陳勁松，譚傳波，楊耀學(xué)，賴瓊瑋，周剛平，張 帆，盧芳國，吳蘇喜

(1.湖南大三湘茶油股份有限公司，湖南 衡陽 421141； 2.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，長沙 410208；3.長沙理工大學(xué) 化學(xué)與生物工程學(xué)院， 長沙 410114)

油茶(OilCamellia)，又名茶子樹、茶油樹、白花茶等，為山茶科(Theaceae)山茶屬(Camellia)中常綠大灌木或小喬木。油茶已有2 300多年的栽培歷史，集經(jīng)濟、生態(tài)和社會效益于一身，是我國特有的優(yōu)質(zhì)木本油料樹種。油茶與油棕、油橄欖、椰子并列被稱為世界四大木本油料植物[1-2]。

山茶油取自油茶籽，富含不飽和脂肪酸，油酸含量高達75%～80%，因其理化性質(zhì)與“植物油皇后”橄欖油相似而享有“東方橄欖油”的美譽[3-5]。山茶油中含有油酸、亞油酸、亞麻酸、生育酚、植物甾醇和角鯊烯等營養(yǎng)物質(zhì)，長期食用，具有降低膽固醇、預(yù)防心血管疾病的作用[6-8]。最近開發(fā)的鮮榨山茶油含有豐富的天然活性物質(zhì)，其品質(zhì)媲美特級初榨橄欖油[9-11]，而有關(guān)鮮榨山茶油的毒理學(xué)評價還未見報道。

本研究依據(jù)GB 15193—2014《食品安全性毒理學(xué)評價程序和方法》對鮮榨山茶油的食用安全性進行毒理學(xué)評價，為鮮榨山茶油的開發(fā)應(yīng)用提供安全性指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗原料

鮮榨山茶油，采用湖南大三湘茶油股份有限公司鮮榨工藝所得[9]；玉米油，壓榨一級，市購。

1.1.2 試驗動物

SPF級昆明種小鼠、SPF級SD大鼠，均購自湖南斯萊克景達試驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(湘)2016-0002，動物檢疫期為3～5 d。輻照滅菌清潔級大鼠飼料，由北京科澳協(xié)力飼料有公司提供，飼料生產(chǎn)許可證號為SCXK(京)2014-0010。

1.1.3 試驗試劑

環(huán)磷酰胺(CP)，由江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司提供；大鼠肝微粒體酶(S-9)，實驗室自制；氧化型輔酶Ⅱ；2-氨基芴，批號為252361689，F(xiàn)luka公司；敵克松，標準號為HG2318-92，上海金橋化工廠；疊氮鈉，批號為A0345092，ACROS公司；1，8-二羥基蒽醌，批號為 200808054，上海晶純試劑有限公司。

生化試劑盒，由四川新健康成生物股份有限公司提供；血液學(xué)試劑盒，由深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司提供。

鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535 5株標準突變型菌株，由美國MOLTOX公司提供，經(jīng)鑒定符合要求。

中國倉鼠肺(CHL)細胞株，購自中國科學(xué)院細胞庫。

1.1.4 儀器與設(shè)備

JA3003型電子分析天平，奧林巴斯生物顯微鏡，BECKMAN COULTER全自動生化分析儀，BC-5300Vet獸用全自動血液細胞分析儀，超凈工作臺等。

1.2 試驗方法

1.2.1 急性經(jīng)口毒性試驗

采用SD大鼠20只，雌、雄各半，設(shè)10 000 mg/kg 1個劑量組，動物隔夜禁食但不禁水。取適量的鮮榨山茶油，用玉米油配制成質(zhì)量濃度為666.7 mg/mL的混懸液，按1.5 mL/100 g(以大鼠體重計)一次性經(jīng)口灌胃。觀察動物染毒后14 d內(nèi)的中毒癥狀及死亡情況。

1.2.2 遺傳毒性試驗

1.2.2.1 Ames試驗

采用經(jīng)鑒定符合要求的鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535 5株標準突變型菌株進行試驗，并以多氯聯(lián)苯(PCB)誘導(dǎo)的大鼠肝微粒體酶(S-9)作為體外代謝活化系統(tǒng)。根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，試驗設(shè)312.5、625.0、1 250.0、2 500.0、5 000.0 μg/皿 5個劑量，同時設(shè)自發(fā)回變、溶劑(玉米油)對照組(100 μL/皿)和陽性突變劑對照組(100 μL/皿)。首先配制受試液：準確稱取0.5 g受檢樣品，加玉米油定容至10 mL混勻即為最高劑量所用受試液，質(zhì)量濃度為50 mg/mL，以該質(zhì)量濃度受試液為基礎(chǔ)，用玉米油 2倍依次往下稀釋，即得2 500.0、1 250.0、625.0、312.5 μg/皿劑量組所用受試液，質(zhì)量濃度分別為25、12.5、6.25、3.125 mg/mL，經(jīng)0.103 MPa滅菌20 min，靜置至室溫備用。試驗采用平板摻入法，在加與不加S-9的條件下進行測試。試驗時取各受試液0.1 mL加入平皿，每個劑量3個平皿，37℃培養(yǎng)48 h后，計數(shù)每皿回復(fù)突變菌落數(shù)。

