高 宏，黃 婷，徐 慧

(江蘇省理化測(cè)試中心，江蘇 南京 210042)

降血脂片中的皂苷成分能夠促進(jìn)脂質(zhì)代謝，使膽固醇及血中的脂蛋白的合成，分解轉(zhuǎn)化以及排泄加速，從而降低血液中膽固醇、甘油三酯的同時(shí)還可以升高血清中的高密度脂蛋白膽固醇，達(dá)到降低動(dòng)脈硬化，預(yù)防和治療心腦血管病的目的。

現(xiàn)有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)報(bào)道的皂苷的定量分析方法有高效液相色譜法[1]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[2]、分光光度法[3]等。高效液相色譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求較高，且只能測(cè)定特定的皂苷含量。分光光度法儀器成本低，操作簡(jiǎn)單，分析速度快。

近年來(lái)微波[4]和超聲波[5]提取法被應(yīng)用于中藥化學(xué)成分提取，這兩種方法操作簡(jiǎn)單，可大大縮短提取間。降血脂片中由于含有多種類(lèi)型的皂苷，分別測(cè)定耗時(shí)耗力，因此可采用分光光度法，以人參皂苷Re為對(duì)照品，對(duì)總皂苷含量進(jìn)行測(cè)定，用以進(jìn)行產(chǎn)品質(zhì)量控制。本文主要參考《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》(2003版)[6]總皂苷測(cè)定方法，并對(duì)該方法進(jìn)行優(yōu)化和改進(jìn)，可為保健食品中總皂苷含量測(cè)定提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

降血脂片(市售)；Amberlite-XAD-2大孔樹(shù)脂(Sigma化學(xué)公司)；中性氧化鋁(柱層析用，100～200目，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；香草醛、甲醇、高氯酸、冰乙酸(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1801紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京瑞利分析儀器有限公司)；高性能通用臺(tái)式離心機(jī)(賽默飛世爾科技有限公司)；KH2-250DB超聲波清洗儀(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；BSA224S-CW電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；BT25S高精密電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精密稱(chēng)取人參皂苷Re對(duì)照品0.25 g，用甲醇制成每1 mL含人參皂苷Re 2.5 mg的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備溶液 0.10、0.20、0.30、0.40、0.60、0.80 mL 上清液分別置于10 mL容量瓶中，水浴揮干甲醇溶劑，加水溶解并定容至刻度，搖勻，作為系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。用10 mL注射器作層析管，內(nèi)裝3 cm Amberlite-XAD-2大孔樹(shù)脂，上加1 cm中性氧化鋁。先用25 mL 70%乙醇洗柱，棄去洗脫液，再用25 mL水洗柱，棄去洗脫液，備用。精確加入1.0 mL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行柱層析，先用25 mL水洗柱，棄去洗脫液，再用25 mL 70%乙醇洗脫總皂苷，收集洗脫液于蒸發(fā)皿中，置于60℃水浴揮干，以此作顯色用。在上述已揮干的蒸發(fā)皿中準(zhǔn)確加入0.2 mL 5%香草醛冰乙酸溶液，轉(zhuǎn)動(dòng)蒸發(fā)皿，使殘?jiān)芙?，再?.8 mL高氯酸，混勻后移入5 mL帶塞刻度離心管中，60℃水浴上加熱10 min，取出，冰浴冷卻后，準(zhǔn)確加入冰乙酸5.0 mL，搖勻后，以1 cm比色皿于560 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行比色。以人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 試樣溶液制備

將供試品研細(xì)混勻，通過(guò)40～60目標(biāo)準(zhǔn)篩，稱(chēng)取1.0 g左右的試樣置于100 mL容量瓶中，加少量蒸餾水，經(jīng)過(guò)不同方法提取后，再用水定容至100 mL，搖勻，于4000 r/min的離心機(jī)離心5 min，吸取1.0 mL上清液從“1.3.1吸取1.0 mL進(jìn)行柱層析”起，同步以下操作，以1 cm比色皿于560 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行比色。

1.3.3 降血脂片中總皂苷提取方法的選擇

采取索氏提取法、超聲波提取法兩種不同提取方法來(lái)測(cè)試供試品中總皂苷的含量。精密稱(chēng)取3份1.0 g 制備好的供試品分別置于索氏提取器中，加入80 mL三氯甲烷，加熱回流提取8 h后，將溶劑揮干，加水溶解并定容至100 mL容量瓶中備用[7]；另取3份1.0 g 制備好的供試品，分別置于錐形瓶中，加水約60 mL，超聲30 min，用水定容至100 mL，搖勻，于4000 r/min的離心機(jī)離心5 min，取上清液備用。按照“1.3.1吸取1.0 mL進(jìn)行柱層析”起，同步以下操作，以1 cm比色皿于560 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行比色。

