賀 盼，孔東升，2，3*，王 立，劉睿明

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學林學院，甘肅 蘭州 730070；2.河西學院，甘肅 張掖 734000；3.甘肅省黑果枸杞工程研究中心河西學院，甘肅 張掖 734000)

黑果枸杞(Lyciumruthenicum)是茄科(Solanaceae)枸杞屬(Lycium)多年生耐鹽、抗旱的灌木植物，黑果枸杞漿果呈球形，成熟后為紫黑色、無毒、有甜味，是一種有待開發(fā)的野生植物資源[1]。黑果枸杞主要分布于我國寧夏、甘肅、青海、內(nèi)蒙古、新疆、西藏及陜西北部黃土高原[2]，而在甘肅則主要分布于河西走廊地區(qū)[3]。黑果枸杞果實具有強腎、潤肺、明目、健胃、補腦、抗衰老及通經(jīng)作用[4]，是一種藥食同源的保健食品[5]，果實中含有豐富的人體必需酚類物質(zhì)、維生素、蛋白質(zhì)以及氨基酸，還含有豐富的常量及微量元素[6]，尤其是含有豐富花色苷，被稱為“花青素之王”?；ㄇ嗨赜址Q“花色素”，是一種水溶性的天然植物色素，安全無毒，屬于黃酮類化合物[7-8]，存在于植物的花、根、葉、果及種皮等部位的細胞液泡中[9]，具有抗發(fā)炎、降血糖、護肝等諸多藥理作用[10-13]，有較強的抗氧化、抗自由基以及抗衰老等功能[14-15]。近年來隨著人們對食品安全和自身健康的日益重視，紅花(Carthamustinctorius)紅色素、蘿卜(Raphanussativus)紅等多種天然色素已被我國衛(wèi)生部批準用于飲料、乳制品和糕點中，花青素作為一種多功能天然色素，它的提取和應用也受到越來越多的關(guān)注[16]。

目前，提取花青素的方法有水溶液提取法[17]、有機溶劑提取法[18]、超聲波輔助提取法[19]、微波輔助提取法[20]及微生物發(fā)酵提取法[21]等。其中，水溶劑提取法最簡單易行，但對花青素的提取效率極低，而超聲波輔助、微波輔助及微生物輔助法等方法多需要特定設(shè)備且成本偏高。有機溶劑提取法已被證實適用于黑果枸杞色素提取，且具有簡單、高效、無毒的優(yōu)點。李進等[22]對新疆黑果枸杞色素提取的研究中確定pH 3.0的80%乙醇作浸提劑、提取溫度50℃、提取時間3 h、固液配比1:40為最佳提取條件；劉翔等[23]也利用有機溶劑提取法對新疆黑果枸杞花青素含量進行測定，結(jié)果表明70%的1%酸性乙醇、固液比為1:20、置于暗處常溫浸提4 d為最佳條件；然而，在劉振華[24]對青海黑果枸杞花青素含量的研究中則認為用70%濃度的乙醇、物料比為1:13、提取溫度為55℃、提取2.5 h為最佳條件。不同來源的黑果枸杞的花青素含量各異，提取參數(shù)的不同，提取率結(jié)果也不一樣[22-24]。河西走廊具有特殊的氣候，而且人工栽培的黑果枸杞有成熟期集中、水肥條件好、管理精細等特點，所需要提取的參數(shù)可能不同。尤其是花青素是一種具有較強極性的水溶性天然色素，當試驗中花青素含量與乙醇濃度二者的極性達到一致時花青素的溶出將達到最大值，就會導致物料比、溫度、時間參數(shù)的相應變化，因此，許多學者[23]測定了不同種源的野生黑果枸杞花青素，可能導致不同種源花青素的提取用同一種參數(shù)時，提取率不一定都達到極值而無法比較，更沒有對特定的同一地區(qū)人工栽培條件下的花青素提取參數(shù)進行研究。因此，本試驗對玉門市人工栽培黑果枸杞果實采用有機溶劑提取的方法，并通過正交試驗進行優(yōu)化確定最佳提取條件，并確定是否需要脫脂，為后期河西走廊地區(qū)黑果枸杞優(yōu)良品種的選育和深加工利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑果枸杞果實：于2018年8月初采自甘肅省玉門市花海鎮(zhèn)、小金灣鄉(xiāng)、獨山子鄉(xiāng)人工栽培的黑果枸杞。

