陳丹丹 ，許芮菁 ，劉敏 ，吳伯陽 ，楊銳 ，王鵬 ，丁章貴 *，高林瑞 *

（1.云南省普洱茶發(fā)酵工程研究中心，云南昆明 650217；2.云南大益微生物技術(shù)有限公司，云南昆明 650217）

普洱茶作為云南特有名茶，是由云南大葉種曬青毛茶制成的一種獨(dú)特的微生物發(fā)酵茶[1]。在微生物發(fā)酵過程中，曬青毛茶中的多酚經(jīng)氧化、甲基化、酰化、糖基化等作用形成大量多酚衍生物，如A環(huán)加成兒茶素類成分[2]。因此，微生物發(fā)酵茶具有降脂、降糖、抗氧化、抗腫瘤、抗菌、消炎、抗病毒等多種藥理活性[3-4]。

研究表明，普洱茶素Ⅰ對高脂高糖喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠的2型糖尿病并發(fā)高脂血癥有治療作用，證實(shí)其通過抑制腸道α-葡萄糖苷酶活性和激活肝細(xì)胞低密度脂蛋白受體（LDLR）的表達(dá)，從而降低空腹血糖和血漿總膽固醇含量[5]。8-N-乙基-2-吡咯烷酮取代黃烷-3-醇可下調(diào)衰老小鼠4-羥基壬烯醛和泛素化蛋白聚集體的形成及Aβ代謝途徑，增加內(nèi)源性抗氧化能力，減輕細(xì)胞缺氧，降低神經(jīng)細(xì)胞凋亡率，有效保護(hù)SAMP8神經(jīng)元[6]。

Puerins（普洱茶素）Ⅰ～Ⅷ是從普洱熟茶中分離得到的8種8-N-乙基-2-吡咯烷酮取代黃烷-3-醇[7]，結(jié)構(gòu)見圖1。Puerins 401系列化合物的相對分子量為401.15，分子式為C21H23NO7，含有3個手性碳原子，是微生物發(fā)酵茶特有的含氮多酚，由茶多酚與茶氨酸結(jié)合而成。其N-乙基-2-吡咯烷酮基團(tuán)是由茶氨酸經(jīng)Strecker降解轉(zhuǎn)化為醛后自發(fā)環(huán)化產(chǎn)生，見圖2[8]。課題組從微生物發(fā)酵茶中分離得到6個Puerins 401系列化合物，互為同分異構(gòu)體，命名為 Puerins 401-1～401-6，結(jié)構(gòu)式見圖3。

圖1 普洱茶素Ⅰ～Ⅷ分子結(jié)構(gòu)式（R=H，OH）Fig.1 The molecular structures of PuerinsⅠ～Ⅷ (R=H，OH)

圖2 N-乙基-2-吡咯烷酮取代的黃烷-3-醇的形成過程（R=H，OH）Fig.2 The formation process of N-ethyl-2-pyrrolidinone substituted flavan-3-ols(R=H，OH)

圖3 Puerins 401系列化合物結(jié)構(gòu)式Fig.3 The structural formulas of Puerins 401 series compounds

目前國內(nèi)外尚無Puerins 401系列化合物定量方法，為滿足普洱熟茶特征活性成分質(zhì)量控制需求，研究建立了HP 20大孔樹脂自裝柱凈化富集提取液，高效液相色譜-紫外法（HPLC-UV）[9]測定普洱熟茶中6個Puerins 401化合物 （401-1～401-6）含量，靈敏度高，準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性好。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

Waters 2695高效液相色譜儀 （美國Waters公司），Waters 2995 PDA （光電二極管列陣檢測器，美國Waters公司），WD-9415B超聲儀（北京六一儀器廠），H1850R低溫離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司），VORTEX 3旋渦混勻器 （德國，IKA公司），R1001-LN旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 （鄭州長城科工貿(mào)有限公司），NAI-FXCQY-24固相萃取裝置（上海那艾精密儀器有限公司），分析天平（精度0.0001 g，美國 OHAUS 公司）。

1.2 材料與試劑

SPE柱管（6 mL，PP材質(zhì)，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；小柱篩板（6 mL，PE材質(zhì)，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；HP 20大孔吸附樹脂（日本三菱化學(xué)樹脂株式會社）；定量濾紙（Φ12.5 cm，杭州雙圈濾紙有限公司）；pH 試紙（pH 1～14，上海三愛思試劑有限公司）；針式過濾器（0.45 μm，尼龍66，天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

