潘孝妍，陳長鴻，王秀海，曹 猛，劉平懷

(海南大學(xué) 化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，?？?570228)

化石能源的枯竭及其所帶來的環(huán)境問題迫使人們研究、開發(fā)新的可再生能源。生物柴油以其可再生性而得到世界的廣泛關(guān)注[1]。與傳統(tǒng)的陸生油料植物相比，微藻具有光合作用效率高、環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)、培養(yǎng)周期短、油脂產(chǎn)量高、產(chǎn)生高附加值產(chǎn)物、不占用耕地、可用廢水進(jìn)行培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)[2]。因此，利用微藻生產(chǎn)生物柴油具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。然而，自然環(huán)境中的微藻生長速度緩慢，油脂產(chǎn)量較低，因此研究微藻生長的環(huán)境條件對(duì)提高微藻生長速率、實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)至關(guān)重要。

氮和磷是生物體合成蛋白質(zhì)和核酸的基本成分，是調(diào)控植物生長發(fā)育的重要因子之一[3]。何思思等[4]研究發(fā)現(xiàn)，在高氮濃度下，魏氏真眼點(diǎn)藻的生物量最高，而在低氮濃度下，油脂含量最高。江懷真等[5]研究發(fā)現(xiàn)，低氮濃度和低磷濃度條件可以促進(jìn)小球藻油脂的積累。碳是微藻細(xì)胞骨架的主要構(gòu)成元素，可占微藻細(xì)胞干重的50%[6]。Shakya等[7]研究表明，在較高溫度下，碳酸鈉可以提高含高碳水化合物藻類的油脂含量。鈣被公認(rèn)為是植物的第二營養(yǎng)要素，是構(gòu)成細(xì)胞膜的主要成分，對(duì)碳水化合物的形成與轉(zhuǎn)化有重要的影響[8]。張森等[9]研究發(fā)現(xiàn)，降低鈣濃度可以促進(jìn)微藻Desmodesmussp.WC08生長和油脂的積累。此外，鐵[10]、溫度、光照和鹽[11]等也對(duì)微藻生長和油脂積累產(chǎn)生一定的影響。

本研究選擇微藻Ankistrodesmussp.CJ09為研究對(duì)象，基于BG11培養(yǎng)基，通過單因素實(shí)驗(yàn)初步考察不同質(zhì)量濃度的硝酸鈉、磷酸氫二鉀、碳酸鈉和二水氯化鈣對(duì)微藻Ankistrodesmussp.CJ09生長和油脂積累的影響，為微藻的高密度培養(yǎng)和工程微藻的構(gòu)建提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

微藻Ankistrodesmussp.CJ09，由海南大學(xué)生物工程綜合實(shí)驗(yàn)室提供。氯仿、甲醇、硝酸鈉、碳酸鈉、磷酸氫二鉀和二水氯化鈣，均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

賽福智能人工氣候箱，柱狀玻璃管(高60 cm，直徑6 cm)，TU-1810紫外可見分光光度計(jì)，LDJ-25C真空冷凍干燥機(jī)，3H12RI高速冷凍離心機(jī)，SY-1000E 多用途恒溫超聲提取機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 BG11培養(yǎng)基配方

1.5 g/L NaNO3，0.04 g/L K2HPO4，0.075 g/L MgSO4·7H2O，0.036 g/L CaCl2·2H2O,0.006 g/L檸檬酸，0.006 g/L檸檬酸鐵銨，0.001 g/L EDTA·Na2，0.02 g/L Na2CO3，2.86 g/L H3BO3，1.18 g/L MnCl2·4H2O，0.222 g/L ZnSO4·7 H2O，0.39 g/L NaMoO4·2H2O，0.079 g/L CuSO4· H2O，0.049 4 g/L CO(NO3)2·6H2O。

1.2.2 培養(yǎng)方法

實(shí)驗(yàn)采用柱狀玻璃管進(jìn)行培養(yǎng)，裝液量為0.7 L，接種比例1∶10(體積比)，光照周期D∶L=12∶12，光照強(qiáng)度8 000 lx。pH 7.0±0.2，培養(yǎng)溫度(27±2)℃，通入無菌空氣，通氣量為40 L/h。以BG11為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，設(shè)定質(zhì)量濃度分別為0、0.75、1.50、2.25、3.00、3.75 g/L的NaNO3為氮源，其他成分均不變。質(zhì)量濃度分別為0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 g/L的K2HPO4為磷源，其他成分均不變。質(zhì)量濃度分別為0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 g/L的Na2CO3為碳源，其他成分均不變。質(zhì)量濃度分別為0、0.009、0.018、0.036、0.054、0.072 g/L的CaCl2·2H2O為鈣源，其他成分均不變。每組質(zhì)量濃度各做3組平行。 培養(yǎng)過程中，每隔24 h取樣，通過紫外分光光度計(jì)測定其OD680，培養(yǎng)時(shí)間15 d。

