蔡程山，王雨，白飛榮，翟磊，張?zhí)熨n，胡海蓉，姚粟

(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司， 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心，北京，100015)

黑曲霉(Aspergillusniger)屬于子囊菌門Ascomycota，曲霉科Aspergillaceae，曲霉屬Aspergillus中的一個(gè)常見種，廣泛分布于世界各地的糧食、植物性產(chǎn)品和土壤中。美國(guó)食品與藥品管理局于1987年將黑曲霉列為安全菌種[1]，已廣泛用于淀粉酶、酸性蛋白酶、纖維素酶、果膠酶、葡萄糖氧化酶、檸檬酸、葡糖酸和沒食子酸等的生產(chǎn)。近年，研究發(fā)現(xiàn)部分食品工業(yè)用黑曲霉菌株具有產(chǎn)伏馬菌素能力[2-3]，該毒素具有急性毒性和潛在致癌性，影響人類和動(dòng)物健康[4-8]。辨別產(chǎn)毒菌株和非產(chǎn)毒菌株對(duì)我國(guó)食品工業(yè)用黑曲霉菌株使用安全性十分重要[1]。利用全基因組測(cè)序(whole genome sequencing，WGS)的分型方法，能夠在全基因組堿基序列的基礎(chǔ)上進(jìn)行生物信息學(xué)分析，提高黑曲霉產(chǎn)毒菌株分辨能力。目前，由于黑曲霉細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)復(fù)雜、代謝產(chǎn)生大量黑色色素、胞內(nèi)多糖、生物酶等原因，存在全基因組DNA提取難度大、可參考的全基因組數(shù)據(jù)少、全基因組分析方法尚不成熟的問題[9-11]。獲得完整性好、純度高的基因組DNA[12-14]，是后續(xù)全基因組分析的前提，對(duì)黑曲霉產(chǎn)毒菌株分型辨別具有重要意義。

目前關(guān)于絲狀真菌全基因組DNA提取方法主要有CTAB法、試劑盒法和氯化芐法[15]，細(xì)胞壁破裂方法主要有石英砂研磨法和液氮研磨法。黑曲霉屬絲狀真菌，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)復(fù)雜堅(jiān)固，富含細(xì)胞壁多糖和幾丁質(zhì)，各種成分相互結(jié)合，使其具有一定強(qiáng)度[16]，在進(jìn)行全基因組DNA提取時(shí)很難將細(xì)胞壁破裂，而且細(xì)胞中存在大量多糖，使得DNA極少能溶出[17-21]，如果長(zhǎng)時(shí)間研磨會(huì)導(dǎo)致溶出的DNA斷裂，破壞DNA完整結(jié)構(gòu)[22]。黑曲霉中存在大量色素，使得全基因組DNA的提取更加困難[9-11]，常規(guī)DNA提取方法得到的DNA樣品通常A260/A280值>2.0，A260/A230值<2.0，樣品中有色素、RNA、糖類、鹽類或有機(jī)試劑的污染，雖可成功進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，但無基因組主帶，不滿足全基因組測(cè)序要求[23-24]。本文根據(jù)目前已有方法，針對(duì)黑曲霉菌株特性，優(yōu)化了黑曲霉全基因組DNA提取方法，為黑曲霉基因組的分析研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株

該研究所用黑曲霉(Aspergillusniger)菌株,來源于20個(gè)省市，從23種食品基質(zhì)中分離而來，目前保藏于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心，菌株編號(hào)為CICC 2286、CICC 2629、CICC 2693、CICC 40040、CICC 40043、CICC 40046、CICC 40068、CICC 40087、CICC 40128、CICC 40130、CICC 40132、CICC 40133、CICC 40137、CICC 40408、CICC 40615、CICC 40755、CICC 40845、CICC 40846、CICC 40847、CICC 40849、CICC 40863、CICC 41115、CICC 41116、CICC 41178、CICC 41194、CICC 41195、CICC 41215、CICC 41255、CICC 41256、CICC 41257、CICC 41258、CICC 41568、CICC 41576、CICC 41586、CICC 41594。

