高 源，彭丹冰，方 燦，范東生

（1. 貴州省食品檢驗(yàn)檢測所 貴陽 550004；2. 貴陽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 貴陽 550001）

心肌缺血是指心臟的血液灌注減少，導(dǎo)致心臟的供氧減少，心肌能量代謝不正常，不能支持心臟正常工作的一種病理狀態(tài)。心肌缺血引發(fā)的心肌梗死是患者死亡的重要原因。心肌缺血可致氧自由基大量增加，氧化應(yīng)激又可進(jìn)一步加重心肌缺血性損傷；而心肌梗死后的心室重塑及纖維化更是導(dǎo)致心功能下降的主要病理基礎(chǔ)。因此，尋找安全有效的防治心肌缺血損傷藥物具有重要意義[1]。

太子參為石竹科植物孩兒參Pseudostellariaheterophylla(Miq.)Pax ex Pax et Hoffm.的干燥塊根；甘、微苦，平；歸脾、肺經(jīng)；益氣健脾，生津潤肺。用于脾虛體倦，食欲不振，病后虛弱，氣陰不足，自汗口渴，肺燥干咳[2]。太子參始載于《本草從新》，又名孩兒參、童參、雙批七、四葉參、米參，是傳統(tǒng)中成藥復(fù)方太子參口服液等品種主要原料；廣泛用于太子參黃精膠囊等各類保健食品方面?，F(xiàn)代研究表明，太子參主要含有多糖類、皂苷類、環(huán)肽類、揮發(fā)油類等化學(xué)成分，文獻(xiàn)報(bào)道可知，這些成分具有：抗心肌缺血、提高免疫功能、抗氧化、抗癌、降血糖降脂等藥理作用[3-9]。

近年來，有關(guān)太子參抗心肌缺血的研究報(bào)道較多，如劉湘湘等，利用心肌缺血大鼠模型，以太子參多糖為給藥組，硝酸異山梨酯片作為對照組進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)太子參對心肌缺血大鼠模型有保護(hù)作用；孫弼等，利用缺血再灌注損傷模型大鼠，顯示太子參多糖能顯著減輕心肌缺血再灌注損傷模型大鼠的心肌組織損傷，并抑制心肌細(xì)胞凋亡；吳靈群等通過大鼠心肌缺血模型，以太子參水提物進(jìn)行灌胃，顯示其具有修復(fù)心梗大鼠促進(jìn)缺血心肌組織的功效，通過研究太子參水提物對COCl2 誘導(dǎo)缺氧EA.hy926 細(xì)胞的修復(fù)作用，提示太子參水提物針對EA.hy926細(xì)胞損傷具有細(xì)胞增殖、遷移及小管形成作用[10-12]。

太子參在中醫(yī)臨床中多采用復(fù)方形式進(jìn)行治療，如陳東等通過定心湯加太子參、合歡皮針對氣血兩虛型心臟神經(jīng)癥進(jìn)行臨床觀察，總有效率為77.5%，顯效人數(shù)為10人，占25%，采用定心湯合太子參、合歡皮治療心臟神經(jīng)癥，可以有效地緩解患者心悸、胸痛、氣短、乏力等癥狀的發(fā)作程度，發(fā)作頻率及持續(xù)時(shí)間，提高患者的生活質(zhì)量。在曹玉山教授辯治冠心病的臨床經(jīng)驗(yàn)一文中，作者采用自擬通冠湯為基礎(chǔ)方，采用黃芪、當(dāng)歸、太子參等8 味藥材用于臨床治療冠心病，取得很好的療效，并且文中也提到，曹玉山教授在臨床中遇到氣血兩虛的冠心病患者，也會用太子參代替黨參使用，可見太子參在臨床治療中確有療效[13,14]。

雖然目前已有眾多學(xué)者針對太子參抗心肌缺血進(jìn)行了全面研究，但從細(xì)胞及分子水平進(jìn)行系統(tǒng)全面的揭示太子參是通過何種途徑發(fā)揮抗心肌缺血的作用機(jī)制鮮見報(bào)道，亟待進(jìn)一步加強(qiáng)。傳統(tǒng)中醫(yī)藥研究，往往缺乏分子藥理表征，難以與現(xiàn)代科學(xué)有機(jī)的融合[15]；而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在系統(tǒng)藥理學(xué)基礎(chǔ)上建立，利用生物醫(yī)藥領(lǐng)域數(shù)據(jù)的迅速增加與計(jì)算能力與實(shí)驗(yàn)手段的快速進(jìn)步，通過觀察藥物的整體性、系統(tǒng)性、與中醫(yī)藥傳統(tǒng)理論的特點(diǎn)不謀而合，為中醫(yī)藥復(fù)雜系統(tǒng)的研究提供了新的視角和思路[16-18]。因此，本研究利用網(wǎng)絡(luò)生物信息數(shù)據(jù)庫，初步預(yù)測太子參活性成分抗心肌缺血的作用靶點(diǎn)及信號通路，為揭示太子參抗心肌缺血的作用機(jī)制和太子參的深入研究及開發(fā)利用提供參考依據(jù)，技術(shù)路線見圖1。

