金佳熹，周冰玉，李柳蓉，馮青秀，柯春嬌，覃海音，農(nóng)雪娟，趙 爽

(右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000)

胃潰瘍(gastric ulcer，GU)是一種臨床常見(jiàn)的消化道疾病，患病率可達(dá)10%左右，主要癥狀為上腹疼痛、多表現(xiàn)為劍突下痛、呈隱痛、鈍痛、脹痛、燒灼痛，更是具有1%～3%的癌變率，臨床治療困難且患者個(gè)人十分痛苦[1]。“山藥”是薯蕷的塊莖，祖國(guó)四大懷藥之一，目前認(rèn)為山藥中的有效成分多糖是其主要活性成分并存在于山藥黏液質(zhì)中[2-5]。近年研究顯示，山藥可促進(jìn)細(xì)胞免疫和體液免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用，影響胃腸動(dòng)力學(xué)，還可抗衰老及降血糖等。本研究通過(guò)計(jì)算新鮮山藥提取物對(duì)胃潰瘍小鼠潰瘍指數(shù)、觀察黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)，及測(cè)量血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、一氧化氮(Nitric Oxide，NO)表達(dá)的變化，探究新鮮山藥提取物在防治胃潰瘍過(guò)程中的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

普通級(jí)KM小鼠100只，9周齡，右江民族醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心買進(jìn)[SCXK(桂)2017-0003]，小鼠體質(zhì)量25～30 g，雌雄各半。動(dòng)物飼養(yǎng)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)房，室溫22℃～24℃，相對(duì)濕度50%～70%，光線為12 h明暗循環(huán)。使用小鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。小鼠的血液取材等實(shí)驗(yàn)操作在右江民族醫(yī)學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)中心[SYXK(桂)2018-0006]。完成。本實(shí)驗(yàn)所涉及的所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均已經(jīng)右江民族醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(倫理審查證號(hào)2017050101)，嚴(yán)格執(zhí)行實(shí)驗(yàn)動(dòng)物安全等相關(guān)規(guī)定。嚴(yán)格遵守動(dòng)物使用的3R原則，實(shí)驗(yàn)整個(gè)過(guò)程均給予實(shí)驗(yàn)小鼠以人道主義關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

消炎痛(購(gòu)自Sigma公司)；新鮮山藥(購(gòu)自菜市)；施維舒膠囊(購(gòu)自蘇州衛(wèi)材制藥有限公司)；血清MDA(批號(hào)：20171019)、NO(批號(hào)：20171019)、SOD(批號(hào)：20180511)和GSH-Px(批號(hào)：20180511)活性檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自南京建成生物工程研究所)；其余生物與生化試劑分析純(購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；UV-1700紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(購(gòu)自上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 鮮山藥提取物制備

挑選粗細(xì)長(zhǎng)短相同、橫切面雪白色、外皮無(wú)損傷的新鮮瘦長(zhǎng)山藥為原料。將山藥洗凈、去皮并切成大小均等的小塊。用大功率食品打漿機(jī)打漿。實(shí)驗(yàn)高劑量組為鮮山藥勻漿加1/3倍體積雙蒸水，實(shí)驗(yàn)低劑量組為鮮山藥勻漿加3倍體積雙蒸水，相當(dāng)于高劑量組濃度為0.75 g/mL，低劑量組的濃度為0.25 g/mL。將配備好的山藥勻漿充分?jǐn)嚢栌糜诠辔浮?/p>

1.3.2 動(dòng)物分組和模型制備

全部實(shí)驗(yàn)用小鼠隨機(jī)分成5組：空白對(duì)照組、模型組、施維舒組、鮮山藥提取物高劑量組、鮮山藥提取物低劑量組，每組20只，雌雄各半。用消炎痛一次灌胃法，化學(xué)點(diǎn)燃小鼠急性胃潰瘍模型。空白對(duì)照組和模型組灌胃等體積生理鹽水，施維舒組灌胃濃度為2.0 mg/mL施維舒溶液，鮮山藥提取物高劑量組、低劑量組分別灌胃濃度為0.75 g/mL、0.25 g/mL鮮山藥提取物，灌胃量為10 mL/kg體重。每只每日灌胃1次，連續(xù)灌胃45 d。之后對(duì)除空白對(duì)照組外的其他4組用消炎痛(2.5 mg/mL)進(jìn)行一次性灌胃建立胃潰瘍模型，7 h后處死全部小鼠。取血檢測(cè)血清SOD、GSH-Px活性及NO、MDA蛋白表達(dá)。