1.2.2.2 小鼠骨髓細胞微核試驗

采用昆明種小鼠50只，體重26.0～30.0 g，雌、雄各半，試驗設(shè)2.5、5.0、10 g/kg(以小鼠體重計，下同)3個劑量組，另設(shè)溶劑(玉米油)對照組(20 mL/kg)及陽性(環(huán)磷酰胺)對照組(40 mg/kg)。取16.0 mL受檢樣品加玉米油至30 mL混勻即得質(zhì)量濃度為0.5 g/mL受試液，供10 g/kg劑量組動物使用，然后分別取該受試液4.0、8.0 mL加玉米油至16 mL，即得0.125、0.25 g/mL受試液供2.5、5.0 g/kg 劑量組動物使用；取環(huán)磷酰胺200 mg加注射用氯化鈉溶液10 mL配得母液，取該母液按1∶9的比例用注射用氯化鈉溶液稀釋成質(zhì)量濃度為2 mg/mL的環(huán)磷酰胺溶液，供陽性對照組動物使用。灌胃量為20 mL/kg，試驗采用30 h兩次灌胃法，間隔24 h，于末次給樣后6 h頸椎脫臼處死動物，取胸骨骨髓按GB 15193—2014《食品安全性毒理學(xué)評價程序和方法》中骨髓細胞微核試驗的規(guī)定進行制片，固定，Giemsa染色后，在油鏡下每只小鼠計數(shù)2 000個嗜多染紅細胞(PCE)中含微核細胞數(shù)，計算微核率。計數(shù)200個嗜多染紅細胞，計算嗜多染紅細胞與成熟紅細胞比值(PCE/NCE)。

1.2.2.3 體外哺乳類細胞染色體畸變試驗

選用中國倉鼠肺(CHL)細胞株進行試驗。預(yù)試驗結(jié)果顯示，在加與不加S-9的條件下，5 000 μg/皿劑量組均不影響細胞相對生長率，故正式試驗設(shè)1 250、2 500、5 000 μg/mL 3個劑量組，另設(shè)溶劑(DMSO)對照組及陽性(不加S-9:甲磺酸甲酯(MMS),10 μg/mL。加S-9:環(huán)磷酰胺,10 μg/mL)對照組。準確稱取5 g受檢樣品，加DMSO定容至10 mL混勻即得質(zhì)量濃度為0.5 g/mL受試液，供5 000 μg/mL劑量組使用，然后分別取該受試液5、2.5 mL加DMSO至10 mL，即得0.25、0.125 g/mL受試液，供2 500、1 250 μg/mL劑量組使用；分別取甲磺酸甲酯10 mg和環(huán)磷酰胺10 mg加無菌蒸餾水定容至10 mL,配得質(zhì)量濃度均為0.001 g/mL溶液供陽性對照組使用。調(diào)整細胞密度至5×105個/mL,每瓶5 mL，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后吸去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，加入相應(yīng)質(zhì)量濃度的受試物50 μL，4 mL不含血清的培養(yǎng)液和1 mL S-9(不加S-9時，用培養(yǎng)液補足)，37℃培養(yǎng)4 h。吸去含受試物的培養(yǎng)液，換入新鮮含胎牛血清的培養(yǎng)液5 mL，繼續(xù)于37℃培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h向培養(yǎng)瓶中加入秋水仙素(終質(zhì)量濃度為1 μg/mL)。秋水仙素作用4 h后，用0.25%胰蛋白酶液消化，離心并收獲細胞，常規(guī)制片。Giemsa染色后，在高倍鏡下每組鏡檢100個中期分裂相細胞，觀察記錄畸變細胞數(shù)和畸變類型等，計算染色體畸變率。

