楊水艷，彭 濤，楊 瑾，陳國艷，郭 穎，陶 銀，劉付英，邵志凌

(1.云南省糧油科學研究院(云南省糧油產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心)，昆明 650033；2.西雙版納印奇生物資源開發(fā)有限公司，云南 西雙版納 666100)

美藤果(PlukenetiavolubilisL.)，又名南美油藤、星油藤、印加果、印加花生、印奇果，是大戟科(Euphorbiaceae)的一種木質(zhì)藤本植物，原生長在南美洲的熱帶雨林海拔200～1 500 m，印加語稱Sacha Inchi或Inca Inchi，已被南美印第安土著居民食用了3 000多年[1-5]。美藤果當年種植，當年可掛果，2～3年即進入盛產(chǎn)期，產(chǎn)量很高[6]。美藤果種子的主要成分是油脂、蛋白質(zhì)、維生素、甾醇等生物活性物質(zhì)，以及生物堿、皂甙和香豆素等次生代謝物[7]。美藤果含油量很高，在41%～54%，蛋白質(zhì)含量25%～27%[8-12]。美藤果油對調(diào)節(jié)血脂、預防心血管疾病、保養(yǎng)肌膚等方面有顯著作用[13]。

水分含量、含油量和蛋白質(zhì)含量是美藤果的重要品質(zhì)指標，檢測這些指標主要采用烘箱干燥法、索氏抽提法、凱氏定氮法等傳統(tǒng)方法。美藤果種子有一層近1 mm厚的果殼，而且美藤果含油量較高，在檢測之前須將其粉碎至合適的粒度，普通的實驗室粉碎機難以對其進行粉碎。Niu[9]、Zanquia[11]等采用攪拌機進行粉碎后過篩以達到實驗要求。GB/T 14488.1—2008《植物油料 含油量測定》中規(guī)定對于含油量高的樣品，在粉碎前可將其放入-10～-20℃下冷凍，但是粉碎過程中及粉碎后要避免其吸收水分。所以在采用傳統(tǒng)方法對美藤果的品質(zhì)指標進行檢測時，樣品的前處理過程比較煩瑣，耗時長，檢測中消耗試劑多。相對于傳統(tǒng)方法，近紅外光譜法具有分析速度快、效率高、非破壞性、分析成本低、無污染、幾乎不需預處理、操作方便、無需使用試劑等優(yōu)點[14-15]。目前，國內(nèi)外尚無已知的美藤果品質(zhì)指標的近紅外光譜檢測方法。本文通過傳統(tǒng)國標方法檢測美藤果水分含量、蛋白質(zhì)含量和含油量的化學值，之后與美藤果(包括顆粒和粉)的近紅外光譜進行擬合之后，建立美藤果水分含量、蛋白質(zhì)含量和含油量的近紅外光譜校正模型，并對該模型進行驗證。建立的模型可用于美藤果采收及美藤果油生產(chǎn)加工企業(yè)快速檢測美藤果的品質(zhì)，同時也可用于美藤果種子培育過程中品質(zhì)監(jiān)測。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

美藤果，由西雙版納印奇生物資源開發(fā)有限公司采集并提供，共121份，每份3 kg，隨機抽取其中的101份樣品用于建立校正模型，20份用作驗證。美藤果主要采自我國云南景洪、普文、勐臘、勐養(yǎng)、大勐龍、普洱市、墨江縣、紅河州，泰國以及老撾瑯勃拉邦、南塔、烏多姆賽、豐沙里。采集時間為2016—2018年的不同收獲月份。

石油醚(沸程60～90℃)，天津市風船化學試劑科技有限公司；EDTA標準品(含氮量9.58%)，丹麥FOSS公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

PM200行星式球磨儀，德國Retsch公司；YS-02小型高速粉碎機，北京燕山正德機械設(shè)備有限公司；SER148脂肪測定儀，意大利VELP公司；ThermoStable SOFW155電熱鼓風干燥箱，韓國DAIHAN Scientific公司；DA7250近紅外分析儀，瑞典波通儀器公司；Dumatec 8000杜馬斯燃燒定氮儀，丹麥FOSS公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備

