祖述沖

(東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點實驗室,哈爾濱 150040)

紅松籽別名為果松子、海松子，是紅松的種子[1]。紅松(Pinuskoraiensis)為松科(Pinaceae)松屬(Pinus)，常綠針葉喬木，野生紅松主要分布在中國的小興安嶺及長白山地區(qū)，屬于國家珍貴瀕危樹種，被列為國家一級保護植物[2]。野生紅松需要生長50年后才能開始結(jié)松籽，成熟期為兩年[3]。果球大呈卵圓形，暗褐色，球內(nèi)結(jié)子，大如巴豆，故稱為紅松籽[4]。紅松籽去殼后得到紅松籽仁，屬于堅果類食物，不僅美味，而且具有食療的功效，受到歷代醫(yī)者、營養(yǎng)學(xué)者的推崇。紅松籽在我國古代就已有食用記載，宋朝時把紅松籽稱為“長生果”，具有延年益壽的作用。明代李時珍所著《本草綱目》記載：“松仁性溫，味甘，無毒，主治關(guān)節(jié)風(fēng)濕，頭眩，潤五臟，逐風(fēng)痹寒風(fēng)，補體虛，滋潤皮膚，久服輕身不老”[5]。紅松籽仁中除油脂外，還含有豐富的營養(yǎng)成分，包括：蛋白質(zhì)、糖類、脂肪和粗纖維等。其蛋白質(zhì)含量在13%～19%，并含有人體必需的多種氨基酸[6]。此外，紅松籽仁的營養(yǎng)價值極高，含有多種人體必需營養(yǎng)元素和豐富的維生素[7]。

紅松籽蛋白的提取主要是通過堿提酸沉法[8]、磷酸化化學(xué)改性[9]和酶法處理[10]等方法。提取后的粗蛋白主要用于蛋白類飲料的開發(fā)；紅松籽中脂肪酸的提取主要是通過壓榨法、超臨界二氧化碳法、有機溶劑浸出法，主要生產(chǎn)紅松籽油產(chǎn)品[11]。其中壓榨法綠色環(huán)保，無溶劑殘留，通過此法制備的紅松籽油受到廣大消費者的青睞。

目前市場上紅松籽油相關(guān)產(chǎn)品主要有紅松籽油軟膠囊和紅松籽油乳體飲料等。本文主要利用β-環(huán)糊精對紅松籽油進行包合制備工藝研究，使紅松籽油固體化，形成粒徑小、穩(wěn)定、體內(nèi)吸收率高的包合物，有利于保存和方便攜帶。本研究對皮諾斂酸在大鼠體內(nèi)生物利用度進行重點評價研究。

1 實驗儀器與材料

1.1 儀器

7890A型氣相色譜儀(美國Agilent公司)；DENVER型電子分析天平(美國丹佛儀器公司)；水浴鍋(上海遼卓科貿(mào)有限公司)；DF-101S數(shù)顯恒溫水浴磁力攪拌器(上海遼卓科貿(mào)有限公司)；101-2AB電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津泰斯特儀器有限公司)；SHB-IV雙A負壓真空泵(鄭州宏朗儀器設(shè)備有限公司)；VGT-2127QT超聲儀(深圳市固特宏業(yè)機械設(shè)備有限公司)；RE-201C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申盛儀器有限公司)；ZetaPALS激光粒度儀(美國布魯克海文)。

1.2 材料

紅松籽油(實驗室自制)；正己烷(天津市富于精細化工有限公司，分析純)；濃硫酸(北京化工廠有限公司，分析純)；無水乙醇(天津市天力化學(xué)試劑有限公司，分析純)；甲醇(山東禹王實業(yè)有限公司)；β-環(huán)糊精(阿拉丁化學(xué)試劑有限公司)；220-250gSD大鼠(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心)；石油醚(天津市富于精細化工有限公司，分析純)；皮諾斂酸準品(美國sigma公司)。

2 實驗方法

2.1 制備及檢測方法

紅松籽油包合物：將一定量的β-環(huán)糊精溶于去離子水中，50℃加熱攪拌至完全溶解后待用，稱取一定量的實驗室自制紅松籽油與乙醇按照一定比例(w/w)混合后，在加熱攪拌的條件下，將紅松籽油乙醇混合液緩慢加入β-環(huán)糊精水溶液中，加熱攪拌一定時間。反應(yīng)結(jié)束后，加入整個體系一倍體積的乙醇，放置0℃條件下，攪拌30 min后靜置3 h，過濾得到沉淀，再將沉淀用乙醇清洗3次。將清洗后的沉淀放置于60℃烘箱中，進行干燥，時間為4 h。干燥后的沉淀即為β-環(huán)糊精固體化的紅松籽油包合物。

