王代波，代亮亮，李冰晶，趙景芳，羅麗平，徐 青

(貴州省生物研究所，貴州 貴陽 500009)

多穗柯(LithocarpuspolystachyrusRehd.)[1]，殼斗科櫟屬喬木，在貴州被稱作“甘茶”，俗稱甜茶，有茶、糖、藥三種功能，是西方發(fā)達(dá)國家正在尋找的一種具有良好保健功能且適合肥胖人群和糖尿病人群使用的替代糖類的珍貴野生資源植物。多穗柯以野生狀態(tài)分布于我國長江以南各省區(qū)海拔400 m以上的低山密林中，湖南雪峰山一帶分布最廣，貴州等西南幾個省區(qū)也發(fā)現(xiàn)有大量野生資源。多穗柯作為藥食資源在中國已有千年歷史，其嫩葉制茶，色澤鮮翠，透亮晶瑩，有生津止渴、消除疲勞、清熱化痰、解暑之功效[2]，還可用于治療肺熱咳嗽、高血壓、濕熱痢疾、皮膚瘙癢、癰疽瘡瘍等[3]。多穗柯的主要化學(xué)成分是黃酮類和三萜類。黃酮類中的二氫查耳酮類的甜度是葡萄糖的300倍，是多穗柯主要的甜味物質(zhì)，主要成分是根皮苷、三葉苷和3-羥基根皮苷，主要分布在多穗柯葉片中[4-8]。三萜類主要成分為齊墩果烷、達(dá)瑪烷、環(huán)菠蘿蜜烷類等物質(zhì)[9]，在葉、莖中均有分布。研究發(fā)現(xiàn)，多穗柯具有“三降”(降血壓、降血糖、降血脂)[10-13]、“三抗”(抗氧化、抗過敏、抗癌變)、改善記憶力等生物活性[14-16]。多穗柯根皮苷不僅甜度高，還有很強(qiáng)的生物活性，具有很高的開發(fā)利用價值。本研究通過正交試驗(yàn)優(yōu)選最佳超聲輔助提取根皮苷的工藝條件，為多穗柯根皮苷制備及其產(chǎn)品開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生多穗柯葉片(采自貴州羅甸)、純水、乙醇、根皮苷對照品(純度>98%，批號：GT67195，酷爾化學(xué)科技有限公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

JEA502型中藥粉碎機(jī)(北京市泰和格潤儀器有限公司)；FW135/FW200電子天平(上海譜春計(jì)量儀器有限公司)；KQ-800DE超聲波儀器(昆山市超聲儀器公司)；SHIMADZU UV-1750紫外分光光度計(jì)；800電動離心機(jī)(上海梅香儀器有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 根皮苷檢測方法

用分析天平精確稱量根皮苷標(biāo)準(zhǔn)品樣品6.0 mg，用甲醇完全溶解后，定容于50 mL容量瓶中，得到濃度為0.1 mg/mL的根皮苷標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取0.5、1、1.5、2、2.5、3.0 mL的0.12 mg/mL的根皮苷標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中，用甲醇定容。用0.018 mg/mL的根皮苷標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行掃波，確定其最大吸收波長為284 nm。按照上述檢測方法在284 nm處測定吸光值。得根皮苷濃度Y(mg/mL)與吸光度X的回歸方程：Y= 31.02X+ 0.0253，R2= 0.9995。

1.3.2 提取工藝

多穗柯葉片60℃烘箱烘干，利用超微粉碎機(jī)對葉片進(jìn)行粉碎得粗粉，過篩(2號篩，24目)，得多穗柯葉片細(xì)粉樣品。準(zhǔn)確稱取5.0 g多穗柯樣品于250 mL錐形瓶中，采用濃度為50%的乙醇溶液作為提取液，以超聲波輔助法提取多穗柯根皮苷，分別在不同的超聲波功率、提取時間、料液比、提取溫度條件下提取多穗柯根皮苷，提取結(jié)束后，抽濾得提取液，取定量提取液稀釋、定容，過膜測定根皮苷吸光值。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

提取時間對提取率的影響 采用50%乙醇為提取液。提取條件：提取溫度50℃、提取功率800 W、料液比1∶30。提取時間采用15 min、30 min、45 min、60 min、75 min。測定根皮苷吸光值、計(jì)算得率。選取較適宜提取時間。

提取溫度對提取率的影響 采用50%乙醇為提取液。提取條件：較適宜提取時間、提取功率800 W、料液比1∶30。提取溫度采用15℃、30℃、50℃、65℃、80℃。測定根皮苷吸光值、計(jì)算得率。選取較適宜提取溫度。

提取功率對提取率的影響 采用50%乙醇為提取液。提取條件：較佳提取時間、較佳提取溫度、料液比1∶30。采用480 W、560 W、640 W、720 W、800 W。測定根皮苷吸光值、計(jì)算得率。選取較適宜提取功率。