所有樣品在測定之前用孔徑4.5 mm的篩子去除灰塵等雜質(zhì)，手工去除其他固體雜質(zhì)。用于采集近紅外光譜及水分含量測定的美藤果采用YS-02小型高速粉碎機粉碎12 s(粉碎時間過長會導致出油過多，影響后續(xù)測定)，得到美藤果粉。粉碎的樣品裝入聚四氟乙烯袋子密封并及時用于水分含量測定及近紅外光譜掃描。

用小型高速粉碎機粉碎得到的美藤果粉，粒度達不到含油量(濕基)和蛋白質(zhì)含量(濕基)測定的要求，故采用PM200行星式球磨儀進行粉碎。通過預實驗確定560 r/min速度粉碎美藤果90 s，此時樣品成膏狀，果肉、果殼粉碎充分且基本不會出油。

1.2.2 化學值檢測

水分含量測定參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》第一法直接干燥法。每個樣品重復測定2次，相對誤差不得超過10%。

含油量(濕基)測定參考GB/T 14488.1—2008《植物油料 含油量測定》、GB 5009.6—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》及文獻[9]，按下述操作進行：稱取2.5 g(精確到0.001 g)樣品于濾紙筒中，用石油醚(沸程60～90℃)于130℃浸提4 h，淋洗3 h，回收石油醚后將含有抽提油脂的恒重燒杯于(103±2)℃的電熱鼓風干燥箱干燥1.5 h后冷卻稱重。每個樣品重復測定2次，相對誤差不得超過10%。

蛋白質(zhì)含量(濕基)測定參考GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質(zhì)的測定》第三法燃燒法。通過對儀器條件及工作曲線等進行優(yōu)化，最終確定檢測條件：燃燒爐頂部溫度1 100℃；燃燒爐底部溫度300℃；還原爐頂部溫度600℃；還原爐底部溫度750℃；恒溫箱40℃；IC反應器150℃。以EDTA為標準物質(zhì)建立工作曲線，稱取約100 mg樣品進行測定。蛋白質(zhì)含量為氮含量乘以系數(shù)6.25。每個樣品重復測定2次，相對誤差不得超過10%。

1.2.3 校正模型的建立

1.2.3.1 近紅外光譜采集

考慮到模型除了可以用于實驗室中快速檢測美藤果品質(zhì)外，還可用于美藤果收購、生產(chǎn)加工油脂以及育種過程中的質(zhì)量控制，模型必須具有可操作性，尤其在收購環(huán)節(jié)中，采用模型進行檢測時必須快速、簡便、易行，所以首先采用整粒美藤果進行掃描光譜后建模。

美藤果種子有一層近1 mm厚的果殼，在掃描近紅外光譜時，果殼會影響近紅外光的透射從而使吸光度減小，如果將果殼除去，會排除這樣的干擾，但是美藤果果殼比較堅硬，剝殼比較耗時。采用小型粉碎機將其粉碎，既可以減少果殼的影響而且樣品均勻性更好，更具有代表性。

綜上，用DA7250近紅外分析儀分別采集美藤果及美藤果粉的近紅外光譜，采用漫反射方式掃描，波長950～1 650 nm，光譜分辨率2 nm，每個樣品檢測4次，取平均吸光度光譜作為最終光譜。

1.2.3.2 光譜預處理

在近紅外光譜測量過程中，由于多種因素影響，導致測量光譜中含有噪聲、基線漂移、波長漂移等不穩(wěn)定因素。為了減少不利因素的影響，對光譜信號進行消除噪聲等預處理是十分必要的。譜圖預處理主要包括噪聲和其他譜圖不規(guī)則影響因素的濾除和譜圖信息的優(yōu)化。在近紅外光譜分析領(lǐng)域中，常用的預處理方法包括光譜增強算法、標準正態(tài)變量變換(SNV)等多種方法。在實際應用過程中，通常采用一種或多種方法相結(jié)合對光譜進行預處理[18]。本文主要采用Savitzky-Golay卷積一階求導處理(SGFD)、SNV及二者的結(jié)合對光譜進行預處理。

1.2.3.3 校正集與驗證集選擇

在建立光譜多元校正模型之前要進行樣本校正集和驗證集的挑選，這是光譜分析中的一個重要環(huán)節(jié)，直接影響所建立校正模型的準確性。目前，常用的樣本校正集與驗證集劃分方法有隨機(RS)法、Kennard-Stone(KS)法、含量梯度法(Rank)等[16]。本文采用RS法進行選擇，得到101個校正集樣品和20個驗證集樣品。

