楊叢遠(yuǎn)，韓鎮(zhèn)龍，孫悅，肖丹，溫榮輝,3,4，何熙璞*,3,4

(1.廣西大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院, 廣西 南寧 530004；2.廣西大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 廣西 南寧 530004；3.亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣西 南寧 530004；4.廣西甘蔗生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣西 南寧 530004)

0 引言

近年來量子點(diǎn)作為一種熒光探針被普遍應(yīng)用在生物成像、生物標(biāo)記及診斷等領(lǐng)域[1]，主要方式有細(xì)胞成像、生物活體成像、免疫層析快速診斷等[2-4]。ZHANG等[5]提供了一種非晶碳納米顆粒的簡單制備程序，并使用制備出的碳納米粒子作為標(biāo)記物來檢測三種鐮刀菌真菌毒素。

目前針對病毒的主要檢測分析方法有酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)和基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(polymerase chain reaction，PCR)，但兩種方法均耗時(shí)且費(fèi)用昂貴[6-8]。

病毒引起的疾病大多傳播速度快、致病性高，例如2013年爆發(fā)的H7N9型禽流感和2020年爆發(fā)的新型冠狀病毒等，因此及時(shí)發(fā)現(xiàn)潛在病患并進(jìn)行防疫非常重要。2015年，WU等[9]開發(fā)了一種基于免疫磁納米球和抗體偶聯(lián)的量子點(diǎn)來檢測H7N9病毒的方法，可以對其進(jìn)行快速定量檢測。針對2020年爆發(fā)的新型冠狀病毒肺炎，GORSHKOV等[10]使用與QDs共軛的重組受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域生成了多功能成像探針，該探針能夠與ACE2共軛的金納米顆粒進(jìn)行能量轉(zhuǎn)移猝滅，從而能夠監(jiān)測溶液中的結(jié)合事件，中和抗體和重組的人ACE2阻斷了淬滅作用，證明了特異性的結(jié)合相互作用。因此采用納米生物傳感可以在幾分鐘內(nèi)檢測到樣品，相較其他方法省時(shí)且簡便，在大規(guī)模篩選中非常有優(yōu)勢[11-12]。

碲化鎘量子點(diǎn)(cadmium telluride quantum dots，CdTe QDs)和碳量子點(diǎn)(carbon quantum dots，C QDs)屬于發(fā)光半導(dǎo)體納米晶體，它們熒光強(qiáng)度高，光穩(wěn)定性好，不受當(dāng)前有機(jī)染料的限制，具有窄的熒光發(fā)射光譜的寬吸收光譜[13-14]，非常適合于傳感和生物技術(shù)應(yīng)用。并且這兩種量子點(diǎn)的熒光發(fā)射峰及紫外吸收峰無重疊，二者易于區(qū)分。基于CdTe QDs和C QDs的這種特征，本文構(gòu)建了一種基于CdTe QDs和C QDs的納米生物傳感，并使用牛血清蛋白(bovine serum albvmin, BSA)測試了其可行性。傳感器的生物供體部分由針對BSA的特異性抗體(immunogloblin G, IgG)組成，能夠檢測溶液中同源抗原BSA的存在。在反應(yīng)中，抗原-抗體分子之間的相互作用產(chǎn)生供體-受體復(fù)合物IgG-CdTe QDs+BSA-C QDs，IgG-CdTe QDs(供體)和BSA-C QDs(受體)接近，導(dǎo)致CdTe QDs熒光發(fā)射強(qiáng)度顯著降低，即BSA-C QDs淬滅了IgG-CdTe QDs的熒光。向溶液中加入游離抗原使游離BSA取代BSA-C QDs導(dǎo)致CdTe QDs熒光強(qiáng)度恢復(fù)，通過檢測量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度的變化，可實(shí)現(xiàn)對BSA的檢測。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

儀器：多功能微孔板檢測儀(型號：Spark瑞士TECAN公司)；紫外-可見分光光度計(jì)(型號：Shimadzu UV-1800日本Shimadzu公司)；pH計(jì)(FE28-Bio METTLER TOLEDO)。

試劑：CdCl2·2.5 H2O；巰基乙酸；碲粉；硼氫化鈉；NaOH；檸檬酸鈉；尿素；硫脲；N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS)；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)等試劑均為分析純。牛血清白蛋白抗體。實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 水溶性量子點(diǎn)的合成