1 方法

圖1 太子參抗心肌缺血作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)路線圖

1.1 化學(xué)成分的建立

中醫(yī)藥綜合數(shù)據(jù)庫（Traditional Chinese Medicine Integrated Database，TCMID）和中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）檢索太子參的化學(xué)成分。

TCMID 數(shù)據(jù)庫收集了約 47000 個處方，8159 個中藥以及它們包含的25210 個主要成分，并且通過主要成分將它們與3791 個疾病，6828 個藥物和17521 個疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)起來。其中中藥相關(guān)的數(shù)據(jù)以及中藥與西藥關(guān)聯(lián)的數(shù)據(jù)主要來源于現(xiàn)存的數(shù)據(jù)庫，以及通過人工文本挖掘的方法從發(fā)表的文章及書籍中獲得；西藥相關(guān)數(shù)據(jù)主要來在PubMed、OMIM、DrugBank、Uniprot等數(shù)據(jù)庫。

TCMSP 包括中國藥典注冊的499 種中藥，含29384 種成分，3311 個靶標(biāo)和837 個相關(guān)疾病。該數(shù)據(jù)庫采用的是HIT 數(shù)據(jù)庫預(yù)測算法SysDT 來獲得藥物靶點(diǎn)之間的關(guān)系。該數(shù)據(jù)庫中的疾病信息來自TTD數(shù)據(jù)庫和PharmGKB 數(shù)據(jù)庫。這些信息可以在該數(shù)據(jù)庫中查詢和下載。該數(shù)據(jù)庫特別的價(jià)值在于，它為每種化合物提供了藥物藥代動力學(xué)信息，如成藥相似性（drug-likeness，DL）、口服生物利用度（oral bioavailability，OB）、血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）、腸上皮通透性（Caco-2）、脂水分配系數(shù)（ALogP）和 H 鍵供體/受體（Hdon/Hacc）的數(shù)量。因此，通過這2 個數(shù)據(jù)庫，用戶可以較為全面，準(zhǔn)確的搜索藥物化合物和作用靶點(diǎn)用于進(jìn)一步研究。

1.2 活性成分的篩選

將太子參查詢所得的化學(xué)成分，根據(jù)藥物動力學(xué)（ADME）參數(shù)（OB ≥ 30%和DL ≥ 0.18）設(shè)置，進(jìn)行活性化合物篩選。再通過PubChem 數(shù)據(jù)庫，查找活性化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)式。

1.3 藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)的建立

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫和SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫，查找太子參活性成分作用靶點(diǎn)，建立靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。通過人類基因和基因表型綜合數(shù)據(jù)庫（OMIM）、DrugBank 數(shù)據(jù)庫和TTD 數(shù)據(jù)庫查找對心肌缺血有治療預(yù)防作用的相關(guān)基因和蛋白靶點(diǎn)，建立抗心肌缺血的靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。

1.4 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

通過蛋白互作（protein protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)分析，將太子參活性成分與心肌缺血相關(guān)聯(lián)的靶點(diǎn)蛋白，通過Cytoscape 3.6.1 軟件構(gòu)建可視化的“活性成分-作用靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，并得到每個節(jié)點(diǎn)的Degree、Betweenness centrality、Closeness centrality 三個拓?fù)鋮?shù)，選擇以上3 個拓?fù)鋮?shù)值均大于所有點(diǎn)中位數(shù)值的靶點(diǎn)，作為太子參抗心肌缺血的潛在作用靶點(diǎn)。

1.5 生物過程分析

將篩選出的關(guān)鍵靶點(diǎn)使用生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫（Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery，DAVID）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行KEGG 通路分析和GO生物學(xué)過程分析。然后再利用STRING 對篩選出的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白互作關(guān)系分析。

1.6 構(gòu)建太子參心肌缺血作用的通路圖

利用KEGG 信號通路數(shù)據(jù)庫，將與心肌缺血最為密切的靶點(diǎn)在信號通路上標(biāo)注出來，驗(yàn)證太子參抗心肌缺血作用的主要信號通路。

