段魏魏 申慧 魏冬梅

摘要：以標準菌株ATCC 26116為對照組，采用單因素試驗方法分別探討菌株LY04對溫度、pH值、鹽度的環(huán)境適應(yīng)性以及對碳源、氮源的營養(yǎng)適應(yīng)性。結(jié)果顯示，菌株LY04與對照株在10～30 ℃的溫度范圍、5～9的pH值范圍內(nèi)均可生長，但二者在相同環(huán)境條件下生長速率差異顯著，LY04較對照株對溫度、pH值的適應(yīng)性差，鹽度適應(yīng)性優(yōu)于對照株;二株菌對營養(yǎng)的要求差異顯著，在相同營養(yǎng)條件下，LY04菌株生長速率顯著快于對照株，試驗株對寡營養(yǎng)適應(yīng)性優(yōu)于對照株;NH+4-N在質(zhì)量濃度0.1%～0.3%范圍內(nèi)對二株菌生長均有促進作用，NO3-N對菌株LY04的生長有抑制作用，在0.1%質(zhì)量濃度下可以促進對照株的生長，其余濃度也表現(xiàn)出明顯的抑制作用。綜上，菌株LY04具有很好的環(huán)境適應(yīng)性和營養(yǎng)適應(yīng)性，這些適應(yīng)性都與新疆獨特的水域環(huán)境相適應(yīng)。

關(guān)鍵詞：水霉;病原菌;環(huán)境;營養(yǎng);適應(yīng)性

中圖分類號： S941.43+1 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）03-0190-04

水霉病是各種水產(chǎn)養(yǎng)殖中廣泛存在的一種寄生性疾病，是防治難度最大的魚類病害之一，每年給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失[1-2]。由于其特效防治藥物孔雀石綠的禁用，其危害更加普遍和嚴重[3-4]。目前，硫酸銅、臭氧、福爾馬林、重氫硫酸鹽等各種化學試劑及各種中草藥、微生物抗菌劑廣泛用于水霉病防治，但大多只起到預防作用[5-11]。在尋找水霉病防治的有效途徑時，了解其病原是必須的。研究認為，水霉病的病原常見的有水霉、綿霉和腐霉[12-13]，具有多樣性，對寄主無嚴格選擇性。

國內(nèi)外大量學者對水霉病病原菌生理特性的研究表明，其環(huán)境適應(yīng)范圍廣，5～32 ℃溫度范圍[14-16]、4～11的pH值范圍[17-18]、3.5%以內(nèi)的氯化鈉[14，19-21]含量條件下均可生長。新疆獨特的氣候特點使魚類在歷經(jīng)嚴冬后的初春易患水霉病，魚類水霉病的病情較我國其他地區(qū)更為嚴峻，而目前未見相關(guān)研究見諸于眾。本研究對新疆五家渠地區(qū)水霉病病原菌的環(huán)境適應(yīng)性進行探討，以期為了解病原進而找到合適的防治水霉病藥物提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種 菌種：LY04，從五家渠患水霉病鰱魚肌肉及體表分離獲得，根據(jù)形態(tài)學及生理學特征鑒定為水霉目、水霉科、水霉屬[22];標準菌株，多子水霉（saprolegnia fex）ATCC 26116，購自美國典型微生物菌種保藏中心（ATCC）。

1.1.2 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（pH值 7.0），用于水霉的培養(yǎng)及環(huán)境適應(yīng)性試驗;沙堡氏瓊脂培養(yǎng)基（葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，瓊脂15 g，純凈水1 000 mL，pH值5.6±0.2），用于營養(yǎng)適應(yīng)性試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 環(huán)境適應(yīng)性試驗方法

1.2.1.1 溫度對水霉菌生長的影響 用微生物平板打孔器在培養(yǎng)有水霉菌的PDA培養(yǎng)基上，輕輕打取長勢較旺的水霉菌菌落后重新接種在新的PDA培養(yǎng)基中央。然后分別置于10、15、20、25、30 ℃下恒溫培養(yǎng)72 h，用十字交叉法測量菌落直徑（mm），計算生長率（%）。每組重復3次，用GraphPad Prism 5軟件進行統(tǒng)計分析。