乙腈、甲醇均為色譜純（德國MERCK公司）；乙酸銨、甲酸 （LC/MS，美國Fisher Scientific公司）；其他試劑未說明均為分析純。

Puerins 401系列化合物對照品為實(shí)驗(yàn)室自行分離提純制備獲得，Puerins 401-1～401-6對照品純度分別為 95%、90%、95%、85%、90%、95%。

1.3 色譜條件

Waters Atlantis dC18 （250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：A為2 mmol/L乙酸銨水溶液 （含1‰甲酸），B為乙腈。梯度洗脫程序：B相 0～10 min從 10%變化到 20%并保持 8 min，18～25 min從 20%變化到 90%，25～29 min從 90%變化到10%，并保持6 min；流速 1 mL/min；進(jìn)樣量為 10 μL，柱溫35℃；紫外檢測器：檢測波長280 nm。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取一定量的Puerins 401系列化合物對照品，用甲醇溶解配制成如下濃度：Puerins 401-1～401-6 分別為 2.00、1.00、4.00、1.00、2.00、2.00 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-4℃避光保存。使用前，準(zhǔn)確移取適量Puerins 401系列化合物標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用甲醇配置成如下濃度：Puerins 401-1～401-6 分別為 20～200、10～100、10～100、40～400、20～200、20～200 mg/L 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，于-4 ℃避光保存[10]。

1.5 樣品處理與富集

稱取0.5 g（精確到0.0001 g）均勻研磨的茶樣于15 mL離心管中，加入水10 mL，用旋渦混勻器均勻濕潤，超聲30 min，12000 r/min離心15 min，將上清液轉(zhuǎn)移至125 mL分液漏斗中，殘?jiān)貜?fù)提取一次，合并上清液。在分液漏斗中加入60 mL二氯乙烷后左右震搖，棄去有機(jī)相，余下水相再用二氯乙烷重復(fù)萃取兩次，將水相移入100 mL旋蒸瓶中，去除水中的有機(jī)相。之后，將水相用濾紙濾去殘?jiān)齼艋患?/p>

自裝HP 20小柱 （600 mg/6 mL），使用前用2～3倍柱體積的2%氫氧化鈉溶液淋洗小柱，然后用水沖至pH=7，再用2～3倍柱體積的2%鹽酸溶液淋洗小柱，之后用水沖至pH=7，后用乙醇完全置換柱內(nèi)殘留水并用乙醇浸泡小柱（過夜）。樣品上柱前，用大量水完全置換乙醇。

將待凈化富集的樣品提取液分次移入已活化的HP20小柱。調(diào)節(jié)流速以1～2滴/s的速度通過柱子；待水相濾完，用10 mL 10%乙醇溶液淋洗小柱；負(fù)壓抽干后，再用20 mL 50%乙醇溶液洗脫目標(biāo)物，將洗脫液收集于50 mL旋蒸瓶中，于45℃水浴下旋蒸至干，用2 mL 50%甲醇溶液復(fù)溶，過0.45 μm有機(jī)相濾膜后，待測。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相色譜條件優(yōu)化

分別采用甲醇、乙腈作為有機(jī)相，純水、1‰甲酸、2 mmol/L乙酸銨作為水相，等度洗脫、梯度洗脫作為洗脫程序，進(jìn)行組合條件的優(yōu)化。由于普洱熟茶的基質(zhì)非常復(fù)雜，目標(biāo)物附近有很多干擾峰，采用梯度洗脫才能達(dá)到最好的分離效果。最終，從峰形、干擾峰和目標(biāo)峰的分離等結(jié)果表明，2 mmol/L乙酸銨水溶液 （含1‰甲酸）-乙腈體系梯度洗脫的方法較優(yōu)。

分別考察了不同色譜柱：Waters Xterra C18柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters Xselect C18柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters XBridge C18柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent TC-C18 柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）、Agilent XDB C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent SB C18 柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）、Waters Atlantis T3 柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters Atlantis dC18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）， 結(jié)果發(fā)現(xiàn) Waters Atlantis dC18色譜柱相較于其他色譜柱在同等條件下分離效果最佳，6個同分異構(gòu)體均可出峰，其保留時間和半峰寬[11]見表 1，分離度依次為 3.45、1.82、0.95、3.59、2.30。

表1 Puerins 401系列化合物各組份的保留時間和半峰寬Table 1 The retention time and half-peak width of each Puerins 401 series compound

2.2 富集凈化步驟開發(fā)