1.3.3 胃潰瘍指數(shù)測(cè)定及潰瘍抑制率計(jì)算

解剖小鼠取胃組織，沿胃大彎全部剪開(kāi)，用生理鹽水漂洗胃組織內(nèi)部黏膜，之后將其平鋪濾紙上吸干水分，最后展平在固定板上用細(xì)針頭沿邊緣固定，觀察潰瘍的情況。采用Guth標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算潰瘍指數(shù)(潰瘍面積)：病變的最大徑<1 mm為1分；1～2 mm為2分；2～4 mm為3分；>4 mm為4分；若病灶寬于2 mm，其長(zhǎng)度乘以2。每只小鼠的潰瘍指數(shù)為此小鼠全胃出現(xiàn)總病灶之和的評(píng)分。胃潰瘍抑制率=[(模型組大鼠胃潰瘍指數(shù)-給藥組大鼠胃潰瘍指數(shù))/模型組大鼠胃潰瘍指數(shù)]×100%。

1.3.4 胃黏膜組織HE染色

于福爾馬林中固定完成后進(jìn)行石蠟包埋，對(duì)胃組織潰瘍面進(jìn)行組織病理切片，厚度4 μm，脫蠟，蘇木精-伊紅(HE)染色，在顯微鏡放大100倍視野下觀察其細(xì)胞和組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。它是現(xiàn)階段臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域一種重要的診斷方法，對(duì)疾病的后續(xù)治療方案構(gòu)建提供了重要依據(jù)，是疾病診斷金標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.5 檢測(cè)血清SOD、GSH-Px活性及NO、MDA蛋白表達(dá)

動(dòng)物處死后取小鼠血液靜置，4℃下以離心半徑13.5 cm、4000 r/min離心10 min，取上清液。檢測(cè)SOD含量(黃嘌呤氧化法)，檢測(cè)GSH-Px活性(硫代巴比妥酸法)，檢測(cè)NO、MDA含量(紫外分光光度法)，所有實(shí)驗(yàn)檢測(cè)步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

表1 各組胃潰瘍指數(shù)和潰瘍抑制率比較

注：與空白對(duì)照組比較，＊P<0.01；與模型組比較，#P<0.05；與施維舒陽(yáng)性組比，**P<0.05，下表同。

Note. Compared with the control group,＊P<0.01. Compared with the Model group,#P<0.05. Compared with the Selbex see teprenone group,**P<0.05. The same in the following tables.

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 測(cè)定胃潰瘍指數(shù)、計(jì)算潰瘍抑制率

空白對(duì)照組大鼠的胃黏膜肉眼觀察見(jiàn)表面光滑，淡粉色，有黏膜皺襞，無(wú)充血、出血現(xiàn)象。模型組小鼠胃腔黏膜表面有彌漫性水腫，內(nèi)表面出現(xiàn)咖啡樣物質(zhì)，經(jīng)生理鹽水緩慢沖洗后見(jiàn)廣泛分布的出血點(diǎn)及條索狀、點(diǎn)狀深褐色潰瘍，胃體胃潰瘍指數(shù)達(dá)到(5.73±1.83) mm2，胃潰瘍動(dòng)物模型點(diǎn)燃成功。如圖1～圖2。經(jīng)過(guò)施維舒陽(yáng)性藥物處理后可顯著減輕胃潰瘍，病變潰瘍指數(shù)僅為(1.27±0.38) mm2。新鮮山藥提取物預(yù)防給藥可使小鼠胃潰瘍面積降低(P<0.05)，其中高濃度山藥提取物組胃潰瘍抑制率接近陽(yáng)性藥施維舒組。結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 正常對(duì)照組胃黏膜內(nèi)壁Figure 1 Inner wall of the gastric mucosa in the normal control group