1.2.1.2 pH值對水霉菌生長的影響 配制PDA培養(yǎng)基，常規(guī)滅菌后，用3 mol/L HCl和3 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值分別為5、6、7、8、9。采用微生物平板打孔器在培養(yǎng)有水霉菌的PDA培養(yǎng)基上，輕輕打取長勢較旺的水霉菌菌落后重新接種在滅過菌的不同pH值的PDA培養(yǎng)基中央。然后置于25 ℃下恒溫培養(yǎng)72 h。用十字交叉法測量菌落直徑（mm），計算生長率（%）。每組重復3次。用GraphPad Prism軟件進行統(tǒng)計分析。

1.2.1.3 鹽度對水霉菌生長的影響 用微生物平板打孔器在培養(yǎng)有水霉菌PDA培養(yǎng)基上，輕輕打取長勢較旺的水霉菌菌落后，分別接種于含NaCl質(zhì)量分數(shù)為0.0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的PDA平板中央，然后置于25 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后，用十字交叉法測量菌落直徑（mm），計算生長率（%）。每組重復三次，用GraphPad Prism軟件進行統(tǒng)計分析。

1.2.2 營養(yǎng)條件適應(yīng)性試驗方法

1.2.2.1 葡萄糖對水霉菌株生長的影響 采用滅過菌的微生物平板打孔器在培養(yǎng)有水霉菌的PDA培養(yǎng)基上，輕輕打取長勢較旺較一致的水霉菌菌落后，接種在葡萄糖質(zhì)量濃度為0.0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的沙堡氏瓊脂培養(yǎng)基（去掉了葡萄糖組分）中央。然后置于25 ℃溫度條件下恒溫培養(yǎng)，分別觀察24、48、72 h的生長情況并用十字交叉法測量菌落直徑，每組3個平行。

1.2.2.2 蛋白胨對水霉菌株生長的影響 采用滅過菌的微生物平板打孔器在培養(yǎng)有水霉菌的PDA培養(yǎng)基上，輕輕打取長勢較旺較一致的水霉菌菌落后，接種在蛋白胨質(zhì)量濃度為0.0%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%的沙堡氏瓊脂培養(yǎng)基（去掉了蛋白胨組分）中央。然后置于25 ℃下恒溫培養(yǎng)，分別觀察24、48、72 h的生長情況并用十字交叉法測量菌落直徑，每組3個平行。

1.2.2.3 硫酸銨對水霉菌株生長的影響 采用滅過菌的微生物平板打孔器在培養(yǎng)有水霉菌的PDA培養(yǎng)基上，輕輕打取長勢較旺較一致的水霉菌菌落后，接種在含硫酸銨質(zhì)量濃度為0.0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的沙堡氏瓊脂培養(yǎng)基中央，后置于25 ℃下恒溫培養(yǎng)，分別觀察24、48、72 h的生長情況并用十字交叉法測量菌落直徑，每組3個平行。

1.2.2.4 硝酸鉀對水霉菌株生長的影響 采用滅過菌的微生物平板打孔器在培養(yǎng)有水霉菌的PDA培養(yǎng)基上，輕輕打取長勢較旺較一致的水霉菌菌落后，接種在含硝酸鉀質(zhì)量濃度為0.0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的沙堡氏瓊脂培養(yǎng)基中央。然后置于25 ℃下恒溫培養(yǎng)，分別觀察24、48、72 h的生長情況并用十字交叉法測量菌落直徑，每組3個平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 環(huán)境適應(yīng)性結(jié)果

2.1.1 溫度對水霉菌生長的影響 微生物的生長繁殖有其適宜的溫度范圍，培養(yǎng)溫度過高或過低，都會造成微生物生長緩慢，甚至導致微生物的死亡。溫度對2株水霉菌株生長的影響見圖1。由圖1可知，菌株LY04及標準菌在10～30 ℃范圍內(nèi)均可生長。菌株LY04在為25 ℃達到最大生長速率，標準菌株在20 ℃和25 ℃時生長最好且其生長速率在同溫度下高于菌株LY04。