1.2.3 大鼠28 d經(jīng)口毒性試驗

選用斷乳SD大鼠100只，雌、雄各半，雌鼠體重為75～ 92 g，雄鼠體重為79～91.5 g。因溶媒為玉米油，最大灌胃量為4 mL/kg，故高劑量組的劑量為3.752 g/kg。試驗設(shè)0.938、1.876、3.752 g/(kg·d)(分別相當(dāng)于人擬用劑量的5.2、10.5、21倍)3個受試物劑量組，1個對照組，每組20只大鼠，雌、雄各半。另設(shè)對照組和高劑量衛(wèi)星組，每組10只大鼠，雌、雄各半，做恢復(fù)期觀察。試驗采用灌胃法，灌胃量為4 mL/(kg·d)。受試液每天新鮮配制，根據(jù)設(shè)計劑量，第1周每天分別取5.0、10.0、20.0 mL受檢樣品加玉米油至20 mL混勻即得質(zhì)量濃度分別為234.5、469.0、938.0 mg/mL受試液，供0.938、1.876、3.752 g/(kg·d)劑量組動物使用；隨后每周根據(jù)動物體重增長情況配制相應(yīng)體積的受試液，配制方法及受試液質(zhì)量濃度同第1周。溶劑對照組給予等體積的玉米油。每天定時灌胃1次，連續(xù)灌胃28 d。衛(wèi)星組動物于染毒停止后繼續(xù)觀察14 d。試驗動物單籠喂養(yǎng)，自由飲水、進食。每天觀察動物的一般表現(xiàn)、行為、中毒癥狀及死亡情況。每周末稱1次體重及食物攝入量(第1～4周每周稱2次體重)。染毒結(jié)束后，各劑量組和對照組動物隔夜禁食約16 h，經(jīng)腹主動脈采血檢測血清天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶(AST)、血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、尿素(Urea)、肌酐(Cre)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、血糖(GLU)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、谷氨酰轉(zhuǎn)酞酶(GGT)、鉀、鈉、氯等血液生化指標。試驗結(jié)束時將動物處死，解剖動物觀察內(nèi)臟改變，稱心、胸腺、肝、脾、腎、腎上腺、睪丸質(zhì)量并計算其臟體比。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

小鼠骨髓細胞微核試驗用泊松分布和卡方檢驗進行統(tǒng)計學(xué)處理，大鼠28 d經(jīng)口毒性試驗采用IBM SPSS Statistics 20統(tǒng)計軟件對各項檢測數(shù)據(jù)作單因素方差分析，秩和檢驗或t檢驗對各項檢測數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性經(jīng)口毒性試驗

鮮榨山茶油大鼠急性經(jīng)口毒性試驗結(jié)果表明，動物染毒后活動如常，未出現(xiàn)明顯中毒癥狀，觀察期內(nèi)未發(fā)生死亡。7 d和14 d稱重動物體重均有增長。雌、雄大鼠急性經(jīng)口LD50均大于10 000 mg/kg，按照劑量分級評定鮮榨山茶油雌、雄大鼠急性經(jīng)口毒性級別均屬實際無毒級。

2.2 遺傳毒性試驗

2.2.1 Ames試驗

鮮榨山茶油細菌回復(fù)突變試驗結(jié)果見表1。

表1 鮮榨山茶油細菌回復(fù)突變試驗結(jié)果

注：a為敵克松，50 μg/皿；b為2-氨基芴，10 μg/皿；c為疊氮鈉，1.5 μg/皿；d為1,8-二羥基蒽醌，50 μg/皿。

由表1可見，受檢樣品各劑量組對各試驗菌株在加與不加S-9代謝活化系統(tǒng)條件下，回復(fù)突變菌落數(shù)均未超過自發(fā)回變的2倍，亦無劑量反應(yīng)關(guān)系，而陽性對照組的平均回復(fù)突變菌落數(shù)均超過對照組2倍，呈現(xiàn)明顯陽性反應(yīng)，上述結(jié)果表明該受試樣品未誘導(dǎo)5種菌株回復(fù)突變菌落數(shù)增加。因上述試驗結(jié)果為陰性，故整套Ames試驗重復(fù)1次，重復(fù)試驗設(shè)8、40、200、1 000、5 000 μg/皿5個劑量，其他試驗條件保持不變。重復(fù)試驗亦未見受試樣品誘導(dǎo)5種菌株回復(fù)突變菌落數(shù)增加。

2.2.2 小鼠骨髓細胞微核試驗

鮮榨山茶油對小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核率的影響見表2。

表2 鮮榨山茶油對小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核率的影響

注： **表示與溶劑對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01。下同。

由表2可見，各劑量組PCE/NCE比值正常，未見受檢樣品對昆明種雌、雄小鼠骨髓細胞增殖有抑制作用。溶劑對照組昆明種雌、雄小鼠骨髓PCE微核率分別為0.25%和0.23%。各劑量組昆明種雌、雄小鼠骨髓PCE微核率分別為0.23%～0.26%和0.15%～0.16%，與溶劑對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。陽性對照組昆明種雌、雄小鼠骨髓PCE微核率分別為2.81%和2.44%，與溶劑對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。上述結(jié)果表明未見受試樣品誘發(fā)小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核率增高。