紅松籽油包合物檢測：將干燥后的紅松籽油包合物與一定量的正己烷加入索氏提取器裝置中，80℃回流4 h進行提取。將回流后的提取液在45℃下進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，得到紅松籽油稱取質(zhì)量，通過甲酯化后進行氣象色譜(GC)檢測。

2.2 單因素優(yōu)化實驗方法

采用單因素法進行優(yōu)化實驗，通過預(yù)實驗確定紅松籽油包合實驗中的影響因素，即包合溫度、包合時間、乙醇加入量、紅松籽油加入量4個影響因素，其各因素變量范圍如表1所示。保持包合時間為2.5 h、500 mL的β-環(huán)糊精飽和溶液體系、紅松籽油與β-環(huán)糊精的摩爾比為1∶2、乙醇加入量為紅松籽油的3倍條件下不變，將包合溫度控制在40、45、50、55、60、65、70℃條件下進行優(yōu)化，并計算包合物固體化率選取最優(yōu)條件。保持包合溫度固定在50℃、500 mL的β-環(huán)糊精飽和溶液體系、紅松籽油與β-環(huán)糊精的摩爾比為1∶2、乙醇加入量為紅松籽油的3倍條件下不變，將包合時間控制在0.5、1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5 h進行優(yōu)化，并計算包合物固體化率選取最優(yōu)條件。保持包合溫度控制在50℃、包合時間為2.5 h、500 mL的β-環(huán)糊精飽和溶液體系、乙醇加入量為紅松籽油的3倍條件下不變，將按照紅松籽油與β-環(huán)糊精的摩爾比為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5進行優(yōu)化，并計算包合物固體化率選取最優(yōu)條件。包合溫度固定在50℃、包合時間為2.5 h、500 mL的β-環(huán)糊精飽和溶液體系、紅松籽油與β-環(huán)糊精摩爾比為1∶2保持不變，乙醇加入量控制在紅松籽油用量的0，1.5，3.0，4.5，6.0，7.5、9.0倍條件下進行優(yōu)化。

表1 紅松籽油包合物實驗影響因素變量范圍

固化率可以考察出紅松籽油包合情況，因此將紅松籽油固化率作為優(yōu)化考察結(jié)果。通過不同優(yōu)化條件分別計算紅松籽油的固化率，每組實驗平行重復(fù)3次，取平均值，選取最優(yōu)制備條件。

固化率計算公式為：

100%(1)

2.3 紅松籽油包合物檢測

2.3.1 紅松籽油甲酯化GC檢測

GC檢測條件：HP-5MS型石英毛細管柱(30 mm×0.25 mm×0.25 μm)；柱溫150～240℃，以5℃·min-1程序升溫；進樣口溫度250℃；柱前壓13.332 psi；分流比為1∶20；載氣為高純氦氣；進樣量2 μL。

2.3.2 粒徑檢測

紅松籽油包合物的粒徑都使用美國布魯克海文Zeta PALS激光粒度儀測定，將紅松籽油包合物用5 mL去離子水復(fù)溶，濃度為5 mg·mL-1，放入比色皿中，用激光粒度儀測定其乳液中紅松籽油的平均粒徑大小和所帶電荷數(shù)，每次實驗重復(fù)3次，取平均值。

2.4 紅松籽油包合物生物利用度檢測

2.4.1 灌胃紅松籽油

經(jīng)東北林業(yè)大學(xué)實驗動物倫理委員會的批準，取質(zhì)量為250±25 g的健康雌性SD大鼠12只，隨機將其平均分成兩組(n=6)，進行平行實驗。實驗前自由飲水、禁食，采用眼球后靜脈叢取血法，實驗前取1.0 mL空白血樣。分別灌胃紅松籽油和紅松籽油包合物，給藥劑量均為10 mL·kg-1(按含紅松籽油質(zhì)量計算)。給藥后分別于1/4、1/2、1、2、4、6、8、10、12、14、18、24 h分別取血1 mL，將所取血樣離心后取上清血漿0.2 mL。

2.4.2 血漿樣品預(yù)處理

2.4.3 血漿中皮諾斂酸的含量檢測

將之前取得大鼠空白血漿中加入皮諾斂酸標準品中，配置成0.08、0.02 μg·mL-1溶液，混合均勻。將所得樣品進行甲酯化處理，利用氣相色譜測定皮諾斂酸含量。采用外標法計算其他血漿樣品中皮諾斂酸的含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素優(yōu)化結(jié)果