2.1.2 pH值對水霉菌生長的影響 pH值對微生物的影響是多方面的，它不僅可以影響微生物對物質(zhì)的吸收能力，還可以影響酶的活性。過酸或過堿的環(huán)境會導致微生物生長緩慢甚至導致微生物死亡。pH值對2株水霉菌株生長的影響見圖2。由圖2可知，菌株LY04和標準菌在pH值5～9范圍內(nèi)均可生長，對于酸堿環(huán)境的適應(yīng)性較強，菌株LY04在pH值=7時生長最好，標準菌在pH值=6時生長最好。在相同pH值條件下，標準菌株的生長速率高于菌株LY04;但試驗菌株對酸堿變化更敏感。

2.1.3 鹽度對水霉菌生長的影響 海水中魚類水霉病的發(fā)生率很低，如受水霉菌感染的鱒魚，當回到海水時，水霉病癥狀逐漸消失，說明水霉病原菌對鹽度敏感。鹽濃度對2株水霉菌株生長的影響，由圖3可知，菌株LY04在NaCl質(zhì)量分數(shù)為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%時生長被促進，而在NaCl質(zhì)量分數(shù)為2.5%時生長被抑制，最適NaCl質(zhì)量分數(shù)為1.5%; 標準菌株在NaCl質(zhì)量分數(shù)為0.5%～2.0%范圍內(nèi)生長幾乎不受影響，當鹽度達2.5%時生長顯著被抑制。在相同鹽度條件下，試驗株的生長速率顯著高于對照株。

2.2 營養(yǎng)條件適應(yīng)性試驗結(jié)果

2.2.1 葡萄糖對水霉菌生長的影響 葡萄糖不僅為生物的生長提供細胞的碳架，還提供細胞生命活動所需要的能量。在微生物的培養(yǎng)基中一般都過量添加葡萄糖，但過量的葡萄糖對微生物的生長是有影響。葡萄糖對2株水霉菌株生長的影響見圖4。由圖4可知，在不添加葡萄糖時蛋白胨中的碳源就可使2個株菌生長，在有蛋白胨的培養(yǎng)基中只需添加少量葡萄糖即可使水霉菌生長旺盛（0.5%與對照相比 P<0.05）。在相同條件的同一葡萄糖濃度下，菌株LY04的生長較標準菌株旺盛。

2.2.2 蛋白胨對水霉菌生長的影響 氮是微生物必需的營養(yǎng)物質(zhì)之一，蛋白胨主要作為氮源用于微生物的培養(yǎng)。蛋白胨對2株水霉菌生長的影響見圖5。由圖5可知，2株菌在不添加蛋白胨時均不生長;菌株LY04在0.5%的蛋白胨下，生長速率顯著提高，0.8% 時達到飽和;標準菌在0.7%的蛋白胨下，生長速率顯著提高，0.8%時達到飽和。在相同條件的同一低濃度蛋白胨下，菌株LY04生長較標準菌旺盛。

2.2.3 硫酸銨對水霉菌生長的影響 眾多研究表明，真菌生長時對不同形態(tài)的氮鹽利用效率不同。NH+4-N以還原態(tài)形式存在，添加在培養(yǎng)基中主要增加還原態(tài)的氮。硫酸銨對2株水霉菌生長的影響見圖6。由圖6可知，0.1%～0.3%濃度范圍的硫酸銨對2株菌的生長起促進作用，硫酸銨濃度高于 0.5% 時開始抑制菌株生長，即2株菌在一定濃度范圍內(nèi)對銨態(tài)氮有偏好。相同條件同一濃度硫酸銨條件下，2株菌生長差異不明顯。

2.2.4 硝酸鉀對水霉菌生長的影響 硝態(tài)氮是氮元素的另外一種存在形式，為氧化態(tài)氮。在培養(yǎng)基中添加硝酸鉀，主要增加氧化態(tài)的氮。硝酸鉀對2株水霉菌生長的影響見圖7。由圖7可知，添加硝酸鉀菌株LY04的生長受到抑制;標準菌株僅在0.1%的硝酸鉀條件下生長稍有促進，增加濃度其生長被抑制菌。

