環(huán)境下培養(yǎng)2周。當煙草長出第3、4片葉時，進行耐低溫能力分析。低溫處理時，一批植株(包括WT，Tr-10和Tr-17)在植物培養(yǎng)室(23～25℃)培養(yǎng)2周，作為對照；另一批植株進行低溫處理，即將煙草植株置于2℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)1周后再轉移至室溫環(huán)境下，繼續(xù)培養(yǎng)1周。3次實驗重復。觀察和測量野生型和轉基因煙草在低溫脅迫下的生長情況及生理指標變化。用NBT和DAB這兩種染料對野生型和轉基因煙草的葉片進行染色，以此分析低溫脅迫下HDA902基因對煙草活性氧積累起到的調控作用。

此外，對4周齡的轉基因煙草植株進行了低溫(2℃)處理，處理時間為0、1、2和3 d。然后，測定煙草葉片的丙二醛(MDA)和脯氨酸(Proline)含量。3次實驗重復。

1.5 丙二醛測定

(1)取約0.1 g植物材料，液氮研磨后迅速稱取粉末質量W，加入1.5 mL 10%三氯乙酸震蕩混勻，4℃放置30 min后，11 000×g離心20 min；

(2)取上清液(即酶液)1 mL，加入1 mL 0.6% TBA，混勻后沸水浴反應15 min；

(3)冷卻至室溫，12 000×g離心20 min，吸取上清液分別測450和532 nm處的吸光值，所有樣品使用一個對照，即1 mL H2O加上1 mL 0.6% TBA。

C(MDA濃度μmol·L-1)=6.45OD532-0.56OD450

(1)

計算每克樣品中丙二醛的含量(μmol·g-1)：

y=(C×V)/W

(2)

式中：V=1 mL。

1.6 脯氨酸測定

(1)制作標準曲線，按照表1加入各種試劑，沸水浴反應40 min。取出冷卻后，加入5 mL甲苯充分震蕩，靜置待分層。取甲苯層測520 nm處吸光值，以1號管為實驗對照；

表1 制作標準曲線所需藥劑及含量

Table 1 Chemical agents and their contents of making standard curves

藥劑Chemical agent1234567標準液Standard solution(mL)00.20.40.81.21.62水H2O(mL)21.81.61.20.80.40冰乙酸Aceticacid(mL)2222222顯色液Chromogenic agent(mL)3333333脯氨酸含量Proline content(μg)0248121620

(2)取約0.1 g植物材料，液氮研磨后迅速稱取粉末質量W，加入2 mL 3%磺基水楊酸溶液，震蕩混勻，于沸水浴中浸提10 min；

(3)冷卻至室溫后，11 000×g離心5 min；

(4)上清液1 mL+1 mL冰乙酸+1.5 mL顯色液，混勻后沸水浴反應40 min；

(5)取出冷卻后，加入2.5 mL甲苯充分震蕩，靜置待分層，取甲苯層測520 nm處吸光值，以1號管為實驗對照。

2 結果與分析

2.1 植物表達載體構建

通過RT-PCR方法獲得HDA902基因片段(1 500 bp)，經過測序后克隆到pROKⅡ載體上，獲得pROKⅡ-HDA902重組載體并將其轉入農桿菌EHA105。利用限制性核酸內切酶XbaⅠ和KpnⅠ對重組質粒進行雙酶切鑒定。酶切產物條帶大小與HDA902基因片段大小一致，進而成功構建了植物表達載體(圖1)。

圖1 重組質粒pROKⅡ-HDA902的酶切鑒定 M. DNA Marker DL15000；1.HDA902基因片段的凝膠回收產物；2.pROKⅡ-HDA902重組質粒的XbaⅠ和KpnⅠ酶切產物；3.pROKⅡ質粒的XbaⅠ和KpnⅠ酶切產物Fig.1 Identification of the recombinant plasmid pROKⅡ-HDA902 by enzyme digestion M. DL15000 Marker; 1. HDA902 gene fragment; 2. Recombinant plasmid pROKⅡ-HDA902 digested by XbaⅠ and KpnⅠ; 3. Plasmid pROKⅡ digested by XbaⅠ and KpnⅠ

2.2 轉基因煙草的分子檢測

對野生型和HDA902轉基因煙草株系進行了半定量RT-PCR鑒定。結果顯示，野生型WT-1、WT-2和水(陰性對照)均沒有擴增出特異性片段，而HDA902轉基因煙草各株系能夠擴增出特異性片段(圖2)，表明HDA902基因能夠在轉基因煙草中表達。

圖2 HDA902轉基因煙草的RT-PCR鑒定 1. WT-1；2. WT-2；3～10.HDA902轉基因煙草株系；11.陰性對照(水)Fig.2 RT-PCR analysis of transgenic plants 1.WT-1; 2.WT-2; 3-10. HDA902 transgenic plants; 11.Negative control(ddH2O)

圖3 低溫處理下野生型煙草和轉基因煙草植株的生長情況 A.野生型和轉基因煙草植株在室溫(對照)和低溫條件下的生長情況(WT.野生型煙草；Tr-10，Tr-17.不同的轉基因株系)； B.野生型和轉基因煙草植株在室溫(對照)和低溫條件下植株鮮重Fig.3 Growth of wild type and transgenic tobacco plants under the cold stress A. Growth of wild type and transgenic tobacco plants under room temperature(control) and cold stress(WT. Wild type tobacco; Tr-10,Tr-17. Different transgenic lines); B.Fresh weight of wild and transgenic tobacco plants under room temperature(control) and cold stress