1.3.4 大孔樹(shù)脂填裝高度的選擇

精密稱(chēng)取4份1.0 g 制備好的供試品，分別置于錐形瓶中，加水約60 mL，選定最佳提取條件，再用水定容至100 mL，搖勻，離心過(guò)濾后放置備用。分別通過(guò)大孔樹(shù)脂填裝高度為1、2、3、4 cm的柱層析，其他按照“1.3.1吸取1.0 mL進(jìn)行柱層析”起，同步以下操作，以1 cm比色皿于560 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行比色[8-9]。

1.3.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密稱(chēng)取1.0 g研細(xì)混勻的供試品7份分別置于100 mL 容量瓶中，選定最佳提取法和大孔樹(shù)脂填充高度，按照“1.3.2試樣溶液制備”測(cè)定項(xiàng)下操作，按照方法測(cè)定。

1.3.6 回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱(chēng)取1.0 g研細(xì)混勻的供試品9份分別置于100 mL 容量瓶中，精密加入人參皂苷Re對(duì)照品儲(chǔ)備溶液(2.5 mg/mL)體積分別為2、4和6 mL，每個(gè)濃度平行配制3份，按照“1.3.2試樣溶液制備”測(cè)定項(xiàng)下操作，依法測(cè)定并計(jì)算加標(biāo)回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以人參皂苷Re含量為橫坐標(biāo)(x)，吸光度為縱坐標(biāo)(y)，得線性回歸方程：y=3.1313x+0.0034，相關(guān)系數(shù)R2=0.9994。表明人參皂苷含量在0～0.2 mg范圍內(nèi)，與溶液的吸光度值呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)。

2.2 索氏提取法和超聲波提取法效果比較

索氏提取法和超聲波提取法得到的降血脂片中總皂苷的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，索氏提取法和超聲波提取法測(cè)得的總皂苷含量分別為1.18%、1.17%，但所用的前處理時(shí)間卻相差較大。其中，索氏提取法回流提取時(shí)間為8 h，超聲波提取時(shí)間為30 min，從提取時(shí)間及能源損耗等方面比較，超聲波提取法操作簡(jiǎn)單快捷，故本方法采用超聲波提取法來(lái)測(cè)定總皂苷含量。

圖1 人參皂苷Re的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 1 Standard curve of ginsenosides

表1 降血脂片中總皂苷提取方法的選擇

2.3 大孔樹(shù)脂不同填裝高度對(duì)總皂苷提取效果的影響

大孔吸附樹(shù)脂是一類(lèi)不含交換基團(tuán)但有大孔結(jié)構(gòu)的高分子吸附樹(shù)脂。目前，大孔吸附樹(shù)脂常用于皂苷類(lèi)化合物、黃酮類(lèi)化合物、生物堿類(lèi)化合物等植物活性成分的分離純化。它們是以大孔吸附樹(shù)脂為吸附劑，通過(guò)適宜的吸附和解吸從而達(dá)到分離、提純某一類(lèi)或某一種化合物的目的[9]。本實(shí)驗(yàn)選定提取方法為超聲波提取法，通過(guò)研究大孔樹(shù)脂的不同填裝高度進(jìn)行試驗(yàn)，以確保達(dá)到總皂苷最佳提取效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可知，當(dāng)柱層析中大孔樹(shù)脂填充高度為3 cm和4 cm時(shí)總皂苷提取率基本達(dá)到平衡，且提取率明顯高于填充高度為1 cm和2 cm，從節(jié)約成本角度出發(fā)，本實(shí)驗(yàn)選定大孔樹(shù)脂填充高度3 cm為最佳實(shí)驗(yàn)條件。

2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知，選定超聲波提取法和大孔樹(shù)脂填充高度3 cm為最佳實(shí)驗(yàn)條件，在該條件下測(cè)得供試品中總皂苷的含量均值為1.17%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(Relative standard deviation, RSD)為1.8%。結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)性良好，結(jié)果見(jiàn)表2。

圖2 大孔樹(shù)脂不同填裝高度對(duì)中總皂苷提取效果的影響Fig. 2 Effect of different filling height of macroporous resin on extraction of total saponins

表2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5 回收率實(shí)驗(yàn)

通過(guò)計(jì)算得出，低、中、高 3個(gè)濃度的平均加標(biāo)回收率分別為: 96.4%、98.4%和 99.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.0%、1.5%和1.6%，滿足實(shí)驗(yàn)要求，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

皂苷類(lèi)物質(zhì)具有一定的生物活性，可用于食品添加劑、保健食品、化妝品中，建立一種簡(jiǎn)便、可靠的測(cè)定方法十分必要[10-11]。香草醛-高氯酸法是苷類(lèi)化合物測(cè)定時(shí)最廣泛采用的顯色法，本文配制不同濃度的人參皂苷對(duì)照品溶液建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的供試品溶液中皂苷濃度計(jì)算得出降血脂片中總皂苷的含量。本研究表明采用超聲波提取法提取人參皂苷工藝具有提取成本低、安全、快捷等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)大孔樹(shù)脂填充高度為3 cm時(shí)具有最佳提取得率，供試品中總皂苷測(cè)定重復(fù)性和加標(biāo)回收率均良好。