3 討論

3.1 水霉病原菌的環(huán)境適應(yīng)性

試驗菌株LY04在10～30 ℃溫度范圍、5～9的pH值范圍內(nèi)均可生長，對溫度和pH值的適應(yīng)性較廣。與標準菌株相比，溫度、pH值對試驗菌株LY04影響更大，在相同的溫度、pH值條件下，試驗菌株的生長速率要慢于標準株，當溫度達到適溫時，試驗菌株生長迅速增快，這與魚類水霉病的發(fā)生有對應(yīng)關(guān)系，說明試驗菌株對新疆獨特的水域環(huán)境有高度的適應(yīng)性。在初春時節(jié)，魚類由于越冬時的凍傷易感水霉病，但病情發(fā)展緩慢，這與此時溫度較低，水霉菌生長緩慢相關(guān);初夏時節(jié)，在魚類繁殖期，水霉菌大量侵襲魚卵，造成水霉病暴發(fā)，此時池塘水溫恰與水霉菌最適生長溫度一致。在相同的外界條件下，菌株LY04對鹽度較標準菌有更好的忍耐性，生長速率均好于標準株，說明試驗菌株對鹽度也有更好的適應(yīng)性。新疆的氣候條件導致新疆水域環(huán)境較高的鹽堿度，從分離獲得的菌株來看，新疆水霉病原菌都具有良好的鹽堿抵抗力，因而在新疆魚類水霉病的防治難度更大。

3.2 水霉病原菌的營養(yǎng)適應(yīng)性

水域環(huán)境條件對于微生物生長來講應(yīng)該屬于貧營養(yǎng)，通過營養(yǎng)條件適應(yīng)性試驗發(fā)現(xiàn)，水霉病原菌對營養(yǎng)條件的要求確實較低，2株菌在不存在任何形式的糖時仍可生長;對氮源的要求也很低，低濃度的蛋白胨就可以使2株菌迅速生長，說明2株菌對貧營養(yǎng)的適應(yīng)性都較好，相對而言，試驗菌株LY04在相同營養(yǎng)條件下生長速率明顯高于標準菌株，說明試驗菌株在貧營養(yǎng)環(huán)境中更易生長。新疆水域由于鹽堿度較大，生物豐富度相對小，因此水域的營養(yǎng)條件相對貧瘠，試驗菌株對貧營養(yǎng)的耐受恰好與此吻合。

3.3 不同形式氮源的存在對水霉病原菌的影響

氮作為地球上存在最多的元素，可以氧化態(tài)、還原態(tài)、氧化-還原態(tài)多種形式存在。許多研究都表明，生物可以利用不同形式的氮源。對于水霉病病原菌而言，尚未見此方面的研究報道。本研究在添加了蛋白胨的培養(yǎng)基中分別添加硫酸銨、硝酸鉀，以便探討試驗菌株對不同形式的氮的利用情況。由結(jié)果可知，2株菌都表現(xiàn)出了對銨態(tài)氮的更好利用，硝態(tài)氮則表現(xiàn)出了抑制作用。水域環(huán)境由于溶解氧的限制，一般處于還原狀態(tài)，2株菌都能更好地利用還原態(tài)氮——銨態(tài)氮，也說明水霉病原菌對水環(huán)境的良好適應(yīng)性。

綜上所述，發(fā)現(xiàn)試驗菌株具有很好的環(huán)境適應(yīng)性和營養(yǎng)適應(yīng)性，這些適應(yīng)性都與新疆獨特的水域環(huán)境相適應(yīng);對照菌株也表現(xiàn)出了較強的適應(yīng)性，這也許是魚類水霉病廣泛發(fā)生的主要原因。

參考文獻：

[1]Tampieri M P，Galuppi R，Carelle M S，et al. Effect of selected essential oils and pure compounds on Saprolegnia parasitica[J]. Pharmaceutical Biology，2003，41（8）：584-591.