1.2.3.4 建模方法及模型評價

采用The Unscrambler X10.4軟件對光譜進行不同預處理后采用偏最小二乘(Partial Least Squares，PLS)法建立校正模型及交叉驗證。采用校正相關(guān)系數(shù)(Correlation coefficient of calibration,Rc)、校正均方根誤差(Root mean square error of calibration，RMSEC)、交叉驗證相關(guān)系數(shù)(Correlation coefficient of cross validation,Rcv)、驗證均方根誤差(Root mean square error of cross validation，RMSECV)進行模型性能評估。通常一個好的模型應該具有高的Rc、Rcv，低的RMSEC和RMSECV，并且RMSEC和RMSECV值的差異應盡量小[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 美藤果品質(zhì)指標的化學值

美藤果品質(zhì)指標值的分布范圍、平均值和標準偏差見表1。

表1 美藤果品質(zhì)指標化學值統(tǒng)計分析 %

由表1可見，采用RS法選擇的驗證集與校正集中各指標的分布、平均值和標準偏差基本一致。美藤果化學值分布直方圖見圖1。由圖1可見，美藤果的3個品質(zhì)指標的化學值基本呈正態(tài)分布。這些說明樣品采集較合理，具有代表性，能滿足近紅外光譜建立定量模型的條件。

圖1 美藤果品質(zhì)指標化學值分布直方圖

2.2 美藤果顆粒及美藤果粉近紅外光譜圖(見圖2)

圖2 美藤果顆粒(A)及美藤果粉(B)近紅外光譜圖

從圖2可以看出，美藤果顆粒及美藤果粉采集的近紅外光譜趨于一致，在1 206、1 450 nm處有2個特征峰，這2個特征峰主要是O—H鍵的二級振動。由于美藤果粉均勻性比美藤果顆粒好，而且降低了果殼對近紅外光的散射作用，所以美藤果粉的吸光度比顆粒高，且特征吸收峰更明顯。

2.3 PLS模型的建立

2.3.1 水分含量的PLS模型

在PLS模型建立過程中，主因子數(shù)是模型的重要參數(shù)，對模型的預測結(jié)果有很大的影響。因子數(shù)過低時模型精度不足，會丟失光譜的有效信息，導致欠擬合；因子數(shù)過高易出現(xiàn)過擬合的現(xiàn)象。當獲得較小RMSECV同時RMSEC與RMSECV無明顯差異時，判定為最優(yōu)主因子數(shù)[18]。根據(jù)美藤果顆粒和美藤果粉的近紅外光譜圖，對特征峰所在波段1 110～1 270 nm、1 300～1 650 nm、1 110～1 650 nm及全譜的光譜信號進行不同預處理，在最佳主因子數(shù)下建立的水分含量PLS模型校正結(jié)果及預測結(jié)果見表2。

表2 不同光譜預處理下水分含量PLS建模結(jié)果

由表2可見，美藤果顆粒的最佳模型是：1 110～1 650 nm波長，經(jīng)過SNV預處理，最佳主因子數(shù)19，校正模型相關(guān)系數(shù)Rc達到0.993 0，RMSEC為0.061 7%，預測模型相關(guān)系數(shù)Rcv達到0.975 0，RMSECV為0.117 0%。

美藤果粉全譜經(jīng)過SNV預處理后建立的PLS模型最佳，最佳主因子數(shù)10，校正模型相關(guān)系數(shù)Rc達到0.988 0，RMSEC為0.081 6%，預測模型相關(guān)系數(shù)Rcv達到0.983 7，RMSECV為0.096 2%。

2.3.2 含油量(濕基)的PLS模型

含油量(濕基)的建模過程與水分含量的建模過程類似，具體的PLS模型校正結(jié)果及預測結(jié)果見表3。

由表3可見，美藤果顆粒在1 110～1 650 nm波長的原始光譜建立的校正模型和驗證模型效果最好，最佳主因子數(shù)10，校正模型相關(guān)系數(shù)Rc達到0.956 3，RMSEC為0.336 1%，驗證模型相關(guān)系數(shù)Rcv達到0.931 0，RMSECV為0.444 2%。

