謝鑫榮 朱春璐 袁子民

【摘 要】 目的：通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究酒燉白芷的活性成分、作用靶點(diǎn)、相關(guān)信號通路和疾病的關(guān)聯(lián)性，揭示酒燉白芷藥效的作用機(jī)制。方法：選取酒燉白芷中27個(gè)活性成分，依據(jù)反向藥效團(tuán)匹配（PharmMapper）方法預(yù)測活性成分作用靶點(diǎn)，進(jìn)而構(gòu)建活性成分-作用靶點(diǎn)、疾病-作用靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)行GO富集和KEGG通路富集分析，研究酒燉白芷的作用機(jī)制。結(jié)果：根據(jù)疾病-作用靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)分析，涉及偏頭痛的關(guān)鍵靶點(diǎn)為ESR1、IL-2和NOS3;涉及鼻炎的關(guān)鍵靶點(diǎn)為EGFR和MAPK8;涉及癲癇的關(guān)鍵靶點(diǎn)為GSTA1、GSTP1和GSTM1。GO富集條目1316 個(gè)，其中生物過程相關(guān)的條目1172個(gè)，分子功能相關(guān)的條目48個(gè)，細(xì)胞組成相關(guān)的條目96個(gè)。KEGG 通路117條，主要涉及hsa04024、hsa04022、hsa04151、hsa04370、hsa04014等通路。結(jié)論：酒燉白芷的藥效作用機(jī)制體現(xiàn)了中藥多成分-多靶點(diǎn)-多通路的特點(diǎn)，本研究為酒燉白芷炮制機(jī)理、藥效作用的深入研究及都梁丸的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);酒燉白芷;偏頭痛;鼻炎;癲癇

【中圖分類號】R285.1 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2020）2-0025-06

Abstract：Objective To study the active ingredient， action target， related signal pathway and disease correlation of wine - processed products of Angelicae dahurica Radix and reveal the action mechanism of the effect of wine - processed Products of Angelicae dahurica Radix based on network pharmacology.Methods 27 active components of wine - processed products of Angelicae dahurica Radix were selected to predict the targets of action by reverse pharmacophore matching method， and then the active componenttarget and disease targetpathway network was constructed. GO enrichment and KEGG pathway enrichment analysis were carried out to study the action mechanism and processing mechanism of Angelica dahurica Radix.Results According to the analysis of disease-targetpathway network， the key targets involved in migraine are ESR1， IL-2 and NOS3， the key targets involved in rhinitis are EGFR and MAPK8 and the key targets involved in epilepsy are GSTA1， GSTP1 and GSTM1. There are 1316 GO enrichment entries， of which 1172 are related to biological processes， 48 are related to molecular function， and 96 are related to cell composition. There are 117 KEGG pathways， mainly involving hsa04024， hsa04022， hsa04151， hsa04370， hsa04014 and other pathways.Conclusion The pharmacodynamic mechanism of wine-processed products of Angelicae dahurica Radix reflects the characteristics of multi componentsmulti targetsmulti pathways of traditional Chinese medicine. This study provides a scientific basis for the further study of the processing mechanism， efficacy and he clinical application of Duliang pills provide scientific basis of Angelica dahurica with yellow rice wine stewing.

Keywords：Network pharmacology;Angelica dahurica with yellow rice wine stewing;Migraine;Rhinitis;Epilepsy

白芷藥用歷史悠久，具有解表散寒、祛風(fēng)止痛、宣通鼻竅等功效，其古代記載有酒浸、酒蒸、酒炒、醋制、鹽水炒等多種炮制方法，但現(xiàn)代很少應(yīng)用。酒燉白芷主要用于2015版《中國藥典》一部收載的成方制劑“都梁丸”中，制備方法為取白芷飲片，加入黃酒（每100kg白芷加入黃酒20kg），經(jīng)悶潤、隔水蒸制后干燥制得。酒燉白芷由于黃酒成分的引入及受熱炮制作用可使其化學(xué)成分及藥效作用與白芷存在差異，前期化學(xué)成分研究中發(fā)現(xiàn)酒燉白芷中含有與白芷基本相同的化學(xué)成分，只是含量有所差異[1-2]，但引入的黃酒的成分，由于技術(shù)限制尚需進(jìn)一步研究。目前，白芷在抗偏頭痛、治療鼻炎、抗癲癇等[3]藥理作用方面報(bào)道較多，但白芷經(jīng)黃酒炮制制成酒燉白芷后，是否對其藥效產(chǎn)生影響或具有增強(qiáng)藥效作用及都梁丸中為何采用酒燉白芷而不采用白芷入藥，還需結(jié)合藥效作用機(jī)制進(jìn)一步深入研究。因此，為增加酒燉白芷炮制品在抗偏頭痛、治療鼻炎、抗癲癇等疾病方面的應(yīng)用，筆者擬以黃酒與白芷中所含的主要化學(xué)成分作為酒燉白芷中可能含有的活性成分為篩選對象，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，著重探討酒燉白芷在抗偏頭痛、治療鼻炎、抗癲癇的藥效作用機(jī)制，并綜合分析活性成分靶點(diǎn)、相關(guān)生物信號通路與疾病的關(guān)聯(lián)性，為酒燉白芷炮制機(jī)理、藥效作用機(jī)制的深入研究及其在臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