[2]孟思妤，孟長明，陳昌福. 魚類水霉病的發(fā)生原因與預防措施[J]. 漁業(yè)致富指南，2016（15）：60-61.

[3]王發(fā)榮. 水庫魚種水霉病綜合防治[J]. 農(nóng)業(yè)與技術(shù)，2017，37（14）：112.

[4]黎姍梅. 水產(chǎn)養(yǎng)殖中水霉病的防治[J]. 科學養(yǎng)魚，2017（2）：91.

[5]Forneris G，Bellardi S，Palmegiano G B，et al. The use of ozone in trout hatchery to reduce saprolegniasis incidence[J]. Aquaculture，2003，221（1/2/3/4）：157-166.

[6]Straus D L，F(xiàn)armer B D，Ledbetter C K，et al. Use of copper sulfate to control egg saprolegniasis at a commercial sunshine bass hatchery[J]. North American Journal of Aquaculture，2016，78（3）：243-250.

[7]Gieseker C M，Serfling S G，Reimschuessel R. Formalin treatment to reduce mortality associated with Saprolegnia parasitica in rainbow trout，Oncorhynchus mykiss[J]. Aquaculture，2006，253（1/2/3/4）：120-129.

[8]Ali E H. Morphological and biochemical alterations of oomycete fish pathogen Saprolegnia parasitica as affected by salinity，ascorbic acid and their synergistic action[J]. Mycopathologia，2005，159（2）：231-243.

[9]宋學宏，陳 葵，王永玲，等. EM及重氫硫酸鹽對黃顙魚卵孵化中水霉的抑制作用[J]. 淡水漁業(yè)，2007，37（1）：9-12，18.

[10]劉永濤，艾曉輝，楊秋紅，等. 15種中草藥超臨界CO2流體萃取物對2種水霉菌的抑制作用研究[J]. 淡水漁業(yè)，2015，45（3）：40-45.

[11]宋增福，范 斌，佘林榮，等. 一株具水霉抑制特性的芽孢桿菌篩選及其分子生物學鑒定[J]. 淡水漁業(yè)，2012（3）：28-31.

[12]Hсаева Н М，李永芳.魚類的霉菌病[J]. 國外水產(chǎn)，1993（3）：13-16.

[13]王立寶，劉文霞，左萬星，等. 松蘿酸對3種水霉病致病菌的抑菌作用[J]. 河北師范大學學報（自然科學版），2017，41（4）：354-357.

[14]Hatai K，Willoughby L G，Beakes G W. Some characteristics of saprolegnia obtained from fish hatcheries in Japan[J]. Mycological Research，1990，94（2）：182-190.

[15]Koeypudsa W，Phadee P，Tangtrongpiros J，et al. Influence of pH，temperature and sodium chloride concentration on growth rate of Saprolegnia sp.[J]. Journal of Scientific Research at Chulalongkorn University，2005，30（2）：123-130.

[16]甄 珍，王 荻，劉紅柏，等. 山女鱒水霉病病原的分離鑒定及其生物學特性[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學學報，2015，37（2）：333-338.

[17]熊 剛，尹思璐，梁永增，等. 河鱸水霉病病原菌的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學，2013，41（8）：3411-3413，3439.

[18]夏文偉，曹海鵬，王 浩，等. 彭澤鯽卵源致病性水霉的鑒定及其生物學特性[J]. 微生物學通報，2011，38（1）：57-62.

[19]楊偉杰，薛鵬偉，邵 偉，等. 大西洋鮭水霉病鹽浴治療初步研究，河北漁業(yè)2017（2），37-39

[20]Hussein M M A，Hatai K.Pathogenicity of Saprolegnia species associated with outbreak of salmonid saprolegniosis in Japan[J]. Fisheries Science，2002，68：1067-1072.

[21]張書俊，楊先樂，李 聃，等. 施氏鱘水霉病病原的初步研究[J]. 中國水產(chǎn)科學，2009，16（1）：89-96.

[22]熊 剛，黃奕童，王詠星. 新疆五家渠水霉病原菌多樣性的初步研究[C]//第九屆全國微生物學青年學者學術(shù)研討會論文集. 武漢，2012.