3.1.1 包合溫度對紅松籽油的固化率的影響

如圖1所示，當(dāng)其他條件恒定時，隨著包合溫度的逐漸升高，紅松籽油的固化率是隨著溫度升高而增大，當(dāng)固化溫度達到50℃后固化率開始下降，原因是β-環(huán)糊精在水中的溶解度，隨著溫度增加溶解度增加，導(dǎo)致固化率下降。因此固化率最高時的溫度為50℃，即為71.81%，因此選擇50℃作為紅松籽油包合的最優(yōu)溫度。

圖1 溫度對固化率的影響Fig.1 The influence of temperature on the solidification rate

圖2 時間對固體化率的影響Fig.2 The influence of time on the solidification rate

3.1.2 包合時間對紅松籽油的固化率的影響

如圖2所示，當(dāng)其他條件恒定時，隨著包合時間的逐漸延長，紅松籽油的固化率是隨著時間的延長而增大，當(dāng)固化時間達到2.5 h后固化率開始下降，原因是已被β-環(huán)糊精包合的紅松籽油，隨著包合時間的增加，會引發(fā)紅松籽油過度飽和而析出，導(dǎo)致固化率下降。因此固化率最高時的時間為2.5 h，即為66.38%，因此選擇2.5 h作為紅松籽油包合的最優(yōu)時間。

3.1.3 紅松籽油加入量對紅松籽油的固化率的影響

如圖3所示，當(dāng)其他條件恒定時，紅松籽油的固化率是隨著紅松籽油的加入量減少而增加，當(dāng)紅松籽油與β-環(huán)糊精為1∶2后，固化率開始有所下降，原因是β-環(huán)糊精達到飽和后，過量的紅松籽油與被包合的紅松籽油之間，由于分子間的極性相同，相互吸引，而導(dǎo)致固化率下降。因此固化率最高時的比值為1∶2，即為72.63%，因此選擇皮諾斂酸與β-環(huán)糊精摩爾比為1∶2時為最優(yōu)條件。

圖3 紅松籽油加入量對于固化率的影響Fig.3 The influence of amount of peony seed oil on the solidification rate

圖4 乙醇加入量對于固化率的影響Fig.4 The influence of amount of ethanol on the solidification rate

3.1.4 乙醇加入量對紅松籽油的固化率的影響

如圖4所示，當(dāng)其他條件恒定時，紅松籽油的固化率是隨著乙醇的加入量增加而增大，當(dāng)乙醇的加入量為紅松籽油加入量的3倍后，固化率開始逐漸下降，原因是乙醇作為包合過程中水和紅松籽油的助乳化劑，對紅松籽油一定量的溶解度，所以加入少量的乙醇時未起到助乳化的作用，會使固化率下降，當(dāng)乙醇達到一定量時可發(fā)揮其助乳化作用，固化率隨之增大，當(dāng)過量的乙醇加入時，會產(chǎn)生對紅松籽油的溶解。因此固化率最高時的乙醇加入量為紅松籽油加入量的3倍，即為70.95%，在不加乙醇時的固化率為39.12%。因此選擇乙醇加入量為紅松籽油加入量的3倍時為最優(yōu)條件。

通過以上單因素優(yōu)化實驗可得制備紅松籽油包合物最佳工藝條件為：包合溫度50℃、包合時間為2.5 h、皮諾斂酸與β-環(huán)糊精的摩爾比為1∶2、乙醇加入量為紅松籽油用量的3倍(w/w)，在最優(yōu)條件下包合所得紅松籽油固化率為70.95%，經(jīng)索氏提取法檢測包合物含油率為26.88%。將最佳制備條件實驗重復(fù)3次。得固化率平均為69.55%。結(jié)果表明，在最優(yōu)制備條件下具有一定的重復(fù)性，因此可通過此方法制備紅松籽油包合物。

3.2 GC檢測結(jié)果

對紅松籽油進行甲酯化處理后采用GC對其主要脂肪酸組分進行分析，得到氣相色譜圖，如圖5～6所示，紅松籽油中皮諾斂酸含量為14.25%、亞油酸含量為47.30%、油酸含量為29.10%、硬脂酸含量為3.33%、棕櫚酸含量為6.03%；紅松籽油包合物中皮諾斂酸含量為14.35%、亞油酸含量為48.59%、油酸含量為28.80%、硬脂酸含量為2.76%、棕櫚酸含量為5.50%。結(jié)果表明，包合物中紅松籽油的脂肪酸各組分含量與紅松籽油中脂肪酸各組分含量無明顯差異性，因此說明了包合過程中不會對紅松籽油中各脂肪酸含量產(chǎn)生影響。

