張佩，陳默，胡國元

(武漢工程大學(xué) 環(huán)境生態(tài)與生物工程學(xué)院，綠色化工過程教育部重點實驗室，湖北 武漢，430205)

羧甲基茯苓多糖(carboxymethylpachyman，CMP)是一種將茯苓聚糖的多糖鏈進(jìn)行羧甲基化修飾后得到的具有抗氧化[1-2]、抗腫瘤[3-6]與增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)[7-9]等多種生物功能的水溶性多糖[10]。目前獲取羧甲基茯苓多糖的方法多是依據(jù)液固相振蕩半合成法和液固相不振蕩半合成法這兩種化學(xué)修飾法制備或?qū)ζ溥M(jìn)行優(yōu)化[11-15]。但是均存在化學(xué)藥劑殘留、環(huán)境污染等問題，不適于綠色生產(chǎn)[16-17]。

王海波等在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加羧甲基纖維素制備改性細(xì)菌纖維素，用紅外光譜對其表征，結(jié)果顯示改性細(xì)菌纖維素中存在明顯的羧甲基特征吸收峰[18]。本課題組前期通過向茯苓液體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加羧甲基纖維素，經(jīng)茯苓發(fā)酵制備出羧甲基茯苓多糖[17，19]。該法成本低、轉(zhuǎn)化條件溫和、轉(zhuǎn)化過程綠色自然，并且能夠借助發(fā)酵過程研究進(jìn)一步放大[20-21]。

采用數(shù)學(xué)模型來定量地描述在發(fā)酵過程中的菌體濃度、生成物濃度和底物濃度等主要的代謝指標(biāo)的變化規(guī)律，例如，Logistic模型[22]、Sigmoid模型[23]、SGompertz模型或DoseResp模型[24]，從而為多糖的發(fā)酵過程的優(yōu)化控制、小罐實驗數(shù)據(jù)的放大提供理論基礎(chǔ)。另外，一個模型的可靠性評價不能只依賴于回歸分析中的相關(guān)系數(shù)，即相關(guān)系數(shù)越接近1越準(zhǔn)，還應(yīng)該用其他的統(tǒng)計學(xué)方法作為模型擬合時的可靠性分析[25]。

在目前的研究中，對于羧甲基茯苓多糖動力學(xué)方面尚未有相關(guān)文獻(xiàn)報道，本研究以茯苓為發(fā)酵菌株，在添加了1%的羧甲基纖維素的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行改性發(fā)酵，對發(fā)酵過程中主要理化指標(biāo)測定，采用Logistic模型、Sigmoid模型、SGompertz模型以及DoseResp模型對茯苓發(fā)酵過程中菌絲體生長、胞內(nèi)羧甲基茯苓多糖生成、底物(還原糖)消耗情況進(jìn)行擬合，并對模型進(jìn)行可靠性評價，得到最適的擬合模型的方程，從而為羧甲基茯苓多糖進(jìn)一步實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

茯苓(Poriacocos)Z1，由湖北中醫(yī)藥研究院王克勤研究員惠贈；玉米粉，市售食品，生產(chǎn)于北京密云；麩皮，市售食品，生產(chǎn)于河南鄭州；羧甲基纖維素(carboxymethyl cellulose，CMC)，取代度為0.7，分析純，山東西亞化學(xué)股份有限公司；葡萄糖、濃H2SO4，分析純，國藥集團(tuán)；KH2PO4、酒石酸鉀鈉、無水乙醇，分析純，天津博迪化工股份有限公司；3，5-二硝基水楊酸，分析純，成都科龍化工試劑廠。

1.1.2 儀器與設(shè)備

BL-220H電子天平，日本SHIMADZU公司；LDZX-50KBS高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1FD超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；GNP-9080恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；MQT-60恒溫?fù)u床，上海旻泉儀器有限公司；PHS-3CpH計，上海理達(dá)儀器廠。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(potato dextrose agar, PDA)(g/L)：土豆200、葡萄糖20、瓊脂20[26]，用于菌種活化；

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖3、蛋白胨1、KH2PO40.1、MgSO40.05、CaCl20.008、MnSO40.006、VB10.02、檸檬酸鐵銨0.000 5[27]；

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30、玉米粉40、麩皮60、(NH4)2SO42、MgSO4·7H2O 0.5、KH2PO41、pH 5.5[28]，另外添加CMC 10[17]。

1.2 試驗方法

1.2.1 發(fā)酵培養(yǎng)

將茯苓Z1菌種從斜面挑起1塊至PDA培養(yǎng)基平板中央，置于27 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，作為活化固體菌種；將活化的茯苓固體種的菌絲外緣打孔，使成直徑為0.672 cm小塊，挑起4塊菌種接入到裝有60 mL液體種子培養(yǎng)基的250 mL的三角瓶中，然后置于27 ℃、120 r/min的搖床中培養(yǎng)7 d；將茯苓液體種子按6%的接種量轉(zhuǎn)入到裝有60 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL的三角瓶中，然后置于27 ℃、150 r/min的搖床中培養(yǎng)，設(shè)3個重復(fù)。