ChembioDraw Ultra軟件（Version 13.0）、Cytoscape軟件（Version 3.6.1）、R軟件、UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org）、GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org）、DrugBank數(shù)據(jù)庫（https：//www.drugbank.ca）、NCBI數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）、String數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org）、TCMSP數(shù)據(jù)庫（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）、PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）、PharmMapper Serve數(shù)據(jù)庫（http：//59.78.96.61/pharmmapper）。

2 方法

2.1 酒燉白芷活性成分的篩選 酒燉白芷為白芷經(jīng)輔料黃酒炮制制得，其所含主要的化學(xué)成分可能主要源于白芷與黃酒中的成分。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取白芷的化學(xué)成分，以類藥性（DL）≥0.18和口服生物利用度（OB）≥30%為篩選條件，選取DL≥0.18和OB≥30%的化學(xué)成分作為白芷的潛在藥效成分。由于酒燉白芷經(jīng)輔料黃酒炮制，經(jīng)對黃酒的活性成分進(jìn)行文獻(xiàn)的挖掘與整理，同時(shí)列為酒燉白芷的活性成分。

2.2 作用靶點(diǎn)的獲取 采用ChembioDraw Ultra軟件繪制活性成分三維結(jié)構(gòu)圖，以SYBYL2（*.mol2）格式保存，并通過PubChem和TCMSP數(shù)據(jù)庫進(jìn)行結(jié)構(gòu)驗(yàn)證，將活性成分的SYBYL2（*.mol2）格式文件上傳到PharmMapper Serve數(shù)據(jù)庫中獲取靶點(diǎn)信息，再將該數(shù)據(jù)庫中Uniplot一欄上傳到UniProt數(shù)據(jù)庫中并將限定選為人，將靶點(diǎn)名稱校正為官方名稱。

2.3 疾病相關(guān)靶點(diǎn)的篩選 在GeneCards、DrugBank和NCBI數(shù)據(jù)庫中輸入migraine（cephalagra、hemicrania、antimigraine）、rhinitis（nasitis）和epilepsia（epilepsy、hieronosus）搜索文獻(xiàn)已報(bào)道的與偏頭痛、鼻炎和癲癇相關(guān)的基因，去除重復(fù)的和假陽性基因，與上述PharmMapper Serve數(shù)據(jù)庫獲得的靶點(diǎn)進(jìn)行對比分析，得到活性成分中的抗偏頭痛、鼻炎以及癲癇的潛在作用靶點(diǎn)。

2.4 通路富集與分析 將通用蛋白編號（Uniprot ID）導(dǎo)入R軟件中，對所有蛋白的編碼基因進(jìn)行GO注釋分析和KEGG通路分析，計(jì)算各通路P值并預(yù)測相關(guān)靶點(diǎn)蛋白參與表達(dá)的生物學(xué)通路（P<0.05），采用Cytoscape軟件構(gòu)建酒燉白芷的靶點(diǎn)通路網(wǎng)絡(luò)圖。

2.5 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將酒燉白芷的活性成分、作用靶點(diǎn)、相關(guān)疾病、通路導(dǎo)入Cytoscape軟件中，構(gòu)建活性成分-作用靶點(diǎn)、疾病-作用靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，以探究酒燉白芷在抗偏頭痛、鼻炎以及癲癇方面的藥效作用機(jī)制。

3 結(jié)果

3.1 酒燉白芷活性成分的篩選 從TCMSP數(shù)據(jù)庫中獲得223個(gè)白芷化學(xué)成分，以DL≥0.18和OB≥30%為篩選條件，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，共獲取17個(gè)活性成分。依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，結(jié)合黃酒中化學(xué)成分的性質(zhì)，選取含量高、無揮發(fā)性、耐熱性的10個(gè)成分作為黃酒的主要活性成分，將篩選出的白芷中的17個(gè)成分與黃酒中的10個(gè)成分，即共27個(gè)成分為酒燉白芷主要活性成分，結(jié)果見表1。