普洱熟茶成分復(fù)雜，基質(zhì)效應(yīng)顯著，會明顯影響方法的靈敏度。固相萃取法是最常用的樣品前處理方法[12]。

首先研究不同類型商品柱對Puerins 401系列化合物的富集凈化效果，結(jié)果表明所使用商品柱不適宜普洱熟茶中此類化合物的測定。后考察5種大孔樹脂對凈化富集樣品提取物的適用性[13]。首先，混標(biāo)溶液通過裝滿一種材料的凈化柱來評估所有待測材料的回收性能。其中，HP20樹脂回收率在80%～90%之間，滿足凈化柱要求。然后，比較了每種吸附材料對普洱熟茶中Puerins 401系列化合物富集洗脫效果，HP20樹脂中Puerins 401系列化合物集中于30%～50%乙醇水洗液，其他材料目標(biāo)成分分散梯度寬。凈化柱研制完成后，優(yōu)化洗脫梯度，結(jié)果為10%乙醇水溶液為淋洗液，50%乙醇水溶液為洗脫液。按“1.5”所述進(jìn)行樣品處理與富集[14]。

2.3 方法線性范圍與相關(guān)系數(shù)

實(shí)驗(yàn)采用外標(biāo)法定量，在優(yōu)化條件下檢測Puerins 401系列化合物對照品，以其峰面積為縱坐標(biāo)（y軸），其濃度為橫坐標(biāo)（x軸）做標(biāo)準(zhǔn)曲線[11]。結(jié)果表明，Puerins 401系列化合物各組份在2.0～500.0 mg/L范圍內(nèi)具有良好的線性，所得到各組份的線性方程、相關(guān)系數(shù)[11]見表2。Puerins 401系列各化合物的檢出限 （LOD）[15]為3.6～5.9 mg/kg。由于檢出限一般表示為3倍信噪比（S/N），而定量限一般表示為10倍信噪比（S/N），即定量限可以表示為3.3倍檢出限，所以為Puerins 401系列各化合物的定量限（LOQ）[16]為 11.9～19.5 mg/kg。

表2 Puerins 401系列化合物各組份的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 The linear equation,correlation coefficient,detection and quantitative limit of each Puerins 401 series compound

2.4 儀器精密度、方法重現(xiàn)性及加標(biāo)回收率

取上述Puerins 401系列化合物對照品于上述測定條件下，重復(fù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量10 μL，以Puerins 401系列化合物峰面積，計(jì)算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為 0.62%～1.07%（n=6），如表 3所示。

根據(jù)“1.5”進(jìn)行同一樣品6次平行實(shí)驗(yàn)，每個平行樣品進(jìn)樣1次，進(jìn)樣量10 μL，以各Puerins 401系列化合物含量，計(jì)算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為 1.80%～4.81%（n=6），如表 3所示。

取已知濃度樣品進(jìn)行濃度為0.2 g/kg的Puerins 401系列化合物加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果為75.0%～99.5%，如表4所示。Puerins 401系列化合物對照品色譜圖見圖4，樣品色譜圖見圖5。

表3 Puerins 401系列對照品及樣品中各組分相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD%）（n=6）Table 3 Relative standard deviation(RSD%)of each Puerins 401 series compound in the same reference substance and the same sample

表4 Puerins 401系列化合物加標(biāo)回收率Table 4 The spiked recovery of each Puerins 401 series compound

圖4 Puerins 401系列化合物對照品色譜圖Fig.4 The chromatogram of Puerins 401 series compound

圖5 普洱熟茶樣品色譜圖Fig.5 The chromatogram of Pu-erh Tea sample

3 實(shí)際樣品測定

從茶葉市場上采購17個普洱熟茶樣品，進(jìn)行Puerins 401系列化合物的測定，其結(jié)果如表5所示，不同品類普洱熟茶中Puerins 401系列化合物含量有所差別。在這17個普洱熟茶樣品中，Puerins 401-1～401-6 的含量分別在 41.1～169.7、36.6 ～163.5、172.1 ～375.3、7.8 ～59.7、126.5 ～342.8、249.9～827.1 mg/kg之間，Puerins 401 系列化合物總量在655.2～1806.1 mg/kg之間。

表5 市售普洱熟茶中Puerins 401系列化合物的含量Table 5 The content of Puerins 401 series compound in each Pu-erh tea

4 結(jié)論

文章建立了測定普洱熟茶中Puerins 401系列化合物含量的高效液相色譜法分析方法。用水提取普洱熟茶中Puerins 401系列化合物，經(jīng)二氯乙烷萃取，HP20自裝柱富集凈化后，上機(jī)測試。該方法靈敏度高，準(zhǔn)確性好、重現(xiàn)性好，適用于普洱熟茶以及其深加工產(chǎn)品中Puerins 401系列化合物的測定。