1.2.3 生物量的測定

培養(yǎng)15 d結(jié)束后，收集藻液，在8 000 r/min離心3 min，所得藻泥用去離子水洗滌3次以去除無機(jī)鹽。然后將收獲的藻泥冷凍干燥，保存在-20℃冰箱中備用。生物量按下式計(jì)算。

P=M/V

式中：P為生物量，g/L；M為干燥微藻的質(zhì)量，g；V為培養(yǎng)液的體積，L。

1.2.4 油脂含量和油脂產(chǎn)量的測定

參照Luyen等[12]的方法(略有修改)對(duì)總脂進(jìn)行提取和測定。稱取一定量的藻粉，加入氯仿-甲醇-水(體積比1∶2∶0.8)，超聲提取，離心后取上清，重復(fù)提取至藻粉灰白。合并上清液，加入氯仿和水至氯仿與甲醇、水三者體積比為1∶1∶0.9，離心，取下層置于干凈玻璃瓶中，氮吹儀吹干至恒重。微藻的油脂含量和油脂產(chǎn)量按下式計(jì)算。

油脂含量=油脂質(zhì)量/微藻干重×100%

油脂產(chǎn)量=油脂含量×微藻生物量

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與分析

結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS Statistics 20.0和ANOVA(p<0.05)進(jìn)行分析，制圖采用Origine Pro 9.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaNO3對(duì)微藻Ankistrodesmus sp.CJ09生長和油脂積累的影響

微藻Ankistrodesmussp.CJ09在不同質(zhì)量濃度NaNO3中的生長曲線見圖1。

圖1 微藻Ankistrodesmus sp.CJ09在不同質(zhì)量濃度NaNO3中的生長曲線

由圖1可以看出，整體上NaNO3質(zhì)量濃度為0.75 g/L時(shí)，微藻Ankistrodesmussp.CJ09生長最快，其次是1.50 g/L(原培養(yǎng)基質(zhì)量濃度)，NaNO3質(zhì)量濃度超過1.50 g/L時(shí)，微藻生長較未添加NaNO3的對(duì)照組的慢。

培養(yǎng)15 d后，測定不同NaNO3質(zhì)量濃度下微藻Ankistrodesmussp.CJ09生長及油脂積累情況，結(jié)果見表1。

表1 培養(yǎng)15 d后不同NaNO3質(zhì)量濃度下微藻Ankistrodesmus sp.CJ09生長及油脂積累情況

注：表中每列不同字母表示差異顯著(p<0.05)。下同。

由表1可以看出，培養(yǎng)15 d后，微藻Ankistrodesmussp.CJ09的生物量在NaNO3質(zhì)量濃度為0.75 g/L達(dá)到最高，為(1.67±0.12)g/L，是空白對(duì)照組的1.45倍。NaNO3質(zhì)量濃度為3.75 g/L時(shí)，生物量最低，為(0.98±0.10)g/L。當(dāng)NaNO3質(zhì)量濃度為0.75 g/L時(shí)，油脂含量和油脂產(chǎn)量達(dá)到最高，分別為(31.49±0.55)%和(0.53±0.009)g/L，高于原培養(yǎng)基質(zhì)量濃度(1.50 g/L)的。之后隨NaNO3質(zhì)量濃度升高，油脂含量和油脂產(chǎn)量整體降低，說明微藻Ankistrodesmussp.CJ09在低氮濃度培養(yǎng)條件下有利于油脂的積累，原因可能是由于氮是構(gòu)成蛋白質(zhì)和核酸的主要成分，而在氮限制的條件下，合成蛋白質(zhì)和核酸減少，而大量合成油脂，從而導(dǎo)致油脂含量升高[13]。有研究表明，氮限制有利于油脂的積累[14]，本研究的結(jié)果與其一致。由此可見，NaNO3質(zhì)量濃度為0.75 g/L最有利于微藻Ankistrodesmussp.CJ09生長和油脂積累。