試劑：香草醛(天津市光復精細化工研究所)、矢車菊-3-O-葡萄糖苷(四川省維克奇生物科技有限公司)、無水乙醇、石油醚(30～60℃)、鹽酸、硫酸均為分析純、甲醇為色譜純。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平、粉碎機、60目篩、鼓風干燥箱、恒溫水浴鍋(型號DK-98-Ⅱ天津市泰斯特儀器有限公司)、索氏提取器、離心機(型號3H12RI 湖南赫西儀器裝備有限公司)、pH計(賽多利斯科學儀器有限公司)、紫外可見分光光度計(型號UV-1701PC)。

1.3 方法

1.3.1 材料的預處理

對黑果枸杞果實進行干燥處理，并剔除破碎果實與果梗后粉碎，過60目篩。

1.3.2 花青素標準曲線建立

精密稱取10 mg矢車菊-3-O-葡萄糖苷對照品配成1 mg/mL的溶液，分別取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL用硫酸香草醛法進行吸光度測定，以濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，得回歸方程y=0.1545x+0.0135，R2=0.9828，其濃度與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

1.3.3 花青素含量測定方法

將提取的花青素液置于分光光度計中，在黑果枸杞色素乙醇溶液最大吸收波長(545 nm)條件下[27]測定吸光度三次，并取平均值。根據(jù)比爾定律可知，吸光度與色素濃度成正比，可直接用吸光度表示色素濃度或含量大小[26]。采用硫酸-香草醛法[27]測定花青素含量，其計算公式為﹕

式中，Ax為供試品溶液吸光度，Cr為對照品溶液濃度，Ar為對照品溶液吸光度，D為稀釋倍數(shù)，W為供試品質(zhì)量。

1.3.4 花青素提取的單因素試驗

分別對pH值3.0的鹽酸-乙醇濃度、物料比、提取時間、提取溫度4個因素進行單因素試驗，提取劑pH值3.0的鹽酸-乙醇的濃度分別為20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%；物料比分別為 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50；提取時間分別為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 h；提取溫度分別為 30、40、50、60、70、80℃，然后在轉(zhuǎn)速8000 r/min離心10 min提取上清液，加入2.5 mL 30%的硫酸溶液搖勻，再加入25 mL 1%的香草醛溶液，避光作用30 min，在分光光度計中測其吸光度，根據(jù)標準曲線計算花青素含量。各試驗設(shè)置三重復。

1.3.5 正交設(shè)計試驗

以提取溶劑濃度(A)物料比(B)提取時間(C)提取溫度(D)四個因素3個水平進行正交試驗設(shè)計(表1、表2)，以花青素提取率為指標，優(yōu)化提取花青素的最佳參數(shù)。

表1 試驗因素與水平

1.3.6 脫脂處理

準確稱10 g黑果枸杞果實粉末與石油醚按照1∶10(g∶ml)混合置于索氏提取器中，于50℃水浴中回流提取3 h后，取出黑果枸杞粉末置于通風陰涼處待其干燥后用于花青素提取。提取條件為pH值3.0的80%的鹽酸-乙醇、物料比為1∶15、提取時間為5 h、提取溫度為40℃進行花青素的提取，重復三次試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 提取劑濃度對黑果枸杞花青素提取率的影響

花青素是一種具有較強極性的水溶性天然色素，在親水性有機溶劑中乙醇的極性最大，隨著乙醇濃度增大其極性也增大，當兩者的極性達到一致時花青素的溶出將達到最大值，而后乙醇濃度的增大使得其極性偏離了花青素的極性[28]。如圖1所示，隨著乙醇濃度從20%上升到70%時，花青素的提取率也逐漸升高，并且在乙醇濃度達到70 %時，花青素提取率也達到了最大；而乙醇濃度從70%上升到100%時花青素的提取率則呈現(xiàn)下降趨勢，因此，選擇濃度為pH值3.0的70%的鹽酸-乙醇為花青素提取的溶劑濃度。

2.1.2 物料比對黑果枸杞花青素提取率的影響

隨著加入提取劑體積的增大，其與枸杞果實粉末的接觸面積也在增大，更有利于花青素的溶出。但當達到反應飽和狀態(tài)后，提取劑的增加反而會溶出一些雜質(zhì)而影響花青素的提取率。如圖2所示，物料比在1∶15時花青素的提取達到了最高點，在1∶20之后處于下降趨勢，因此選擇1∶15為花青素提取的最佳物料比。

圖1 乙醇濃度對花青素提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of anthocyanin

圖2 物料比對花青素提取率的影響Fig. 2 Effect of material ratio on the extraction rate of anthocyanin

2.1.3 提取時間對黑果枸杞花青素提取率的影響

花青素是一種不穩(wěn)定的物質(zhì)，易受到光照、氧氣等影響，所以提取花青素的時間是一個相當重要的因素。如圖3所示，隨著時間從1 h上升至6 h，花青素的提取量也在上升并在6 h達到最高點，6 h之后花青素的提取量逐漸下降并趨于平穩(wěn)，因此，選擇6 h為適宜提取時間。