1.1.2 試劑及儀器

溴代十六烷基三甲胺(cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB)，Sigma公司；20 g/L RNA酶、20 g/L蛋白酶K，天根生化科技(北京)有限公司；Tris-飽和酚，Solarbio Sigma；氯仿，北京市通廣精細(xì)化工公司；異戊醇，西隴化工股份有限公司；異丙醇，北京化工廠；乙酸鈉，廣州化學(xué)試劑廠；DNA純化試劑盒，OMEGA；真菌DNA提取試劑盒，OMEGA；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

IPP 260恒溫培養(yǎng)箱，美墨爾特(上海)貿(mào)易有限公司；TProfessional PCR儀，北京世貿(mào)遠(yuǎn)東科學(xué)儀器有限公司；EC 250-90電泳儀，美國(guó)ThermoEC有限公司；Bead Ruptor 12生物樣品均質(zhì)器，奧然科技(北京)有限公司；核酸蛋白分析儀BioDrop， 豪沃生物科技(上海)有限公司；GelDoc EZ全自動(dòng)免染凝膠成像分析系統(tǒng)，美國(guó)伯樂Bio-ra有限公司；AC2-4S1生物安全柜，新加坡藝思高科技有限公司。

1.2 菌株的培養(yǎng)與收集

將PDA培養(yǎng)基傾倒在培養(yǎng)皿內(nèi)，待培養(yǎng)基冷卻凝固，在培養(yǎng)皿內(nèi)平整鋪放無菌玻璃紙，用無菌棉簽蘸取培養(yǎng)好的黑曲霉試管斜面中的孢子，均勻涂布整個(gè)培養(yǎng)皿，25 ℃倒置培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，用無菌接種環(huán)將玻璃紙上的菌絲體刮至新的培養(yǎng)皿內(nèi)待用。

1.3 黑曲霉培養(yǎng)條件確定

將培養(yǎng)平板分別25 ℃倒置培養(yǎng)1、2和3 d，觀察黑曲霉菌落生長(zhǎng)狀態(tài)、菌體生物量、產(chǎn)孢子情況，確定黑曲霉全基因組DNA提取的最佳培養(yǎng)時(shí)間。

1.4 菌絲體細(xì)胞壁處理方法

生物均質(zhì)器菌體破碎法：稱取200 mg菌絲體至含0.4 g的0.1 mm石英砂，0.4 g的1.5 mm鋯株，0.3 g 的3.0 mm鋯珠的無菌研磨管內(nèi)，加入200 μL 的CTAB裂解液，擰緊管蓋，放入生物樣品均質(zhì)器卡槽內(nèi)，破碎時(shí)長(zhǎng)2 min，顯微觀察破碎后的菌體樣品。液氮研磨法：將菌絲體加入無菌研缽中，倒入液氮，迅速研磨，在液氮蒸發(fā)凈前，再次加入液氮，繼續(xù)迅速研磨菌絲體至粉末狀。顯微觀察細(xì)胞壁破裂后的菌絲體樣品與生物樣品均質(zhì)器細(xì)胞壁破裂法的結(jié)果差異。

1.5 DNA提取方法

菌絲體液氮研磨后應(yīng)用真菌DNA提取試劑盒法、CTAB法和CTAB法結(jié)合試劑盒純化法，分別提取4株黑曲霉CICC 40137、CICC 40130、CICC 40132和CICC 41115全基因組DNA，對(duì)比不同方法所提全基因組DNA差異，篩選出適用于全基因組測(cè)序的黑曲霉DNA提取方法。

1.5.1 菌絲體液氮研磨后應(yīng)用真菌DNA提取試劑盒法(方法一)

將菌絲體加入無菌研缽中，倒入液氮，迅速研磨，在液氮蒸發(fā)凈前，再次加入液氮，繼續(xù)迅速研磨菌絲體至粉末狀，稱取液氮研磨好的菌絲體粉末200 mg裝入1.5 mL離心管中，后續(xù)步驟按照真菌DNA提取試劑盒說明書準(zhǔn)確提取。

1.5.2 菌絲體液氮研磨后應(yīng)用CTAB法(方法二)