1.2.2 檢測方法

每隔1 d測1次指標(biāo)，每次都在固定時間取樣并按照相應(yīng)的檢測方法檢測不同時間各個理化指標(biāo)數(shù)值，每個檢測重復(fù)3個平行，求其平均值。以發(fā)酵時間為橫坐標(biāo)，各個理化指標(biāo)為縱坐標(biāo)，利用Origin 8.0軟件繪制各理化指標(biāo)隨時間的曲線圖。

1.2.2.1 菌絲體生物量的測定

將發(fā)酵液用3層紗布過濾得到菌絲球，并用流水沖洗3次，將收集的菌絲球置于烘至恒重的培養(yǎng)皿(培養(yǎng)皿的質(zhì)量為m1)中于60 ℃烘干，取出置于干燥器中，待冷卻至室溫下稱重得m2，菌絲生物量m=m2-m1。

1.2.2.2 多糖含量的測定

將烘干的茯苓菌絲體研磨成粉末，稱取0.5 g加入100 mL蒸餾水，沸水浴3 h后抽濾、收集濾液，將濾渣分別重復(fù)沸水浴2、1 h后合并濾液，60 ℃旋蒸后定容至100 mL。取1 mL用苯酚-硫酸法測定多糖含量[29]。

1.2.2.3 還原糖含量的測定

采用3.5-二硝基水楊酸法測定發(fā)酵液中還原糖的含量[30]。

1.2.2.4 pH的測定

采用pH計測定發(fā)酵液中pH值。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

每組試驗重復(fù)3次，采用Origin8.0軟件進(jìn)行作圖分析，選取合適的模型對茯苓生物量、胞內(nèi)羧甲基茯苓多糖生成、還原糖的消耗數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性擬合，并用相關(guān)系數(shù)R2、均方誤差(mean square error，MSE)和準(zhǔn)確因子(accuracy factor，AF)、偏差因子(Bias factor，BF)作為可靠性評價標(biāo)準(zhǔn)篩選出最合適的模型進(jìn)行定量描述[31-33]，如公式(1)～公式(3)所示：

(1)

(2)

(3)

式中：VO，試驗觀測值；Vp，模型所得出的預(yù)測值；n，次數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 胞內(nèi)羧甲基茯苓多糖發(fā)酵過程中各理化指標(biāo)的變化趨勢

由圖1所示，茯苓在0～96 h為快速生長期，隨后進(jìn)入穩(wěn)定期，168 h后進(jìn)入衰亡期，發(fā)酵結(jié)束。茯苓在0～96 h消耗葡萄糖的速度迅速增加，隨后逐漸降低，在發(fā)酵第168 h時，發(fā)酵液中葡萄糖濃度為4.908 g/L，在第216 h時，發(fā)酵液中殘余的葡萄糖濃度為0.890 5 g/L。茯苓在發(fā)酵時間為0～96 h生長速度迅速，在發(fā)酵第168 h時，生物量達(dá)到最大值，其生物量干重為11.425 6 g/L。胞內(nèi)茯苓多糖在24～96 h內(nèi)最快，并在第96 h時，多糖含量為1.459 1 g/L，在96 h后積累緩慢，在發(fā)酵第192 h時，多糖含量達(dá)到1.527 3 g/L。發(fā)酵液的pH在0～96 h內(nèi)逐漸降低，在發(fā)酵96～192 h時，逐漸平緩，但第192 h后，在衰亡期稍有浮動。

圖1 茯苓發(fā)酵過程中各理化指標(biāo)的變化

2.2 胞內(nèi)羧甲基茯苓多糖發(fā)酵動力學(xué)模型的建立

2.2.1 茯苓生長動力學(xué)模型

圖1可知，由于茯苓在168 h后進(jìn)入衰亡期，而在0～168 h時茯苓處于生長期和穩(wěn)定期，故本研究擬對發(fā)酵0～168 h時期茯苓生長情況進(jìn)行非線性擬合。采用模型Logistic模型、Sigmoid模型和SGompertz模型對茯苓生長情況進(jìn)行非線性擬合，由表1可知，3個模型偏差因子BF均在0.90～1.05，即3個模型都能夠很好地預(yù)測茯苓的生長狀況，而由相關(guān)系數(shù)R2和準(zhǔn)確因子AF更接近于1更好預(yù)測，均方誤差MSE越小越好，可得SGompertz模型相比其他2個模型更適合用于對胞內(nèi)羧甲基茯苓多糖發(fā)酵過程茯苓的生長情況進(jìn)行定量描述。擬合曲線如圖2 所示。