注：箭頭所示為潰瘍出血。圖2 潰瘍模型組胃黏膜內(nèi)壁Note. The arrow indicates ulcerative hemorrhaging.Figure 2 Inner wall of the gastric mucosa in the ulcer model group

2.2 胃黏膜組織HE染色

模型組胃黏膜組織炎細(xì)胞浸潤(rùn)及腺體破壞程度十分嚴(yán)重，而施維舒作為廣泛使用的抗胃潰瘍藥品其預(yù)防胃潰瘍作用效果顯著，經(jīng)施維舒預(yù)防給藥過(guò)的胃組織黏膜與正常對(duì)照組形態(tài)差異不大。長(zhǎng)期服用高濃度山藥的小鼠其胃組織黏膜炎細(xì)胞浸潤(rùn)及腺體破壞程度較輕，與施維舒治療組小鼠胃組織差異不大；山藥低濃度組對(duì)胃潰瘍的預(yù)防作用不是很明顯，其組織的炎細(xì)胞浸潤(rùn)及腺體破壞程度比較嚴(yán)重。結(jié)果見(jiàn)圖3。

2.3 血清MDA、SOD、NO、GSH-Px蛋白表達(dá)

整理結(jié)果后發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠血清中SOD、GSH-Px活性下降，MDA、NO含量增加，相應(yīng)的潰瘍指數(shù)也普遍增加，而新鮮山藥提取物組小鼠血清MDA、NO含量降低，SOD、GSH-Px活性升高(P<0.05)。長(zhǎng)期灌胃0.75 g/mL的高濃度山藥提取物可以顯著提高血清SOD的活性，鮮山藥提取物在0.25 g/mL的劑量下血清SOD活性也有升高，且顯示出了一定的量效關(guān)系。高劑量的鮮山藥提取物在預(yù)防和抑制消炎痛所致的小鼠急性胃潰瘍中具有一定作用。山藥高濃度給藥對(duì)小鼠胃潰瘍這一疾病的預(yù)防效果最佳，與施維舒藥物的效果相近，但是低濃度山藥的預(yù)防效果相比之下不顯著，有待進(jìn)一步深入研究。結(jié)果見(jiàn)表2～表5。

組別Groups用藥劑量(g/kg)DoseSOD(U/mL)空白對(duì)照組Control group—33.74±1.97模型組Model group—7.63±2.12*施維舒陽(yáng)性組Teprenone group0.0231.57±1.87#山藥高濃度組High dose of fresh yam extract7.521.67±2.22#**山藥低濃度組Low dose of fresh yam extract2.514.72±2.32#**

表3 新鮮山藥提取物對(duì)血清MDA表達(dá)的影響

表4 新鮮山藥提取物對(duì)血清GSH-Px活力的影響

表5 新鮮山藥提取物對(duì)血清NO含量的影響

3 討論

山藥主產(chǎn)于廣西、河北、河南等地，其性屬甘且溫和，具有多種生物活性，常食之可以強(qiáng)身健體、延緩衰老、補(bǔ)脾胃虧損[6-7]。目前研究顯示，山藥具有增加胃黏膜堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體[8]、血清表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)表達(dá)及降低血清胃泌素含量的作用[9]。

近年臨床研究表明氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)已成為急性胃潰瘍的重要誘導(dǎo)因素。從大量醫(yī)學(xué)報(bào)道我們得知消炎痛誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷不僅會(huì)破壞胃粘膜層、破壞為防御系統(tǒng)，嚴(yán)重的潰瘍甚至可能通過(guò)破壞氧化還原敏感的轉(zhuǎn)錄因子，從而加重機(jī)體炎癥反應(yīng)[10]。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，其藥物治療在一定程度上能夠控制癥狀，但同時(shí)服用藥物又可能引發(fā)肝腎等不良反應(yīng)，進(jìn)一步加劇胃的負(fù)擔(dān)，因此探究天然具有胃潰瘍保護(hù)作用的食物是一條較為適當(dāng)?shù)耐緩?，藥食同源的山藥就能夠提供人們?nèi)粘ｏ嬍撑c良好保健功效的需要。