2.2 K2HPO4對(duì)微藻Ankistrodesmus sp.CJ09生長和油脂積累的影響

微藻Ankistrodesmussp.CJ09在不同質(zhì)量濃度K2HPO4中的生長曲線見圖2。

由圖2可以看出，在最初7 d的培養(yǎng)過程中，各組生長差異較小，培養(yǎng)7 d后，K2HPO4質(zhì)量濃度分別為0.04 g/L(原培養(yǎng)基質(zhì)量濃度)和0.02 g/L的微藻Ankistrodesmussp.CJ09生長較快，K2HPO4質(zhì)量濃度分別為0.06、0.08、0.10 g/L時(shí)，微藻Ankistrodesmussp.CJ09生長較為緩慢，可能是由于磷濃度過高，使得氮磷比例失調(diào)，導(dǎo)致藻細(xì)胞生長繁殖受到磷的限制[15]。空白對(duì)照組在7 d后開始生長緩慢，可能是由于磷源不足，限制了微藻的繁殖生長。

圖2 微藻Ankistrodesmus sp.CJ09在不同質(zhì)量濃度K2HPO4中的生長曲線

培養(yǎng)15 d后，測定不同K2HPO4質(zhì)量濃度下微藻Ankistrodesmussp.CJ09生長及油脂積累情況，結(jié)果見表2。

表2 培養(yǎng)15 d后不同K2HPO4質(zhì)量濃度下微藻Ankistrodesmus sp.CJ09生長及油脂積累情況

由表2可以看出，培養(yǎng)15 d后，微藻Ankistrodesmussp.CJ09的生物量在K2HPO4質(zhì)量濃度為0.04 g/L時(shí)最高，為(2.14±0.11)g/L，與0.02、0.06、0.08 g/L組無顯著差異(p>0.05)，但顯著高于0.10 g/L組(p<0.05)。不同質(zhì)量濃度的K2HPO4對(duì)微藻Ankistrodesmussp.CJ09油脂含量和油脂產(chǎn)量影響顯著(p<0.05)。當(dāng)K2HPO4質(zhì)量濃度為0.02 g/L時(shí)，藻細(xì)胞內(nèi)油脂含量最高，為(28.91±0.42)%，與各組之間具有顯著性差異(p<0.05)。而空白對(duì)照組油脂含量最低，為(17.66±0.48)%。說明一定量的磷有利于油脂的積累。K2HPO4質(zhì)量濃度為0.02 g/L時(shí)，藻細(xì)胞油脂產(chǎn)量最高，為(0.61±0.009)g/L，可以得出，K2HPO4質(zhì)量濃度為0.02 g/L時(shí)，生物量與0.04 g/L組無顯著差異，但可以獲得最高的油脂含量和油脂產(chǎn)量。

磷對(duì)微藻油脂積累的影響因藻種而異，許多微藻在磷限制條件下可以大量積累油脂，如魯茲巴夫藻、角毛藻和三角褐指藻。但有部分微藻在磷限制條件下油脂含量減少，如微綠球藻和融合微藻[16]。本研究結(jié)果表明，降低K2HPO4質(zhì)量濃度可以促進(jìn)微藻Ankistrodesmussp.CJ09油脂的積累。微藻Ankistrodesmussp.CJ09生長和油脂積累最適的K2HPO4質(zhì)量濃度為0.02 g/L。

2.3 Na2CO3對(duì)微藻Ankistrodesmus sp.CJ09生長和油脂積累的影響

微藻Ankistrodesmussp.CJ09在不同質(zhì)量濃度的Na2CO3中的生長曲線見圖3。

圖3 微藻Ankistrodesmus sp.CJ09在不同質(zhì)量濃度的Na2CO3中的生長曲線

由圖3可知，在最初6 d的培養(yǎng)過程中，各組生長差異不明顯，培養(yǎng)6 d后，Na2CO3質(zhì)量濃度為0.08 g/L時(shí)，微藻Ankistrodesmussp.CJ09生長最快。超過此質(zhì)量濃度，微藻細(xì)胞的生長繁殖受到抑制，原因可能是Na2CO3質(zhì)量濃度過高，導(dǎo)致pH升高，使微藻生長緩慢[17]。