表1 茯苓生長擬合方程及其評價

圖2 茯苓發(fā)酵過程中的生長擬合曲線

2.2.2 胞內(nèi)羧甲基茯苓多糖生成動力學(xué)模型

由表2可得，3種模型對胞內(nèi)羧甲基茯苓多糖生成情況擬合，其相關(guān)系數(shù)R2均為0.98左右，而偏差因子BF均在0.90～1.05，說明3種模型均能很好預(yù)測胞內(nèi)羧甲基茯苓多糖的生成狀況，由于Logistic模型的準(zhǔn)確因子AF更接近于1，均方誤差MSE更小，所以選用Logistic模型對胞內(nèi)羧甲基茯苓多糖發(fā)酵過程中的生成情況進(jìn)行定量描述。擬合曲線如圖3所示。

表2 胞內(nèi)羧甲基茯苓多糖的生成擬合方程及其評價

圖3 茯苓發(fā)酵過程中胞內(nèi)羧甲基茯苓多糖生成擬合曲線

2.2.3 底物(還原糖)消耗動力學(xué)模型

由表3可知，3種模型的偏差因子BF均在0.90～1.05，說明3種模型均能很好地預(yù)測還原糖的消耗狀況，雖然Logistic模型的準(zhǔn)確因子AF小于其他模型，但是其相關(guān)系數(shù)R2小于其他模型并且其均方誤差MSE偏大，而Sigmoid模型和DoseResp模型經(jīng)驗證得到的參數(shù)一樣，所以Sigmoid模型和DoseResp模型均可以用于定量描述發(fā)酵過程中還原糖的消耗情況。其擬合曲線分別如圖4、圖5。

2.3 比生長速率、比合成速率與比消耗速率研究

由圖6可知，在限制性條件下發(fā)酵的茯苓菌體生長的初期受發(fā)酵液底物高濃度抑制或菌體生長速度較慢，隨后菌體生長加快，當(dāng)茯苓菌體生長的比生長速率達(dá)到最大比生長速率后會逐漸降低甚至菌體停止生長，即茯苓的菌體比生長速率呈現(xiàn)一個“鐘”形曲線，表示每小時單位質(zhì)量的菌體所增加的菌體量[34]。另外微生物產(chǎn)物生成的動力學(xué)模型從產(chǎn)物與菌體細(xì)胞生長的方面可以劃分為3種：1類為生長偶聯(lián)型，即產(chǎn)物生成與菌體細(xì)胞生長有緊密聯(lián)系；第2類是部分生長偶聯(lián)型，即產(chǎn)物的生成伴隨菌體細(xì)胞生長，但其生成速率與菌體生長速率部分偶聯(lián)，還與菌體積累量有關(guān)；第3類是非生長偶聯(lián)型，即產(chǎn)物合成與菌體細(xì)胞生長無直接關(guān)系，產(chǎn)物的生成速率只與已有的菌體生物量有關(guān)[35]。根據(jù)圖6可知，胞內(nèi)羧甲基茯苓多糖的生成與菌體生長呈緊密的直接聯(lián)系，即為生長偶聯(lián)型。根據(jù)圖1，茯苓在0～96 h為快速生長期，隨后進(jìn)入穩(wěn)定期，168 h后進(jìn)入衰亡期，發(fā)酵結(jié)束。結(jié)合圖6中葡萄糖比消耗速率曲線可知，茯苓在生長穩(wěn)定期，其葡萄糖的比消耗速率是變化的。

表3 還原糖消耗的擬合方程及其評價

圖4 Sigmoid模型還原糖消耗擬合曲線

圖5 DoseResp模型還原糖消耗擬合曲線

圖6 茯苓發(fā)酵過程中比生長速率、多糖比合成速率、葡萄糖比消耗速率隨時間的變化曲線

3 結(jié)論

目前利用茯苓發(fā)酵制備羧甲基茯苓多糖的發(fā)酵動力學(xué)研究還未見文獻(xiàn)報道，本文通過Logistic模型、Sigmoid模型、SGompertz模型以及DoseResp模型能夠較好地對茯苓生長、胞內(nèi)羧甲基茯苓多糖生成和還原糖消耗進(jìn)行非線性擬合，并采用均方誤差(MSE)、準(zhǔn)確因子(AF)和偏差因子(BF)對擬合模型進(jìn)行可靠性評價，所選模型能夠較好地描述胞內(nèi)羧甲基茯苓多糖的發(fā)酵過程的動力學(xué)特征，從而為羧甲基茯苓多糖進(jìn)一步實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

通過對比生長速率、比合成速率與比消耗速率研究，茯苓的比生長速率、胞內(nèi)羧甲基茯苓多糖的比合成速率在整個發(fā)酵過程中隨時間的變化趨勢與聯(lián)系，可知胞內(nèi)羧甲基茯苓多糖的生成與菌體生長是生長偶聯(lián)型的。