圖5 紅松籽油氣相色譜圖Fig.5 GC of Korean pine seed oil

圖6 紅松籽油包合物氣相色譜圖Fig.6 GC of inclusion complex of Korean pine seed oil

3.3 粒徑檢測結(jié)果

在最優(yōu)工藝條件下，制備得到紅松籽油包合物，經(jīng)激光粒度儀檢測，其正態(tài)分布曲線圖如圖7所示。紅松籽油包合物乳液的平均粒徑為177.3±2.6 nm，如圖8所示，紅松籽油包合物電位為-33.01±1.4 mV。制備包合物穩(wěn)定性好，有利于貯藏；與水溶液形成乳劑，粒徑減小，水溶性增大，可提高紅松籽油在體內(nèi)的吸收率。

圖7 紅松籽油包合物正態(tài)分布圖Fig.7 The Normal distribution diagram of Korean seed oil inclusion complex

圖8 紅松籽油包合物電位分布Fig.8 The inclusion complex of Korean pine seed oil

3.4 生物利用度檢測結(jié)果

紅松籽油及紅松籽油包合物大鼠口服給藥后皮諾斂酸的血藥濃度曲線如圖9所示。從圖9中可以看出，在大鼠體內(nèi)，紅松籽油包合物組的皮諾斂酸的吸收速度明顯高于紅松籽油組。紅松籽油組血樣中皮諾斂酸濃度在8 h時達到最大高血藥濃度(Cmax)95.26 ng·mL-1。紅松籽油包合物組相對吸收較快，在6 h時達到最大高血藥濃度(Cmax)120.53 ng·mL-1。紅松籽油包合物組的血藥的Cmax是紅松籽油組的1.27倍。利用DAS2.0軟件對數(shù)據(jù)進行模型擬合，擬合發(fā)現(xiàn)紅松籽油及紅松籽油包合物在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)均符合二室模型，權(quán)重系數(shù)為1/cc，模擬計算得到的藥動學(xué)參數(shù)結(jié)果如表2所示。紅松籽油包合物的t1/2a是紅松籽油的1.42倍；AUC值是紅松籽油1.56倍；平均滯留時間(MRT)是紅松籽油的1.04倍。結(jié)果顯示，說明紅松籽油包合物與水溶液形成乳劑，粒徑減小，水溶性增大，增加了包合物在體內(nèi)的t1/2a和平均滯留時間(MRT)，提高了皮諾斂酸在體內(nèi)的吸收。

圖9 紅松籽油及紅松籽油包合物中皮諾斂酸血藥濃度曲線Fig.9 Pinolenic acid concentration curve in Korean pine seed oil and Korean pine seed oil inclusion complex

表2 紅松籽油和紅松籽油包合物藥代動力學(xué)參數(shù)

Table 2 Variable Korean pine seed oil and Korean pine seed oil inclusion complex pharmacokinetic parameters

房室參數(shù)Compartment pharmacokinetic parameters紅松籽油Korean pine seed oil紅松籽油包合物Korean pine seed oil inclusion complexCmax(ng·mL-1)95.26120.53Tmax(h)8.006.00t1/2a(h)2.523.58AUC(0-t)(ng/(mL·h-1))931.671455.52AUC(0-∞)(ng/(mL·h-1))1002.081918.99MRT(0-t)(h)10.4710.93MRT(0-∞)(h)9.0215.67

4 討論

通過單因素法優(yōu)化，得到紅松籽油包合物的最優(yōu)制備工藝為：包合溫度50℃，包合時間為2.5 h，皮諾斂酸與β-環(huán)糊精的摩爾比為1∶2，乙醇加入量為紅松籽油用量的3倍(w/w)，在最優(yōu)條件下制備包合物所得紅松籽油固化率為70.95%，包合物含油率為26.88%。通過GC檢測紅松籽油及其包合物的脂肪酸組分可知，包合物中紅松籽油的各組分含量與紅松籽油中各組分含量無明顯差異，其中皮諾斂酸的含量在14%～16%。通過激光粒度儀檢測可知，紅松籽油包合物的平均粒徑為177.3±2.6 nm，電位為-33.01±1.4 mV。通過生物利用度檢測可知，紅松籽油包合物組的血藥最大濃度(Cmax)是紅松籽油組的1.27倍，t1/2a是紅松籽油的1.42倍；AUC值是紅松籽油1.56倍；平均滯留時間(MRT)是紅松籽油的1.04倍。因此，通過本實驗說明紅松籽油包合物與水溶液形成乳劑，粒徑減小，水溶性增大，增加了包合物在體內(nèi)的t1/2a和平均滯留時間(MRT)，提高了皮諾斂酸在體內(nèi)的吸收，這對紅松籽油的新產(chǎn)品研發(fā)具有重要參考意義。