培養(yǎng)15 d后，測定不同Na2CO3質(zhì)量濃度下的微藻Ankistrodesmussp.CJ09生長及油脂積累情況，結(jié)果見表3。

表3 培養(yǎng)15 d后不同Na2CO3質(zhì)量濃度下微藻Ankistrodesmus sp.CJ09生長及油脂積累情況

由表3可以看出，培養(yǎng)15 d后，微藻Ankistrodesmussp.CJ09的生物量在Na2CO3質(zhì)量濃度為0.08 g/L后，達(dá)到最高，為(2.29±0.16)g/L。不同質(zhì)量濃度的Na2CO3對(duì)微藻油脂含量和油脂產(chǎn)量的影響顯著(p<0.05)，當(dāng)Na2CO3質(zhì)量濃度為0.10 g/L時(shí)，微藻油脂含量最高，為(30.31±0.76)%，Na2CO3質(zhì)量濃度為0.08 g/L時(shí)，藻細(xì)胞油脂產(chǎn)量最高，為(0.68±0.007)g/L。綜上，適量地添加碳源，能夠明顯促進(jìn)微藻Ankistrodesmussp.CJ09的生長和油脂積累，與李愛芬等[18]報(bào)道的添加適量無機(jī)碳能促進(jìn)藻類的生長和油脂積累結(jié)果一致。當(dāng)Na2CO3質(zhì)量濃度為0.08 g/L時(shí)，微藻Ankistrodesmussp.CJ09既能獲得較高的生物量，又可以獲得最高的油脂產(chǎn)量。由此可見，Na2CO3質(zhì)量濃度為0.08 g/L是微藻Ankistrodesmussp.CJ09生長和油脂積累的最佳質(zhì)量濃度。

2.4 CaCl2·2H2O對(duì)微藻Ankistrodesmus sp.CJ09生長和油脂積累的影響

微藻Ankistrodesmussp.CJ09在不同質(zhì)量濃度CaCl2·2H2O中的生長曲線見圖4。

圖4 微藻Ankistrodesmus sp.CJ09在不同質(zhì)量濃度CaCl2·2H2O中的生長曲線

由圖4可知，在培養(yǎng)過程中，隨著CaCl2·2H2O質(zhì)量濃度的增加，微藻Ankistrodesmussp.CJ09的生物量呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。

培養(yǎng)15 d后，不同CaCl2·2H2O質(zhì)量濃度下微藻Ankistrodesmussp.CJ09生長及油脂積累情況見表4。

表4 培養(yǎng)15 d后不同CaCl2·2H2O質(zhì)量濃度下微藻Ankistrodesmus sp.CJ09生長及油脂積累情況

由表4可知，培養(yǎng)15 d后，當(dāng)CaCl2·2H2O質(zhì)量濃度為0.018 g/L時(shí)，微藻Ankistrodesmussp.CJ09的生物量最高，為(2.53±0.18)g/L，是空白對(duì)照組的1.35倍，0.036 g/L組次之，兩者之間具有顯著性差異(p<0.05)，CaCl2·2H2O質(zhì)量濃度為0.072 g/L時(shí)，生物量最低，為(1.67±0.07)g/L，說明過高或過低的鈣濃度都不利于微藻Ankistrodesmussp.CJ09生長。不同質(zhì)量濃度的CaCl2·2H2O對(duì)油脂含量和油脂產(chǎn)量的影響顯著(p<0.05)，當(dāng)CaCl2·2H2O質(zhì)量濃度為0.018 g/L時(shí)，微藻Ankistrodesmussp.CJ09油脂含量和油脂產(chǎn)量最高，分別為(30.89±1.54)%和(0.78±0.039)g/L，顯著高于其他組(p<0.05)。CaCl2·2H2O質(zhì)量濃度為0.072 g/L，油脂含量和油脂產(chǎn)量最低，分別為(20.55±0.29)%和(0.34±0.005)g/L。因此，微藻Ankistrodesmussp.CJ09細(xì)胞生長和油脂積累的最佳CaCl2·2H2O質(zhì)量濃度為0.018 g/L。在鈣限制條件下，微藻Ankistrodesmussp.CJ09油脂含量增加，與文獻(xiàn)[19]報(bào)道的鈣限制有利于油脂積累的結(jié)果一致。有研究表明，鈣限制導(dǎo)致油脂升高的原因可能是在鈣限制的條件下，藻細(xì)胞生長緩慢，合成其他物質(zhì)減少，光合作用產(chǎn)物基本都用于合成油脂[20]。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以BG11為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，通過單因素實(shí)驗(yàn)，研究了培養(yǎng)基中不同質(zhì)量濃度的NaNO3、K2HPO4、Na2CO3和CaCl2·2H2O對(duì)微藻Ankistrodesmussp.CJ09生長和油脂積累的影響，確定了培養(yǎng)基中氮鹽(NaNO3)、磷酸鹽(K2HPO4)、碳酸鹽(Na2CO3)和鈣鹽(CaCl2·2H2O)的最佳質(zhì)量濃度分別為0.75、0.02、0.08 g/L和0.018 g/L。