朱睿，陳波，張清峰*

1(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌，330045)2(江西維萊營健高科有限公司，江西 吉安，331500)

竹子為禾本科竹亞科植物[1]，其種類繁多，生長周期短，資源豐富。中國在竹資源種類、分布、產(chǎn)量、季節(jié)適應(yīng)性均世界領(lǐng)先[2]。竹子在食品領(lǐng)域也被廣泛使用，如中國自古就有食用竹筍的習(xí)慣，竹葉黃酮是國家衛(wèi)計(jì)委批準(zhǔn)的新食品原料[3]。傳統(tǒng)竹瀝是將竹竿用火烤灼后流出的淡黃色液體，我國有悠久的飲用歷史，也是許多保健食品及夏季解暑飲料的原料。

中醫(yī)記載竹瀝有清熱化痰，開竅定驚等功效，可用于治療呼吸系統(tǒng)疾病。王芳等[4]研究發(fā)現(xiàn)竹瀝能有效促進(jìn)NO的分泌，減少煙熏所致慢性支氣管炎模型大鼠肺組織炎癥的介質(zhì)分泌，減輕炎癥損傷。羅懷浩等[5]發(fā)現(xiàn)竹瀝不同程度的提高了小鼠氣管酚紅分泌，延遲了咳嗽潛伏期，減少咳嗽次數(shù)。巨亞敏等[6]應(yīng)用市面上竹瀝膠囊治療急性咽喉炎，可更快緩解及明顯消除相關(guān)臨床癥狀。余亞平等[7]發(fā)現(xiàn)復(fù)方鮮竹瀝液與布地奈德和孟魯司特鈉聯(lián)合治療咳嗽性哮喘可降低血清IgE、TNF-α 和IL-8水平，改善一些肺功能指標(biāo)，減少復(fù)發(fā)率，安全性良好。目前研究認(rèn)為竹瀝中主要活性成分有愈創(chuàng)木酚、苯酚、紫丁香醇、去甲綿馬酚和5-叔丁基焦酚等[1, 8-10]。姚金龍等[9]還從鮮竹瀝乙酸乙酯萃取部分鑒定了丁香醛、松柏醛、香草酸、4-甲氧基肉桂酸等化合物。張規(guī)富等[11]鑒定了雷竹瀝中甲肼、乙酸、糠醛、5-羥甲基糠醛等成分。

傳統(tǒng)竹瀝通常以禾本科剛竹屬淡竹為原料制得。但禾本科剛竹屬毛竹較淡竹分布更廣，資源更豐富。但以毛竹為原料制備的竹瀝在化學(xué)成分上是否與淡竹竹瀝有顯著差異？此外，現(xiàn)代竹瀝工業(yè)生產(chǎn)通常將火烤灼改為干餾，但仍存在得率低、竹資源利用低下的特點(diǎn)。如能采用水煮方法將極大提高得率并簡化工藝，但這是否會(huì)導(dǎo)致竹瀝成分差異？針對(duì)這些問題，本研究以毛竹和淡竹為原料，分別經(jīng)干餾和水煮獲得竹瀝，通過UPLC-DAD-QTOF-MS進(jìn)行了成分分析；并對(duì)總酚、總黃酮、總氨基酸、對(duì)香豆酸等定量分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮毛竹、淡竹竹竿產(chǎn)自江西省永豐縣，由江西維萊營健高科有限公司提供。對(duì)香豆酸(≥98%)、蘆丁(≥98%)、L-谷氨酸(≥99%)、福林酚等購自北京索萊寶科技公司；Na2CO3、CH3COOK、Al(NO3)3、K2HPO4、KH2PO4、茚三酮、沒食子酸等購自天津市大茂化學(xué)試劑廠，所用試劑均為分析純。仁和?復(fù)方鮮竹瀝液，江西遠(yuǎn)東藥業(yè)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HPLC為Agilent 1260系統(tǒng)，配自動(dòng)進(jìn)樣器和DAD檢測器,美國安捷倫科技有限公司；V-5600可見分光光度計(jì),上海元析儀器有限公司；UPLC-DAD-QTOF-MS，質(zhì)譜部分為Q-TOF 5600+ (AB Sciex Corporation, Foster City, CA, USA)，UPLC部分為島津LC-30A-DAD系統(tǒng)(Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 干餾法制備竹瀝