2 結(jié)果

2.1 活性成分的篩選

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫和TCMID 數(shù)據(jù)庫，共查找得到太子參25 個化學(xué)成分，以ADME 參數(shù)（OB ≥30%和DL ≥0.18）為標(biāo)準(zhǔn)，共篩選得到8個活性化合物及結(jié)構(gòu)式，包括Supraene（角鯊烯）、Acacetin（刺槐素）、Linarin（蒙花苷）、Beta-sitosterol（β-谷甾醇）、Luteolin（木犀草素）、Taraxerol（蒲公英賽醇）、Schottenol（仙人掌甾醇）、1-Monolinolein（1-亞油酸甘油單酯），具體結(jié)果見表1。

2.2 藥物靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)的篩選

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫和SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫，剔除重復(fù)靶點(diǎn)后，共篩選得到858個太子參活性化學(xué)成分的作用靶點(diǎn)，結(jié)果見表1。通過疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫，查找得到418 個心肌缺血相關(guān)的靶點(diǎn)。通過PPI網(wǎng)絡(luò)分析，將靶點(diǎn)導(dǎo)入數(shù)據(jù)庫，篩選出54個交互蛋白，構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，可直觀的看出活性化學(xué)成分與疾病靶點(diǎn)之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，結(jié)果見圖2。其中，黃色方形與黃色圓點(diǎn)分別代表最重要的靶點(diǎn)蛋白和作用靶點(diǎn)；紅色三角形代表活性化學(xué)成分；藍(lán)色圓點(diǎn)為活性化學(xué)成分的作用靶點(diǎn)；紫色圓點(diǎn)代表連接活性化學(xué)成分與疾病靶點(diǎn)的交互蛋白。

2.3 太子參抗心肌缺血作用的靶點(diǎn)拓?fù)鋮?shù)分析

將太子參活性成分與心肌缺血相關(guān)聯(lián)的靶點(diǎn)蛋白，通過Cytoscape 3.6.1 構(gòu)建活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，并對這些靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行拓?fù)鋮?shù)計(jì)算。得到中位數(shù)均值為 Degree：4.0、Betweenness centrality：0.002 6、Closeness centrality：0.241 6。根據(jù)中位數(shù)值，篩選出12 個靶點(diǎn)，結(jié)果見表2。將12 個潛在靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行蛋白互作關(guān)系分析，結(jié)果見圖3。蛋白互作關(guān)系分析說明太子參抗心肌缺血的潛在靶點(diǎn)蛋白相互關(guān)聯(lián)且彼此調(diào)節(jié)。

2.4 GO生物學(xué)功能分析

將太子參心肌缺血疾病與活性成分匹配得到的12 個潛在靶點(diǎn)，映射到 DAVID 數(shù)據(jù)庫中，利用 GO 生物學(xué)功能富集分析，太子參抗心肌缺血所涉及的生物過程共富集得到116 條，其中P≤0.001 的生物過程共有25條，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，太子參抗心肌缺血與多個生物過程的調(diào)控相關(guān)，其中最為密切的生物過程包括內(nèi)皮細(xì)胞增殖的正調(diào)節(jié)、細(xì)胞對缺氧的反應(yīng)、細(xì)胞對血管內(nèi)皮生長因子刺激的反應(yīng)、一氧化氮生物合成過程的積極調(diào)節(jié)、肽基絲氨酸磷酸化的正調(diào)節(jié)、血管內(nèi)皮生長因子受體信號通路的正調(diào)節(jié)、血管生成的積極調(diào)節(jié)、血管生成、血管內(nèi)皮生長因子受體信號通路等。說明太子參抗心肌缺血可能主要是通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子而發(fā)揮治療作用。

2.5 KEGG通路分析

將太子參心肌缺血疾病與活性成分匹配得到的12 個潛在靶點(diǎn)，映射到DAVID 數(shù)據(jù)庫中，通過KEGG通路富集得到34 條信號通路，其中22 條信號通路（P≤0.01），結(jié)果見表4；其中與太子參抗心肌缺血作用機(jī)制密切相關(guān)的主要信號通路包括HIF-1 信號通路、PI3K-Akt信號通路、細(xì)胞凋亡、甲狀腺激素信號通路、肌萎縮側(cè)索硬化癥（amyotrophic laternal sclerosis，ALS）、mTOR 信號通路、Rap1 信號通路、VEGF 信號通路等。同時(shí)利用KEGG 信號通路數(shù)據(jù)庫中的KEGG Mapper 功能將12 個潛在靶點(diǎn)蛋白，在PI3K-Akt 信號通路上標(biāo)注出來，結(jié)果顯示有7 個靶點(diǎn)蛋白參與PI3K-Akt信號通路的相關(guān)調(diào)控，結(jié)果見圖4。