3.2 靶點(diǎn)預(yù)測 將表1中27個(gè)活性成分在PharmMapper Serve數(shù)據(jù)庫中返回的潛在作用靶點(diǎn)按匹配度（Fit）降序排列，各取前25個(gè)靶點(diǎn)，除去重復(fù)項(xiàng)后得到144個(gè)基因靶點(diǎn)，通過GeneCards、DrugBank和NCBI數(shù)據(jù)庫與相關(guān)基因進(jìn)行對比，篩選與抗偏頭痛、鼻炎和癲癇相關(guān)聯(lián)的可能潛在作用靶點(diǎn)，分別為60個(gè)、51個(gè)、17個(gè)，表2列舉Degree值排名前10的靶點(diǎn)蛋白。

3.3 活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建和分析 構(gòu)建的酒燉白芷活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖（圖1），圖中共有171個(gè)節(jié)點(diǎn)，678條線，紅色菱形節(jié)點(diǎn)代表酒燉白芷的活性成分（外圍是白芷的活性成分，內(nèi)環(huán)是黃酒的活性成分），綠色圓形節(jié)點(diǎn)代表作用靶點(diǎn)，灰色細(xì)線代表活性成分與作用靶點(diǎn)間相互關(guān)聯(lián)。表明酒燉白芷的藥效作用具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。

3.4 通路富集與分析 采用R軟件對酒燉白芷靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行KEGG通路富集，共富集134條，其中P值<0.05的有117條，部分通路信息（見圖2）。表明酒燉白芷主要通過環(huán)磷酸腺苷、環(huán)磷酸鳥苷-依賴性蛋白激酶、T細(xì)胞受體、Ras、MAPK、雌激素、PI3K/Akt、VEGF和Mtore等9條信號通路發(fā)揮抗偏頭痛、鼻炎、癲癇的藥效作用;GO注釋分析表明在生物過程中這些靶點(diǎn)主要涉及蛋白質(zhì)磷酸化、肽基酪氨酸磷酸化、肽基酪氨酸修飾;在分子功能中主要涉及蛋白酪氨酸激酶活性、激酶調(diào)節(jié)活性、RAS鳥苷酸交換因子活性、鳥苷酸交換因子活性等方面;在細(xì)胞組成中主要涉及膜質(zhì)側(cè)、膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)等方面，GO注釋分析信息見圖3。圖4為靶點(diǎn)-通路-疾病圖，其中紅點(diǎn)為疾病，藍(lán)點(diǎn)為通路，黃點(diǎn)為靶點(diǎn)。

4 討論

研究結(jié)果表明，酒燉白芷主要通過環(huán)磷酸腺苷（cAMP）、環(huán)磷酸鳥苷-依賴性蛋白激酶（cGMP-PKG）、MAPK信號通路發(fā)揮抗偏頭痛藥效作用。同時(shí)在調(diào)控MAPK信號通路發(fā)揮抗偏頭痛中，酒燉白芷共富集22個(gè)靶點(diǎn)，而生白芷為15個(gè);酒燉白芷主要通過調(diào)控環(huán)腺苷-磷酸、T細(xì)胞受體和Ras信號通路發(fā)揮抗偏頭痛作用，與生白芷相比，酒燉白芷在各個(gè)通路富集靶點(diǎn)多，并比生白芷多了雌激素、cGMP-PKG兩條信號通路。有研究表明NO被認(rèn)為是引起原發(fā)性偏頭痛的觸發(fā)物，可舒張平滑肌，擴(kuò)張腦內(nèi)血管，進(jìn)而增加痛覺的傳導(dǎo)，導(dǎo)致中樞敏化[4]。腦血管神經(jīng)末梢內(nèi)含有NOS，在NOS催化下，L-精氨酸產(chǎn)生NO，通過與G蛋白偶聯(lián)的膜受體結(jié)合激活可溶性鳥苷酸環(huán)化酶，從而使細(xì)胞內(nèi)鳥苷酸（cGMP）水平升高。NO并可誘導(dǎo)三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞合成和分泌CGRP，CGRP是目前最強(qiáng)血管擴(kuò)張藥物，對腦、心血管最為明顯。CGRP通過平行的信號通路，增加腺苷酸環(huán)化酶和環(huán)磷酸腺苷（cAMP）的產(chǎn)生[5]。對抗CGRP和NO信號的化合物、CGRP拮抗劑和NO合成酶抑制劑均可減輕偏頭痛。另外，MAPK是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，MAPK家族主要包括細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶 （ERK） 、c-Jun氨基末端激酶 （JNK） 和p38絲裂原活化蛋白激酶 （p38MAPK），分別介導(dǎo)3條并行的MAPK信號通路[6]。TNF-α和IL-6等炎性因子可通過上調(diào)p-ERK1/2、p-p38及p-JNK的表達(dá)，激活MAPK通路，進(jìn)而在細(xì)胞的增殖、凋亡、炎癥及免疫等多方面發(fā)揮關(guān)鍵的作用[7-9]。因此，推測酒燉白芷可能通過調(diào)控cAMP信號通路和cGMP-PKG信號通路，降低CGRP和NO的產(chǎn)生和分泌，并通過阻斷MAPK通路，減少炎癥因子的釋放，發(fā)揮抗偏頭痛的作用。