菌絲體研磨方法同1.5.1，稱取200 mg液氮研磨好的菌絲體粉末至1.5 mL離心管中，加入600 μL的CTAB裂解液，65 ℃水浴45 min，13 000 r/min離心10 min；取上清于一新離心管中，加等體積的V(酚)∶V(氯仿)∶V(異戊醇)=25∶24∶1，12 000 r/min離心10 min；取上清，加等體積的V(氯仿)∶V(異戊醇)=24∶1，12 000 r/min離心10 min；取上清，加等體積的異丙醇試劑，-20 ℃沉淀30 min，12 000 r/min離心20 min；收集沉淀，75%酒精沖洗，超凈臺(tái)真空干燥；100 μL TE溶解DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆肹25-26]。

1.5.3 菌絲體液氮研磨后應(yīng)用CTAB法提取結(jié)合試劑盒純化法(方法三)

菌絲體研磨方法同1.5.1，稱取200 mg液氮研磨好的菌絲體粉末至1.5 mL離心管中，加入600 μL的CTAB裂解液和少量的聚乙烯吡咯烷酮(polyvingl pyrroliddone,PVP)，65 ℃水浴45 min，13 000 r/min離心10 min；取上清于一新離心管中，加等體積的V(酚)∶V(氯仿)∶V(異戊醇)=25∶24∶1，12 000 r/min離心10 min；取上清，加等體積的V(氯仿)∶V(異戊醇)=24∶1，12 000 r/min離心10 min；取上清，加 0.7倍體積的異丙醇，0.1倍體積的3 mol/L NaAc，-20 ℃沉淀30 min，12 000 r/min離心20 min；收集沉淀，75%酒精沖洗，超凈臺(tái)真空干燥；100 μL TE 溶解DNA，加入1 μL的RNA酶，37 ℃水浴 1 h；加入400 μLV(氯仿)∶V(異戊醇)=24∶1，12 000 r/min離心10 min，重復(fù)2次。采用OMEGA公司cycle-pure DNA純化試劑盒進(jìn)行純化，得到高純度基因組DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 DNA樣品濃度測(cè)定

使用BioDrop測(cè)定DNA樣本濃度，根據(jù)A260/A280和A260/A230值判斷DNA純度[27]。

1.7 DNA樣品凝膠成像檢測(cè)

吸取5 μL基因組DNA樣品與6×Loading Buffer混合后，點(diǎn)樣于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%的瓊脂糖凝膠中，染色劑為GoldView，在電泳緩沖液為 1×TAE，電壓為 110 V 的條件下電泳25 min，之后在凝膠成像儀上觀察DNA片段的大小、完整性及電泳條帶的清晰度，進(jìn)行拍照。

1.8 全基因組DNA提取方法應(yīng)用

將31株黑曲霉菌株分別用無菌棉簽蘸取培養(yǎng)好的黑曲霉試管斜面中的孢子，接種在鋪有玻璃紙的PDA培養(yǎng)皿內(nèi)，涂抹整個(gè)培養(yǎng)皿，25 ℃倒置培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，用無菌接種環(huán)將玻璃紙上的菌體刮至研缽內(nèi)液氮研磨，應(yīng)用CTAB法提取并結(jié)合試劑盒純化法提取全基因組，對(duì)該方法進(jìn)行應(yīng)用驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑曲霉培養(yǎng)條件確定

黑曲霉培養(yǎng)1 d菌落為灰白色，菌體量少(圖1-a)；培養(yǎng)2 d菌落為白色，菌落覆蓋整個(gè)平板，產(chǎn)孢量少(圖1-b)；黑曲霉培養(yǎng)至第3天，菌落產(chǎn)生大量黑色孢子，菌體老化，細(xì)胞壁堅(jiān)固，收集的菌絲體含有孢子，DNA提取過程中會(huì)溶出大量黑色素，影響DNA樣品的提取(圖1-c)，因此選用收集培養(yǎng)2 d的黑曲霉菌絲體作為全基因組DNA提取最佳時(shí)間。