將竹竿切成長寬約1～2 cm的碎塊，將500 mL圓底燒瓶裝滿后置于電熱套中。將整體倒置并固定，200oC烤制1 h，在瓶口流出的即為干餾竹瀝。

1.3.2 水提法制備竹瀝

將竹竿切成長寬約1～2 cm的碎塊后，用粉碎機(jī)粉碎。按料液比1∶10加入蒸餾水，沸水浴中加熱1 h，過濾后得水提竹瀝。

1.3.3 竹瀝HPLC分析條件

流動(dòng)相為乙腈(A)及0.1%醋酸水溶液(B)，線性梯度程序?yàn)?～15 min，10%～20% A；15～40 min，20%～40%A。流速1 mL/min，柱溫為40 ℃ ，進(jìn)樣量10 μL。對(duì)香豆酸在310 nm下的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=62.195X(R2=0.999)，X為對(duì)香豆酸質(zhì)量濃度(μg/mL)，Y為峰面積。

1.3.4 UPLC-Q-TOF-MS分析

UPLC使用色譜柱為Acquity BEH C18柱(2.1 mm×100 mm, 1.7 μm, Waters)。流速為0.3 mL/min，進(jìn)樣量為2 μL，柱溫為40oC。流動(dòng)相為乙腈(A)及0.1%甲酸水溶液(B)，線性梯度程序?yàn)?～15 min，10%～15%A；15～20 min，15%～30% A。質(zhì)譜系統(tǒng)為負(fù)離子模式，離子噴霧電壓為-4 500 V，溫度為500 ℃。數(shù)據(jù)分析軟件為Analyst 1.6。

1.3.5 竹瀝中總黃酮測定

參考國家標(biāo)準(zhǔn)[12]。配制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液(200 μg/mL)，吸取不同體積于25 mL容量瓶中，加95%乙醇至總體積為7.5 mL。依次加入100 g/L硝酸鋁溶液0.5 mL，9.8 g/L醋酸鉀溶液0.5 mL，定容搖勻，靜置1 h。以30%乙醇溶液為空白，在415 nm下測定吸光度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=1.23X(R2=0.999)，X為反應(yīng)體系中蘆丁質(zhì)量(mg)，Y為吸光度。

1.3.6 竹瀝中總多酚測定

參考何新益，劉清等[13-14]方法,配制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(158 μg/mL)4 ℃保存，準(zhǔn)確吸取不同體積于10 mL容量瓶中，依次加入福林試劑0.5 mL，15%的Na2CO3溶液1 mL，充分混合后定容，30oC避光放置1 h，以蒸餾水為空白，在760 nm波長測定吸光度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得Y=9.03X(R2=0.996)，X為沒食子酸在反應(yīng)體系中質(zhì)量(mg)，Y為吸光度。

1.3.7 竹瀝中總游離氨基酸測定

參考國家標(biāo)準(zhǔn)[15]。配制L-谷氨酸溶液(205 μg/mL)，準(zhǔn)確吸取不同體積于25 mL容量瓶，加入2%茚三酮1 mL，磷酸緩沖液(pH 8.0)1 mL，100oC水浴15 min后定容，靜置15 mL，570 nm測定吸光度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=2.72X-0.395 6(R2=0.998)。X為谷氨酸在反應(yīng)體系中質(zhì)量(mg)，Y為吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次，取其平均值，結(jié)果均用Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算、分析。曲線圖以O(shè)rigin 9.0進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 UPLC-DAD-QTOF-MS鑒定竹瀝中化學(xué)成分

圖1為不同方法制備的毛竹和淡竹竹瀝經(jīng)UPLC分離后，由DAD檢測器在280 nm波長下記錄的色譜圖。毛竹和淡竹竹瀝主要化學(xué)成分很相似，都含有1～4 號(hào)峰，但含量差異很大。峰2、3為淡竹竹瀝主要成分，峰1、3和4為毛竹竹瀝主要成分。峰3是兩者的共同的主要成分，但淡竹中峰面積要大于毛竹。峰2在淡竹中含量較高，而在毛竹中很低；而峰4在毛竹中含量較高，在淡竹中很低。水提和干餾法獲得的各竹瀝在成分上無顯著差異，但水提液中主要峰(峰2和3)的峰面積更大。圖2為通過DAD檢測器獲得的4個(gè)主要峰的UV圖譜。峰1、2和4的最大吸收峰均在280 nm左右；而峰3的最大吸收峰為310 nm左右。