表1 太子參活性化合物及靶標(biāo)數(shù)

3 討論

太子參在我國具有悠久的歷史，同時(shí)也具有豐富的資源。目前，太子參被廣泛應(yīng)用于保健食品和藥品等方面；但由于太子參所含的化學(xué)成分的非常復(fù)雜，難以系統(tǒng)全面的揭示其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制，不利于太子參進(jìn)一步研究。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法進(jìn)行分析，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-疾病”關(guān)系，為中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制的研究提供了新的思路和方法，進(jìn)一步推動了中醫(yī)藥的快速發(fā)展。

圖2 太子參抗心肌缺血的“成分-靶點(diǎn)-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)

表2 太子參活性成分抗心肌缺血的潛在靶點(diǎn)相關(guān)拓?fù)鋮?shù)

圖3 太子參抗心肌缺血作用的靶點(diǎn)蛋白互作關(guān)系圖

表3 太子參抗心肌缺血的GO生物學(xué)功能富集分析結(jié)果

表4 太子參抗心肌缺血的KEGG通路富集分析結(jié)果

圖4 太子參活性成分潛在靶點(diǎn)在PI3K-Akt信號通路上的標(biāo)注圖

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，利用TCMSP、TCMID、TCMIP、BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫，篩選得到了8個太子參活性化學(xué)成分以及與太子參抗心肌缺血直接相關(guān)的12 個潛在作用靶點(diǎn)，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，戴宇翔等通過臨床收集冠狀動脈完全閉塞病變患者，觀察VEGFA、HIF-1α對心肌缺血影響，結(jié)果表明，慢性持續(xù)缺血、缺氧所導(dǎo)致的HIF-1α和VEGF 表達(dá)增加在促進(jìn)冠狀動脈側(cè)枝循環(huán)的建立、增加心肌血供給、改善預(yù)后、減少臨床心功能不全的發(fā)生率方面具有重要意義，張宏如等學(xué)者通過電針干預(yù)心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌組織，發(fā)現(xiàn)電針干預(yù)對心肌保護(hù)效應(yīng)，是通過提高Bcl-2 表達(dá)、降低Beclin1 表達(dá)以抑制再灌注期的過度自噬而實(shí)現(xiàn)的。叢濱海在博士論文中發(fā)現(xiàn)雌激素對SGK 表達(dá)的調(diào)節(jié)，并探討了雌激素、UCNs-CRHR2、SGK 之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)雌激素可以通過UCNs-CRHR2系統(tǒng)間接上調(diào)心肌細(xì)胞SGK 表達(dá)，這可能是雌激素在心肌缺血時(shí)增強(qiáng)心肌對缺血損傷抵抗力的一種重要分子機(jī)制[19-21]。利用GO 生物富集和KEGG 通路注釋分析功能，發(fā)現(xiàn)34 條信號通路及116個生物過程參與太子參的抗心肌缺血作用，其中與太子參抗心肌缺血作用機(jī)制密切相關(guān)的主要信號通路包括HIF-1 信號通路、PI3K-Akt 信號通路、細(xì)胞凋亡、甲狀腺激素信號通路、ALS、mTOR信號通路、Rap1信號通路、VEGF信號通路。韋皓等[22,23]學(xué)者通過研究HIF-1α抗心肌缺血作用機(jī)制，可能通過抑制TLR4/NF-κB信號通路抑制炎癥因子的釋放，降低機(jī)體炎癥因子水平，改善MIRI心肌損傷，葉楨干等學(xué)者[24-26]運(yùn)用PI3K-Akt信號通路，研究不同藥物抗心肌缺血再灌注損傷機(jī)制。獲得較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。刁思幃[27]等通過研究三氟淫羊藿素（ICTF）對大鼠心肌缺血再灌注損傷的治療作用，發(fā)現(xiàn)其機(jī)制可能與調(diào)控mTOR信號通路抑制細(xì)胞過度自噬有關(guān)。本文首次運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)挖掘和篩選，太子參的活性成分，并對其作用靶點(diǎn)與機(jī)制進(jìn)行初步的篩選與分析，以期為太子參的保健食用價(jià)值提供科學(xué)依據(jù)，也為太子參的深入研究及開發(fā)利用提供參考。