a-培養(yǎng)1 d;b-培養(yǎng)2 d;c-培養(yǎng)3 d

2.2 菌絲體細(xì)胞壁處理方法確定

將收集的菌體采用生物均質(zhì)器研磨法和液氮研磨法進(jìn)行顯微對(duì)比，兩種不同細(xì)胞破裂方法對(duì)菌體破碎情況明顯不同。圖2-a為研磨前菌體狀態(tài)，菌絲體結(jié)構(gòu)完整；圖2-b為生物均質(zhì)器研磨法結(jié)果顯微照片，大部分菌體細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，但破碎結(jié)果不均勻，仍有部分菌體結(jié)構(gòu)未破碎；圖2-c為液氮研磨結(jié)果顯微照片，菌絲體破碎充分、均勻，未觀察到完整菌體結(jié)構(gòu)。與研磨前相比，兩種破壁方法雖然都有一定程度的破壞，但菌體破碎結(jié)果存在明顯差異，液氮研磨法研磨更充分均勻，因此選用為黑曲霉全基因組提取細(xì)胞壁處理方法。

a-研磨前菌體形態(tài);b-生物均質(zhì)器破壁結(jié)果;c-液氮研磨破壁結(jié)果

2.3 DNA樣品濃度檢測(cè)

采用BioDrop對(duì)3種方法的樣品基因組DNA進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表1所示。方法一為液氮研磨后應(yīng)用真菌DNA提取試劑盒法測(cè)定結(jié)果，CICC 40137、CICC 40130、CICC 40132和CICC 41115四株菌DNA濃度分別為109.6、89.35、321.76和234.51 ng/μL，菌株CICC 40130、CICC 40132和CICC 41115的A260/A280值在1.8～2.0，A260/A230值均>2,證明DNA純度較高。但CICC 40137菌株A260/A280值為2.132>2.0,證明RNA含量較高；方法二為菌絲體液氮研磨后應(yīng)用CTAB法測(cè)定結(jié)果，CICC 40137、CICC 40130、CICC 40132和CICC 41115四株菌DNA濃度分別為351.59、310.75、362.43和290.73 ng/μL，但4株菌A260/A280值均>2.0，證明DNA樣品中有RNA殘留，A260/A230值均<2.0，說明樣品DNA中含有較多的糖類、鹽類或有機(jī)試劑的污染；方法三為菌絲體液氮研磨后應(yīng)用CTAB法提取結(jié)合試劑盒純化法測(cè)定結(jié)果，CICC 40137、CICC 40130、CICC 40132和CICC 41115四株菌DNA濃度分別為125.72、88.67、97.71和85.43 ng/μL，A260/A280值均在1.8～2.0，A260/A230值均>2.0，說明本方法提取到的基因組DNA樣品蛋白質(zhì)和RNA含量很低，純度濃度均較好，吸光增色反應(yīng)明顯，在260 nm處吸光度最高，證明基因組純度很高，優(yōu)于方法一和方法二所提DNA樣品。

2.4 電泳檢測(cè)

分別對(duì)3種方法所得到的基因組DNA 進(jìn)行電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。圖3-a為方法一提取的DNA樣品電泳結(jié)果，由圖可知未見到完整DNA主條帶，DNA長(zhǎng)度均<5 000 bp。圖3-b是應(yīng)用方法二提取的DNA樣品電泳結(jié)果，泳道上有黑色陰影，未顯示完整基因組DNA主帶，多為小分子片段，<5 000 bp；圖3-c為方法三所提DNA樣品電泳結(jié)果，CICC 40137、CICC 40130、CICC 40132和CICC 41115四株菌都有DNA主條帶，加樣孔附近滯留的物質(zhì)也很少，基因組大小約為23 kb。方法一和方法二DNA鏈狀結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，雖能滿足PCR擴(kuò)增，但未見到全基因組DNA條帶。

表1 基因組DNA濃度檢測(cè)

1、6-DL8000 Marker；2、7、11-CICC 40137；3、8、12-CICC 40130；4、9、13-CICC 40132；5、10和14-CICC 41115；15-λDNA/Hind Ⅲ Markera-方法一;b-方法二;c-方法三