研究發(fā)現(xiàn)酒燉白芷抗鼻炎的作用可能與PI3K/Akt、VEGF通路有關(guān)，PI3K/Akt通路是VEGF誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞存活和遷移的重要信號分子，ERK通路也涉及細(xì)胞存活和遷移的調(diào)節(jié)[10]，P13K、Akt和ERK1/2的磷酸化水平與VEGR的產(chǎn)生具有一致的趨勢。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和MMP-9在促進(jìn)鼻黏膜組織腫脹與腺體分泌亢進(jìn)過程中發(fā)揮重要作用。VEGF可能是MMP-9高表達(dá)的誘導(dǎo)因素[11]，可促進(jìn)血管增生及通透性，參與鼻腔黏膜腫脹及腺體分泌亢進(jìn)過程。酒燉白芷可能通過抑制PI3K/Akt通路和ERK通路，可以顯著降低VEGF的產(chǎn)生，下調(diào)MMP-9的表達(dá)發(fā)揮抗鼻炎的作用。另外，酒燉白芷還可能通過調(diào)控P13K/AKt和ERK1/2信號通路發(fā)揮抗癲癇作用。在癲癇發(fā)生過程中，短期內(nèi)即可促使信號通路被激活表達(dá)p-ERK1/2，通過調(diào)節(jié)ERK1/2信號通路，可對癲癇發(fā)作產(chǎn)生拮抗作用[12];其中PI3K/AKt信號通路是調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞各項(xiàng)活動的重要通路之一，廣泛參與神經(jīng)元細(xì)胞的生存、分化、凋亡等過程，當(dāng)P13K/AKt通路被抑制時(shí)，可以有效抑制海馬神經(jīng)元凋亡[13]。mTOR為P13K/AKt途徑的下游絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，mTOR抑制劑可以有效預(yù)防癲癇發(fā)作[14]。在調(diào)控P13K/AKt信號通路發(fā)揮抗鼻炎和癲癇作用中，酒燉白芷共富集29個(gè)靶點(diǎn)，而生白芷為22個(gè)，且比白芷多1個(gè)治療鼻炎的VEGF信號通路。酒燉白芷在mTOR信號通路共富集10個(gè)靶點(diǎn)，而生白芷為7個(gè)。

在靶點(diǎn)預(yù)測分析中發(fā)現(xiàn)，酒燉白芷中ESR1、IL-2和NOS3等與偏頭痛相關(guān)的靶點(diǎn)度值、EGFR和MAPK8等與鼻炎相關(guān)的靶點(diǎn)度值、GSTP1、GSTA1和GSTM1等與癲癇相關(guān)的靶點(diǎn)度值，均高于生白芷中相關(guān)靶點(diǎn)度值。

綜上所述，白芷酒燉后與偏頭痛、鼻炎和癲癇相關(guān)的靶點(diǎn)、通路均多于白芷，且靶點(diǎn)度值增大，可能主要與黃酒成分的引入及水合氧化前胡素含量增加[2，15，16]等因素有關(guān)，其藥效作用機(jī)制體現(xiàn)了中藥多成分-多靶點(diǎn)-多通路的特點(diǎn)，為酒燉白芷“酒制升提”或“引藥上行”的炮制機(jī)制的深入研究提供了新思路。但其對藥效作用的改變或藥效作用的增強(qiáng)還需進(jìn)一步通過體內(nèi)藥效實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

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（收稿日期：2019-10-24 編輯：陶希睿）