美藤果粉在1 300～1 650 nm的光譜經(jīng)SGFD預處理后，最佳主因子數(shù)為11的情況下建立的校正模型和驗證模型的效果最好，校正模型相關(guān)系數(shù)Rc達到0.974 1，RMSEC為0.277 8%，驗證模型相關(guān)系數(shù)Rcv達到0.914 1，RMSECV為0.524 3%。

表3 不同光譜預處理下含油量(濕基)PLS建模結(jié)果

2.3.3 蛋白質(zhì)含量(濕基)的PLS模型

蛋白質(zhì)含量的建模過程與水分含量及含油量的建模過程類似，具體的PLS模型校正結(jié)果及預測結(jié)果見表4。

表4 不同光譜預處理下蛋白質(zhì)含量(濕基)PLS建模結(jié)果

由表4可見，美藤果顆粒在1 110～1 270 nm波長的光譜經(jīng)過SNV預處理后，最佳主因子數(shù)為8的情況下建立的校正模型和驗證模型的效果最好，校正模型相關(guān)系數(shù)Rc達到0.962 0，RMSEC為0.363 9%，驗證模型相關(guān)系數(shù)Rcv達到0.929 7，RMSECV為0.497 4%。

美藤果粉在1 110～1 270 nm波長的原始光譜建立的校正模型和驗證模型最好，最佳主因子數(shù)7，校正模型相關(guān)系數(shù)Rc達到0.947 5，RMSEC為0.424 9%，驗證模型相關(guān)系數(shù)Rcv達到0.918 2，RMSECV為0.508 9%。

2.4 模型驗證

在模型投入使用前還需對其進行外部驗證，以便檢查能否準確預測結(jié)果。良好的模型除了滿足內(nèi)部交叉驗證需要，在用驗證集進行外部驗證時，其預測結(jié)果與標準方法實際測量結(jié)果應有良好的一致性。一般用已建立的模型對5～10個性質(zhì)參數(shù)已知但未參與建模的合格樣品(即驗證集)進行分析測試，只要誤差在能夠接受范圍內(nèi)的樣品數(shù)與誤差在不能夠接受范圍內(nèi)的樣品數(shù)之比大于3∶2，則一般認為該模型是有效的，便可投入使用[15]。

將建好的校正曲線拷貝到近紅外光譜儀，對未參與建模的20個樣品進行檢測，實測值與預測值及相對誤差(Relative error,RE)見表5。

由表5可見，美藤果顆粒和美藤果粉分別有3個樣品的蛋白質(zhì)含量預測值超出了誤差范圍(|RE|≤10%)，其余預測值均符合誤差要求，這表明用兩種方法采集近紅外光譜建立的校正模型都能較好地實現(xiàn)對美藤果水分含量、含油量(濕基)和蛋白質(zhì)含量(濕基)的預測。

表5 校正模型驗證結(jié)果

注：括號中數(shù)據(jù)為各指標的相對誤差。

3 結(jié) 論

本文從云南、泰國、老撾等不同美藤果種植基地采集了2016—2018年不同收獲月份的121份樣品，隨機抽取了101份用于建立PLS模型，20份樣品用于外部驗證。采用傳統(tǒng)的烘箱干燥法、索氏抽提法、燃燒法分別測定了121份美藤果樣品的水分含量、含油量(濕基)和蛋白質(zhì)含量(濕基)，之后分別采集了美藤果顆粒和美藤果粉的近紅外光譜，對光譜進行不同的預處理后進行PLS建模并進行了外部驗證。結(jié)果表明：采用兩種方法建立的PLS模型校正模型的相關(guān)系數(shù)(Rc)均大于0.94，校正均方根誤差(RMSEC)小于0.45%，交叉驗證相關(guān)系數(shù)(Rcv)大于0.91，驗證均方根誤差(RMSECV)小于0.53%。通過外部驗證實驗表明用兩種方法采集近紅外光譜建立的校正模型都能較好地實現(xiàn)對美藤果水分、含油量(濕基)和蛋白質(zhì)含量(濕基)的預測。雖然兩種方法建立的校正模型都能滿足對美藤果品質(zhì)的預測，但是使用美藤果顆粒建立的校正模型進行美藤果品質(zhì)的檢測更簡便，而且對樣品沒有破壞性。