本實(shí)驗(yàn)以2.5 mg/mL消炎痛一次灌胃建立急性小鼠胃潰瘍模型，最先觀察到模型組小鼠出現(xiàn)步履慌張、精神萎靡不振癥狀。同時(shí)測(cè)量其潰瘍抑制率顯著下降，導(dǎo)致部分組織出現(xiàn)氧化應(yīng)激現(xiàn)象[11-13]。SOD和GSH-Px為重要的抗氧化酶，胃組織氧化產(chǎn)生的過(guò)氧化物被SOD和GSH-Px還原后，被轉(zhuǎn)換為毒害較低或無(wú)害成分，從而利于胃潰瘍?cè)斐绅つp傷的恢復(fù)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，藥物新鮮山藥提取物可通過(guò)增強(qiáng)動(dòng)物體內(nèi)氧自由基清除酶SOD的活性[9,14-19]，降低氧自由基的含量，從而降低胃潰瘍損傷，促進(jìn)胃黏膜的愈合。GSH-Px是催化還原型谷胱甘肽(GSH)氧化的主要酶之一。能夠催化還原型谷胱甘肽與ROS反應(yīng)，后特異性生成氧化型谷胱甘肽GSSG，以此機(jī)制保護(hù)生物膜免受ROS的損害。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出，與模型組相比，山藥高劑量組GSH-Px含量增高(P<0.05)，說(shuō)明新鮮山藥提取物確實(shí)具有一定的胃潰瘍預(yù)防作用。

NO是具有多種生物學(xué)活性的自由基氣體分子。適度的NO可舒張血管，維持胃黏膜上皮完整性，增加胃黏膜血流量，且研究表明NO可保護(hù)胃黏膜細(xì)胞，降低損傷易感性[20-21]。然而疾病情況下所產(chǎn)生的大量NO可與氧自由基結(jié)合生成過(guò)氧化亞硝酸離子(ONOO-)，使細(xì)胞脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，引起炎性損傷[22]。MDA是氧化應(yīng)激的標(biāo)志物，胃組織發(fā)生損傷后會(huì)大量生成，使得氧化與抗氧化平衡體系被打破，局部氧化應(yīng)激加劇，可作為判斷胃潰瘍的指標(biāo)[23-24]，而新鮮山藥提取物可顯著抑制消炎痛處理所致的小鼠血清MDA含量增加(P<0.05)。

病理診斷是現(xiàn)階段臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域一種重要的診斷方法，對(duì)疾病的后續(xù)治療方案構(gòu)建提供了重要依據(jù)，是疾病診斷金標(biāo)準(zhǔn)[7]。在5組HE染色圖片的對(duì)比中，可見(jiàn)模型組胃組織炎細(xì)胞浸潤(rùn)及腺體破壞程度十分嚴(yán)重，而施維舒作為廣泛使用的抗胃潰瘍藥品其預(yù)防胃潰瘍作用效果顯著，經(jīng)預(yù)防給藥過(guò)的胃組織與正常組差異不明顯。長(zhǎng)期服用高濃度山藥的小鼠其胃組織炎細(xì)胞浸潤(rùn)及腺體破壞程度較輕，與施維舒治療組小鼠胃組織形態(tài)結(jié)構(gòu)差異不大，山藥低濃度組對(duì)胃潰瘍的預(yù)防作用效果不顯著，其組織的炎細(xì)胞浸潤(rùn)及腺體破壞程度比較嚴(yán)重。由此得出結(jié)論，山藥高濃度給藥對(duì)小鼠胃潰瘍這一疾病的預(yù)防效果最佳，與施維舒藥物的效果相近，但是低濃度山藥的預(yù)防效果相比之下不顯著，有待進(jìn)一步深入研究。鮮山藥提取物具有保護(hù)胃黏膜預(yù)防急性胃潰瘍的作用，其機(jī)制與降低MDA、NO因子表達(dá)，增加SOD、GSH-Px因子活力，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用有關(guān)。