2.2.3 體外哺乳類細胞染色體畸變試驗

鮮榨山茶油對CHL細胞染色體畸變率的影響(4 h)見表3。

表3 鮮榨山茶油對CHL細胞染色體畸變率的影響(4 h)

由表3可見：在不加S-9與加S-9的條件下接觸受試物4 h，溶劑對照組CHL細胞染色體畸變率分別為4.0%和3.0%；鮮榨山茶油各劑量組CHL細胞染色體畸變率分別為2.0%、4.0%、3.0%和3.0%、4.0%、2.0%，與相應(yīng)的溶劑對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。陽性對照組(MMS和CP)CHL細胞染色體畸變率分別為25.0%和28.0%，與相應(yīng)的溶劑對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。因上述試驗結(jié)果為陰性，故另設(shè)不加S-9的試驗，將受試物接觸時間延長至24 h，重復(fù)體外哺乳類細胞染色體畸變試驗1次。鮮榨山茶油對CHL細胞染色體畸變率的影響(24 h)見表4。由表4可見：在不加S-9條件下，受試物染毒時間延長至24 h，溶劑對照組CHL細胞染色體畸變率為3.0%；鮮榨山茶油各劑量組CHL細胞染色體畸變率分別為2.0%、3.0%、4.0%，與相應(yīng)的溶劑對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。陽性對照組(MMS)CHL細胞染色體畸變率為31.0%，與相應(yīng)的溶劑對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。在本試驗條件下，鮮榨山茶油未引起CHL細胞染色體畸變率增高。

表4 鮮榨山茶油對CHL細胞染色體畸變率的影響(24 h)

2.3 大鼠28 d經(jīng)口毒性試驗

試驗發(fā)現(xiàn)各劑量組雌、雄大鼠在整個試驗期間的活動、進食、飲水基本正常，糞便性狀正常，亦未見明顯行為改變和中毒表現(xiàn)。鮮榨山茶油28 d經(jīng)口毒性試驗各組SD大鼠體重及總增重見表5。

表5 鮮榨山茶油28 d經(jīng)口毒性試驗各組SD大鼠體重及總增重

由表5可見，各劑量組雌、雄大鼠試驗期間各周體重、總增重與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

鮮榨山茶油28 d經(jīng)口毒性試驗?zāi)┢诟鹘MSD大鼠血液生化指標測定結(jié)果見表6。

由表6可見：試驗?zāi)┢诟邉┝拷M雌性大鼠尿素(Urea)、甘油三酯(TG)和中劑量組雌性大鼠血糖(GLU)、尿素(Urea)均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；試驗?zāi)┢诟邉┝拷M雄性大鼠血糖(GLU)、氯(Cl)均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；以上幾個指標值均在本實驗室正常范圍內(nèi)，沒有生物學(xué)意義；各劑量組雌、雄大鼠其他各項血液生化學(xué)指標與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

鮮榨山茶油28 d經(jīng)口毒性試驗各組SD大鼠臟器質(zhì)量與臟體比測定結(jié)果見表7。

由表7可見，各劑量組雌、雄大鼠各項臟器質(zhì)量、臟體比及禁食后體重與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。試驗中未見器官組織形態(tài)的異常變化?；謴?fù)期觀察表明高劑量衛(wèi)星組亦未見動物健康狀況、血液生化指標和器官組織形態(tài)的異常變化。

表6 鮮榨山茶油28 d經(jīng)口毒性試驗?zāi)┢诟鹘MSD大鼠血液生化指標測定結(jié)果

注：與對照組比較*P<0.05，**P<0.01差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表7 鮮榨山茶油28 d經(jīng)口毒性試驗各組SD大鼠臟器質(zhì)量與臟體比測定結(jié)果

3 結(jié) 論

通過小鼠急性毒性試驗、遺傳毒性試驗和亞急性毒性試驗對鮮榨山茶油進行毒理學(xué)研究， 并對其做安全性評價。鮮榨山茶油對大鼠的急性經(jīng)口LD50大于10 000 mg/kg，判屬實際無毒級；遺傳毒性試驗(Ames試驗、小鼠骨髓細胞微核試驗和體外哺乳類細胞染色體畸變試驗)結(jié)果均為陰性；在大鼠 28 d喂養(yǎng)試驗中未見動物健康狀況和器官組織形態(tài)的異常變化，大鼠體重、TP、ALB、AST、ALT、GGT、ALP、Cre、TC、Na、K、臟器質(zhì)量、臟體比與對照組相比均無顯著差異，Urea、TG、GLU、Cl均在實驗室正常范圍內(nèi)?；謴?fù)期觀察表明高劑量衛(wèi)星組亦未見動物健康狀況、血液生化指標和器官組織形態(tài)的異常變化。鮮榨山茶油無急性毒性、遺傳毒性和亞急性毒性，具有較高的食用安全性。