料液比對提取率的影響 采用50%乙醇為提取液。提取條件：較佳提取時間、較佳提取溫度、較佳提取功率。采用料液比1∶10、1∶30、1∶50、1∶70、1∶90。測定根皮苷吸光值、計(jì)算得率。選取較適宜提取料液比。

1.3.4正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，設(shè)計(jì)4因素(提取時間、提取溫度、提取功率、料液比)3水平L9(34)正交實(shí)驗(yàn)。根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析不同因素影響甘茶根皮苷提取得率的主次順序得出較佳提取工藝條件。

1.3.5驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按照1.3.4最佳工藝參數(shù)重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，考察重復(fù)性和穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 提取時間對提取率的影響

提取時間對多穗柯根皮苷提取得率的影響如圖1所示，提取時間少于50 min時，根皮苷得率與提取時間呈正相關(guān)。提取時間多于50 min時，根皮苷得率與提取時間呈負(fù)相關(guān)。圖中在提取時間在50 min時，顯示為提取得率峰值，故選擇50 min為較佳提取時間。

圖1 不同時間提取根皮苷得率Fig. 1 The effect of time on the extraction rate of phloridzin

2.1.2 提取溫度對提取率的影響

提取溫度對多穗柯根皮苷提取得率的影響如圖2所示，提取得率在提取溫度50℃時取得峰值，提取溫度<50℃時，溫度越高，得率越高。提取溫度>50℃時，溫度越高，得率越低。故取50℃為較佳提取溫度。

圖2 不同溫度提取根皮苷得率Fig. 2 The effect of temperature on the txtraction rate of phloridzin

2.1.3 提取功率對提取率的影響

提取溫度對多穗柯根皮苷提取得率的影響如圖3所示，當(dāng)提取功率為720 W左右取得最大提取得率。取720 W為較佳提取功率。

圖3 不同功率提取根皮苷得率Fig. 3 The effect of ultrasonic power on the extraction rate of phloridzin

2.1.4 料液比對提取率的影響

料液比對多穗柯根皮苷提取得率的影響如圖4所示，當(dāng)料液比>1∶30時，料液比越大，提取得率越低。當(dāng)料液比<1∶30時，料液比越大，提取率越高。料液比為1∶30時取得最高提取率，故1∶30為較佳料液比。

圖4 不同料液比提取根皮苷得率Fig. 4 The effect ofsolid liquid ratio on the extraction rate of phloridzin

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)出的最適宜提取條件，進(jìn)行4因素(A：提取時間/min、B：提取溫度/℃、C：提取功率/W、D：料液比)三水平L9(34)正交試驗(yàn)，因素水平表如表1所示，重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)取均值，結(jié)果如表2所示，四因素極差滿足RA>RB>RC>RD，表明以50%乙醇為提取液時，影響多穗柯根皮苷提取得率的因素依次為提取時間、提取溫度、提取功率、料液比，且較優(yōu)提取條件為A2B2C2D2，即以50%乙醇為提取液時，超聲波輔助提取貴州野生多穗柯根皮苷的最佳條件為提取時間50 min、提取溫度50℃、提取功率720 W、料液比1∶30。表3方差分析結(jié)果顯示提取時間和提取溫度對多穗柯根皮苷提取率有顯著性影響。

表1 L9(34)因素水平表

表2 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)直觀分析表

表3 L9(34))正交實(shí)驗(yàn)方差分析表

2.3 最佳提取條件驗(yàn)證試驗(yàn)

按正交試驗(yàn)得出的較優(yōu)提取條件重復(fù)3次試驗(yàn)，多穗柯根皮苷提取得率分別為1.376%、1.384%、1.396%，平均得率1.385%，SD為0.10%，RSD為0.726%，表明工藝穩(wěn)定、可重復(fù)性強(qiáng)。

3 結(jié)論與討論

本研究探究了以50%乙醇為提取液超聲波輔助提取多穗柯根皮苷的方法，優(yōu)選出較優(yōu)提取工藝條件為：提取時間50 min、提取溫度50℃、提取功率720 W、料液比1∶30。此工藝經(jīng)過驗(yàn)證試驗(yàn)表明穩(wěn)定性好、重復(fù)性高。通過方差分析表明提取時間和提取溫度對提取率有顯著影響。實(shí)驗(yàn)中各因素對多穗柯根皮苷提取率的影響從大到小依次為提取時間、提取溫度、提取功率、料液比。用超聲波輔助提取貴州野生多穗柯時，提取時間對提取率影響最大，提取時間小于50 min時，根皮苷得率與提取時間呈正相關(guān)。提取時間大于50 min時，根皮苷得率與提取時間呈負(fù)相關(guān)。所以50 min是較適宜提取時間，采用此條件能提升多穗柯提取率。此外，超聲波輔助可快速破壞植物細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，溶劑迅速進(jìn)入細(xì)胞，加快有效成分的浸出，并保持生物活性，從而提升多穗柯利用價值。