2.1.4 提取溫度對黑果枸杞花青素提取率的影響

花青素對高溫非常敏感，研究發(fā)現(xiàn)溫度越高花青素降解的速度越快[30]。如圖4所示，溫度從30℃上升至50℃，花青素的提取率也在上升，并在50℃達到最高點，提取率為0.868%，在60℃到80℃隨著溫度上升花青素的提取率逐漸下降，因此選擇50℃為花青素的適宜提取溫度。

圖3 提取時間對花青素提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the extraction rate of anthocyanin

圖4 提取溫度對花青素提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction rate of anthocyanin

2.2 正交試驗結(jié)果與分析

表2 正交試驗結(jié)果

通過正交試驗表2可以直觀的看出提取溶液濃度、時間、溫度及物料比四個影響因子中，提取時間(C)>提取溫度(D)>溶液濃度(A)>物料比(B)。所以，可以確定最優(yōu)組合為A3B2C1D1即80%的pH值3.0的鹽酸-乙醇、物料比為1∶15、提取時間為5 h、提取溫度為40℃。

2.3 脫脂對花青素提取率的影響

表3 黑果枸杞花青素提取結(jié)果

如表3所示，脫脂處理會明顯降低黑果枸杞花青素的提取率，比未脫脂果枸杞花青素提取率低了0.248%。這可能是石油醚脫脂的過程中脫掉了部分以單體形式存在的色素，從而導致其含量降低，也可能脫脂處理使黑果枸杞在空氣中暴露時間延長，使得花青素被氧化。

3 討論

3.1 試驗參數(shù)的確定

正交試驗得到的參數(shù)與單因素試驗結(jié)果有差異，表明多個因素相互作用影響了黑果枸杞花青素的提取率。正交試驗結(jié)果顯示,提取時間及提取溫度對其提取率影響最大，其次才是溶液濃度和物料比。正交試驗最優(yōu)提取物料比與單因素保持一致，但相對于單因素試驗結(jié)果而言，其提取時間相應縮短了，而提取液濃度增大了，這是由于花青素的雙苯環(huán)結(jié)構(gòu)有很強的的極性，適當?shù)脑黾犹崛∫簼舛仁箖烧邩O性達到一致，能夠促使花青素更快的溶出；高溫會加快花青素苷的降解，因此適當?shù)慕档蜏囟葧p緩花青素的降解從而提高提取率[29]。但進一步降低pH值是否會提高花青素提取率，還需要進一步研究。

3.1 試驗結(jié)果討論

本試驗利用有機溶劑提取法，經(jīng)過單因素試驗和正交試驗的優(yōu)化，最終測得黑果枸杞花青素含量均值為0.978%，脫脂后的花青素含量均值為0.730%，未脫脂的黑果枸杞果實花青素提取率明顯高于脫脂。雖然花青素提取方法的研究較多，但針對黑果枸杞的研究甚少尤其是河西走廊黑果枸杞，相同提取方法中，劉振華[27]測得市售和果枸杞花青素含量為0.424%；汪洋[29]測得青海、新疆、內(nèi)蒙、北京等地的黑果枸杞未脫脂花青素含量范圍為0.069%～0.84%，但不同提取參數(shù)，本試驗所測結(jié)果稍優(yōu)于其他地區(qū)，可能是由于本試驗所測黑果枸杞為人工栽培，其施肥、澆水等因素，使黑果枸杞果實優(yōu)于野生，導致本試驗所測花青素高的原因；也可能是河西走廊地區(qū)特殊地理環(huán)境更適宜黑果枸杞積累更多的花青素。祁銀燕[24]等利用超聲輔助提取法測得柴達木野生和人工栽植黑果枸杞花青素含量分別為0.837%和0.897%，雖然超聲輔助提取比有機溶劑提取節(jié)省時間，但結(jié)果不相上下，并且有機溶劑提取更適用于后期大量黑果枸杞優(yōu)樹選擇的實驗室測定工作，而超聲輔助更適用于產(chǎn)業(yè)化花青素提取。

4 結(jié)論

鹽酸-乙醇溶液提取黑果枸杞果實花青素的最優(yōu)參數(shù)為pH值3.0的80%的鹽酸-乙醇、物料比為1∶15、提取時間為5 h、提取溫度為40℃，并且未脫脂的黑果枸杞最佳。本試驗為后期黑果枸杞的優(yōu)良選育提供技術(shù)支持，從而帶動甘肅河西走廊地區(qū)一系列以黑果枸杞為主的產(chǎn)業(yè)發(fā)揮較好的經(jīng)濟、生態(tài)及社會效益。