2.5 全基因組DNA提取方法應(yīng)用

如圖4所示，菌絲體液氮研磨后應(yīng)用CTAB法提取，結(jié)合試劑盒純化法，對(duì)31株不同分離源黑曲霉菌株進(jìn)行方法驗(yàn)證結(jié)果，7泳道全基因組DNA條帶相對(duì)較弱，推測(cè)由于液氮研磨步驟研磨不充分，DNA溶出量少。8、11和13泳道的最前端出現(xiàn)明亮條帶，RNA酶與樣品中RNA反應(yīng)不徹底，導(dǎo)致樣品中含有RNA。但31株黑曲霉DNA樣品均有23 kb大小的完整全基因組DNA主條帶。對(duì)該DNA樣品進(jìn)行濃度測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，濃度為52.24～212.37 ng/μL。全基因組測(cè)序要求DNA濃度>12.5 ng/ μL，DNA總量均在2 μg以上，31株黑曲霉DNA樣品滿足全基因組測(cè)序工作，證明該方法適用于黑曲霉全基因組DNA的提取。

3 結(jié)論

本研究通過對(duì)3種常見真菌基因組DNA提取方法比較分析，確定了一種高質(zhì)量黑曲霉全因組提取方法，具體為菌絲體經(jīng)液氮研磨后，采用CTAB法提取并結(jié)合試劑盒純化。該方法提取的基因組DNA條帶完整、純度高，可以滿足WGS要求，方法優(yōu)點(diǎn)為：(1)確定了黑曲霉實(shí)驗(yàn)菌株的培養(yǎng)條件和細(xì)胞壁破裂方法。因?yàn)楹谇怪饕煞譃閹锥≠|(zhì)，與細(xì)菌或者酵母相比其結(jié)構(gòu)更加堅(jiān)固。但是絲狀真菌培養(yǎng)過程中，細(xì)胞壁堅(jiān)固程度是發(fā)生變化的，菌絲體在幼嫩時(shí)期細(xì)胞壁相對(duì)薄弱一些，老熟之后堅(jiān)固，培養(yǎng)2 d的黑曲霉菌絲體提取全基因組DNA時(shí)間最佳[28]。液氮研磨相比生物樣品均質(zhì)器破碎相比，細(xì)胞壁更加充分，確保DNA釋放。(2)CTAB裂解液中加入PVP、RNA酶和蛋白酶K。PVP可以去除多糖、酚類、醌類等物質(zhì)[23,29-31]，RNA酶去除RNA，蛋白酶K有效除去蛋白。(3)結(jié)合cycle-pure DNA純化試劑盒進(jìn)行純化。黑曲霉菌絲體中富含色素、多糖、蛋白質(zhì)[32]，傳統(tǒng)CTAB 提取方法盡管對(duì)DNA產(chǎn)物進(jìn)行洗滌除雜，但是色素物質(zhì)殘留較多，在進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)時(shí)，影響了DNA與染料的結(jié)合，因此看不到基因組完整條帶。應(yīng)用試劑盒純化后雖然基因組DNA有一定損失，但是多糖、色素等雜質(zhì)可充分除去，避免影響GoldView與基因組結(jié)合顯色，由電泳結(jié)果可知提升了DNA的純度，有清晰可見的陽(yáng)性條帶。

1、16、34-λDNA/Hind Ⅲ Marker；2～15菌株編號(hào)分別為CICC 40087、CICC 40863、CICC 40046、CICC 40849、CICC 41586、CICC 40133、CICC 40845、CICC 40128、CICC 40040、CICC 40847、CICC 2286、CICC 41178、CICC 41594、CICC 40068；17～33菌株編號(hào)分別為CICC 2693、CICC 40043、CICC 40408、CICC 40615、CICC 40755、CICC 40846、CICC 41116、CICC 41194、CICC 41195、CICC 41215、CICC 41255、CICC 41256、CICC 41257、CICC 41258、CICC 41568、CICC 41576、CICC 2629

表2 不同分離源31株黑曲霉基因組DNA濃度

本研究確定黑曲霉全基因組DNA提取方法，可滿足WGS工作要求，為黑曲霉基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建、菌株溯源、產(chǎn)毒基因分析奠定基礎(chǔ)，有助于產(chǎn)毒菌株和非產(chǎn)毒菌株快速準(zhǔn)確辨別，對(duì)我國(guó)食品工業(yè)用黑曲霉菌株的使用安全性有重要意義。該法可作為實(shí)驗(yàn)室提取黑曲霉高質(zhì)量基因組DNA的方法推廣使用。