A-淡竹(a)、毛竹(b)水提液;B-淡竹(a)、毛竹(b)干餾液

圖2 淡竹和毛竹瀝色譜圖中4個(gè)主要色譜峰UV光譜圖

通過QTOF-MS聯(lián)用，我們可以進(jìn)一步獲得各色譜峰的分子質(zhì)量和碎片離子情況，從而對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。表1為4個(gè)主要色譜峰的質(zhì)譜信息及鑒定結(jié)果。除峰2外，其余3個(gè)峰都得到鑒定，它們的二級(jí)質(zhì)譜圖和可能化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖3。峰3的分子離子([M-H]-)為m/z163，主要碎片為m/z119、117和93，經(jīng)與文獻(xiàn)比對(duì)鑒定為對(duì)香豆酸[16]。進(jìn)一步比較了峰3和對(duì)香豆酸對(duì)照品的HPLC保留時(shí)間和UV光譜，發(fā)現(xiàn)兩者完全一致。研究表明，對(duì)香豆酸具有較強(qiáng)的殺菌作用，可以破壞細(xì)菌細(xì)胞膜，結(jié)合細(xì)菌DNA；此外，還有抗氧化作用，能清除DPPH、ABTS等自由基及還原Fe3+[17-18]。峰4的分子離子([M-H]-)為m/z581，其碎片離子m/z419來源于[M-H]--162，說明其分子中含有已糖；此外，多個(gè)碎片間相差m/z15，說明其分子結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)甲基。經(jīng)與文獻(xiàn)比對(duì)，峰4鑒定為lyoniresinol-glucopyranoside，是一種木質(zhì)素糖苷[19]。因?yàn)楹枯^低，竹瀝中一些成分的色譜峰在DAD檢測器中可能會(huì)被掩蓋。通QTOF-MS，可以對(duì)特定的離子進(jìn)行提取。圖5為淡竹和毛竹竹瀝中綠原酸類化合物的離子提取色譜圖。m/z337.1，353.1，367.1，515.1分別為對(duì)香豆酰奎寧酸、咖啡?？鼘幩帷⑽乎？鼘幩岷投Х弱？鼘幩岬姆肿与x子([M-H]-)。以這些質(zhì)荷比為離子提取條件，并通過提取色譜峰的二級(jí)質(zhì)譜碎片進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)結(jié)構(gòu)?？鼘幩嵊?-OH、4-OH和5-OH可與對(duì)香豆酸、咖啡酸等形成?；?，因此會(huì)有多個(gè)異構(gòu)體。一些研究通過碎片峰形成及豐度情況來判定成酰位置。當(dāng)?；挥?-或5-時(shí)，[quinic acid-H]-(m/z191)碎片豐度最強(qiáng)；且當(dāng)位于3-時(shí)，[coumaroyl acid-H]-(m/z163)、[caffeic acid-H]-(m/z179)或[feruloyl acid-H]-(m/z193)的碎片豐度相對(duì)于5-更強(qiáng)。當(dāng)酰基位于4-時(shí)，[quinic acid-H2O-H]-(m/z173)豐度最強(qiáng)[20]。一些其他二級(jí)質(zhì)譜碎片來源，m/z134為 [feruloyl acid-CO2-CH3-H]-，m/z119為[coumaroyl acid-CO2-H]-，m/z135為[caffeic acid-CO2-H]￣。

根據(jù)圖5幾種綠原酸類化合物的離子提取色譜圖來看，毛竹瀝中綠原酸類含量及種類比淡竹瀝要豐富得多。在毛竹瀝中發(fā)現(xiàn)有9種綠原酸類物質(zhì)，并且以咖啡?？鼘幩岷枯^多；而淡竹瀝中幾乎沒有咖啡酰奎寧酸，阿魏?？鼘幩岷蛯?duì)香豆?？鼘幩岷恳诧@著低于毛竹。綠原酸類化合物作為植物中常見的次生代謝產(chǎn)物，具有多種顯著的生物活性，如抗氧化、抑菌、降血壓等[21-22]。

此外，通過QTOF-MS，我們還發(fā)現(xiàn)竹瀝中有蘋果酸、檸檬酸等有機(jī)酸，并鑒定了一些其他痕量成分，包括一些酚酸糖苷(如水楊酸、原兒茶酸等)和黃酮苷(主要為芹菜素)，詳細(xì)結(jié)果見表3。另外，值得一提的是，許多研究認(rèn)為愈創(chuàng)木酚是竹瀝的主要功效成分[1, 10]。但我們以愈創(chuàng)木酚的準(zhǔn)分子質(zhì)量([M-H]-，m/z123.1)為離子提取條件，提取色譜圖中并沒有明顯的色譜峰。說明愈創(chuàng)木酚在竹瀝中含量甚微，可能并不是竹瀝主要功效成分。

UPLC-DAD-QTOF-MS分析結(jié)果表明，毛竹和淡竹竹瀝成分非常相似；對(duì)香豆酸是2種竹瀝主要的酚酸成分，但含量差異較大。比較了水提和干餾法制備的竹瀝成分差異，表1和表3中的結(jié)果表明所有在干餾竹瀝中發(fā)現(xiàn)的化學(xué)成分在水提竹瀝中都可以檢出，說明2種制備方法不影響竹瀝主要成分。