2.3 HDA902基因在低溫脅迫應答反應中的功能

2.3.1 兩周齡植株的低溫耐受性分析

在低溫耐受性分析中，選取2周齡植株進行低溫(2℃)處理。經過1周低溫處理，1周室溫恢復后，野生型和HDA902轉基因煙草的鮮重均有所增加，但轉基因煙草鮮重的增加量顯著高于野生型(圖3)。野生型低溫處理后鮮重增加了10%，而轉基因株系Tr-10和Tr-17的鮮重分別增加了28%和38%。這說明HDA902基因在煙草中的表達提高了轉基因煙草對低溫的耐受性，促進了轉基因煙草在低溫脅迫條件下的生長。

2.3.2 四周齡煙草低溫耐受性分析

在植物中，脯氨酸(Pro)含量的增加通常表明植物正處于不利于生長發(fā)育的逆境中，而丙二醇(MDA)含量的高低則顯示膜系統(tǒng)是否受到傷害以及受損程度的大小。將4周齡野生型和HDA902轉基因煙草進行低溫(2℃)處理，并分析轉基因煙草的低溫耐受性。低溫處理24 h時，野生型和轉基因煙草葉片MDA含量均增加，野生型煙草和轉基因煙草之間無顯著差異；而野生型煙草的Pro含量低于轉基因煙草。隨著時間的增加，轉基因煙草和野生型煙草之間的MDA和Pro含量在低溫處理72 h后呈現(xiàn)明顯差異，轉基因煙草的MDA含量顯著低于野生型，而Pro含量顯著高于野生型(圖5)。這些結果表明，HDA902通過影響MDA和脯氨酸的含量來提高轉基因煙草對低溫的耐受性。

圖4 低溫處理下野生型煙草和轉基因煙草葉片H2O2和的積累 A.NBT染色(WT.野生型煙草；Tr-10，Tr-17.不同的轉基因株系)；B. DAB染色Fig.4 The accumulation of H2O2 and in the leaves of wild type and transgenic tobacco after cold treatment A. NBT staining results(WT. Wild-type tobacco; Tr-10,Tr-17. Different transgenic lines); B. DAB staining results

圖5 低溫處理下野生型煙草和轉基因煙草葉片丙二醛和脯氨酸的含量 A.MDA含量(WT.野生型煙草；Tr-10和Tr-17.不同的轉基因株系)；B.脯氨酸含量Fig.5 Contents of MDA and Proline in wild type and transgenic tobacco leaves after cold treatment A. Contents of MDA(WT. Wild type tobacco; Tr-10,Tr-17. Different transgenic lines); B. Contents of proline

3 討論

在植物中，組蛋白去乙?；?HDAC)是一個超基因家族。目前，關于植物HDAC的研究越來越多，大多數(shù)都集中在HDAC在發(fā)育過程中的作用，HDAC在脅迫應答反應中的作用研究相對較少。雖然研究相對較少，但在草本植物和農作物中的研究表明，組蛋白去乙?；冈诿{迫應答反應中起著重要的調控作用，不同HDAC成員在脅迫應答反應中的作用不同[14～17]。Chen[14]等研究顯示，HDAC家族中的Ⅰ類酶(HDA19)酶活性被HDAC抑制劑抑制后，植株的耐鹽性提高。在擬南芥中，HDA6和HDA19在鹽和ABA[14]作用下對種子萌發(fā)起正調節(jié)作用，而HDA19對種子萌發(fā)和幼苗根系生長過程中鹽和干旱脅迫耐受性起負調節(jié)作用[18]。在木本植物中，對HDAC的研究鮮有報道。

本實驗室曾報道了楊樹RPD3/HDA1類型組蛋白去乙?；?4KHDA903在干旱脅迫反應中的作用。84KHDA903顯著提高了轉基因煙草的耐旱性[19]。與鹽和干旱脅迫應答反應研究相比，植物HDAC在響應低溫脅迫時的功能研究相對較少。To等[9]研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥HDA6基因的表達量在低溫處理72 h后明顯增加，說明組蛋白去?；富騂DA6參與低溫脅迫應答反應。Hu等[20]研究發(fā)現(xiàn)，當玉米植株從室溫轉移至低溫后，HDAC103、HDAC106、HDAC108和HDAC110這4個基因表達水平呈現(xiàn)出迅速提高的現(xiàn)象。本實驗室研究發(fā)現(xiàn)，毛果楊HDAC家族中大部分基因的表達受低溫誘導[21]，而毛果楊HDAC基因在低溫脅迫應答反應中的功能還不清楚。

本研究首次解析了木本植物HDAC在低溫脅迫中的功能。發(fā)現(xiàn)在低溫脅迫下，HDA902轉基因煙草會產生較少的活性氧，葉片丙二醛(MDA)含量較低，而脯氨酸含量較高。這些研究結果表明，毛果楊HDA902參與調控植物對低溫脅迫的耐受性，而具體的調節(jié)機制有待進一步探索。