表1 淡竹和毛竹瀝色譜圖中4個(gè)主要色譜峰的質(zhì)譜信息及鑒定結(jié)果

注：R1-淡竹水提液；R2-毛竹水提液；R3-淡竹干餾液；R4-毛竹干餾液。+表示有該成分(下同)

表2 淡竹和毛竹竹瀝中綠原酸類化合物的質(zhì)譜信息

2.2 毛竹和淡竹竹瀝中主要成分定量

根據(jù)QTOF-MS分析結(jié)果，對(duì)香豆酸是毛竹和淡竹竹瀝中主要酚酸成分。此化合物具有多種顯著生物活性，因此我們通過HPLC對(duì)其進(jìn)行了定量測定。同時(shí)，還測定了干餾和水提法獲得的2種竹瀝中總黃酮、總多酚和總游離氨基酸，詳細(xì)比較結(jié)果見表4。相對(duì)于原料重量，干餾法竹瀝的得率不足10%；而水提法得率與料液比有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)中料液比為1∶10，因此得率為1 000 %。定量分析結(jié)果表明，水提淡竹竹瀝中對(duì)香豆酸、總黃酮、總多酚和總游離氨基酸含量分別為28.2、8.2、162.6、92.7 μg/mL，這些值都高于干餾法獲得的淡竹竹瀝。比較不同方法獲得的毛竹竹瀝，除多酚外，其他成分也是水提竹瀝樣品中含量最高。此外，毛竹竹瀝的總多酚和總黃酮含量遠(yuǎn)高于淡竹竹瀝。

A-峰1;B-峰3;C-峰4

A-毛竹水提竹瀝:B-淡竹水提竹瀝

2.3 市售復(fù)方鮮竹瀝HPLC分析

復(fù)方鮮竹瀝是較受歡迎的中成藥，它以竹瀝為主要成分，常用于治療小兒咳嗽。圖5是對(duì)香豆酸標(biāo)準(zhǔn)品，毛竹、淡竹水提液和市售仁和?復(fù)方鮮竹瀝液的HPLC分析色譜圖。對(duì)香豆酸標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為16.3 min。在相同保留時(shí)間下毛竹、淡竹水提液和復(fù)方鮮竹瀝液均有對(duì)應(yīng)的色譜峰，其UV光譜圖也和對(duì)香豆酸標(biāo)準(zhǔn)品一致。說明市售復(fù)方鮮竹瀝中確實(shí)含有來自于竹瀝的對(duì)香豆酸。另外，復(fù)方鮮竹瀝原料中還有魚腥草、生半夏等，因此其色譜圖中還有很多其他成分峰。對(duì)香豆酸具有較強(qiáng)的殺菌和抗氧化作用，因此可能是竹瀝功效的重要物質(zhì)基礎(chǔ)；其含量也遠(yuǎn)高于常用于評(píng)價(jià)竹瀝質(zhì)量的愈創(chuàng)木酚。因此，我們認(rèn)為對(duì)香豆酸是竹瀝一個(gè)重要的質(zhì)量指標(biāo)。

表4 毛竹和淡竹竹瀝定量分析結(jié)果

表3 淡竹和毛竹竹瀝中鑒定的其他成分質(zhì)譜信息

圖5 對(duì)香豆酸標(biāo)準(zhǔn)品(a)，毛竹水提液(b)，淡竹水提液(c)和市售仁和?復(fù)方鮮竹瀝液(d)的HPLC分析色譜圖(280 nm)

3 結(jié)論

UPLC-DAD-QTOF-MS分析結(jié)果表明，毛竹和淡竹竹瀝成分差異不大。對(duì)香豆酸是兩者主要的酚酸成分，但淡竹中含量高于毛竹；毛竹瀝中木質(zhì)素糖苷Lyoniresinol-glucopyranoside含量高于淡竹。從痕量成分看，毛竹瀝中綠原酸類含量及種類較淡竹瀝豐富；此外，兩者還含有蘋果酸、檸檬酸、及酚酸糖苷和黃酮苷等15個(gè)共有成分。水提法制備竹瀝操作簡單，且得率遠(yuǎn)高于干餾法；并且產(chǎn)品中對(duì)香豆酸、總黃酮、總多酚和總游離氨基酸含量也更高。對(duì)香豆酸和綠原酸類物質(zhì)是抑菌、抗炎活性研究較多的植物次生代謝產(chǎn)物，與竹瀝傳統(tǒng)功效相吻合。在市售復(fù)方竹瀝中同樣發(fā)現(xiàn)了對(duì)香豆酸成分。基于實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為毛竹可以用于生產(chǎn)竹瀝，并且用對(duì)香豆酸比愈創(chuàng)木酚更適合作為竹瀝質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)。