① CdTe水溶性量子點(diǎn)的合成 參照文獻(xiàn)[15]報(bào)道的方法，并對其做了適當(dāng)?shù)男薷?，合成CdTe QDs。在三口燒瓶中加入10 mL蒸餾水，通氮?dú)? min除氧，迅速加入0.1 g Te粉，0.3 g NaBH4，塞住瓶口，90 ℃回流攪拌加熱3 h，使二者充分反應(yīng)至黑色Te粉消失。在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，在100 mL蒸餾水中加入0.4 g CdCl2·2.5H2O，然后在250 μL TGA存在下，控制pH=10，攪拌下迅速加入新鮮制備的NaHTe溶液，繼續(xù)于90 ℃下加熱攪拌回流不同時(shí)間，即得不同顏色的水溶性CdTe量子點(diǎn)。為了后續(xù)有效偶聯(lián)CdTe QDs-IgG，將所合成的CdTe QDs使用無水乙醇進(jìn)行洗滌純化，8 000 r/min離心10 min，棄去上清液，洗滌3次后，將沉淀真空濃縮后得到固體粉末備用。

② 碳量子點(diǎn)的制備 參照文獻(xiàn)[16]的方法并做適當(dāng)修改，合成C QDs。按照1∶9∶3摩爾比稱取檸檬酸鈉∶尿素∶硫脲溶于蒸餾水中，將混合液轉(zhuǎn)入到聚四氟乙烯為內(nèi)襯的反應(yīng)釜中，放入180 ℃烘箱加熱6 h，待反應(yīng)結(jié)束冷卻至室溫，得到黃棕色的碳量子點(diǎn)。

1.2.2 BSA抗原/抗體的標(biāo)記

① BSA抗體的標(biāo)記 參照文獻(xiàn)[17]，將一定量的CdTe QDs(20 mg/mL)、牛血清蛋白抗體(IgG)(5 mg/mL)和EDC(4.2 mg/mL)混合，隨后加入PBS溶液使混合溶液的體積達(dá)到1 000 μL。將混合溶液在室溫下攪拌2 h使其充分反應(yīng)，然后將溶液在4 ℃下12 000 r/min離心10 min分離制備的CdTe QDs-IgG混合物，將溶液避光保存在4 ℃冰箱內(nèi)備用。

② BSA抗原的標(biāo)記 參照文獻(xiàn)[18]對BSA進(jìn)行標(biāo)記。為了用C QDs標(biāo)記BSA，首先將含有EDC(6.4 mg/mL)和NHS(4.5 mg/mL)新鮮制備的溶液加入到一定量0.08 mg/mL的C QDs中，并將其避光溫浴于37 ℃的深水浴中。然后，將BSA逐滴添加至溶液中，并通過添加Tris緩沖液(6 mg/mL，pH=7.2)終止反應(yīng)。為了分離C QDs標(biāo)記的抗原(C QDs-BSA)，將混合物以12 000 r/min離心10 min并將上層相用500 μL Tris緩沖液稀釋，并在4 ℃下儲存直至使用。

1.2.3 熒光猝滅效率的測定

根據(jù)公式(1)

E=1-(F/F0)。

(1)

估計(jì)熒光猝滅效率(E)，其中F和F0分別是存在和不存在受體的情況下供體的熒光強(qiáng)度。為了確定最佳熒光淬滅效率，將不同濃度的C QDs-BSA依次添加至恒定濃度的CdTe QDs-IgG。即使用熒光分光光度計(jì)測試了體積比分別為1∶10，2∶10，3∶10，4∶10，1∶2，1∶1，2∶1的C QDs-BSA和CdTe QDs-IgG偶聯(lián)物。

1.2.4 構(gòu)建檢測牛血清白蛋白的生物傳感

為了評估本研究開發(fā)的納米生物傳感檢測BSA的能力，將CdTe QDs-IgG加入到pH=9的PBS緩沖液中。然后將C QDs-BSA加入溶液中并溫浴3 min以確保形成CdTe QDs-IgG和C QDs-BSA的免疫復(fù)合物，再將BSA加入含有CdTe QDs-IgG和C QDs-BSA的反應(yīng)混合物中并溫浴5 min。反應(yīng)結(jié)束后在360 nm激發(fā)該溶液并記錄發(fā)射光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 量子點(diǎn)的表征

圖1是制備的碲化鎘量子點(diǎn)和碳量子點(diǎn)的透射電鏡圖，從圖1可以觀察到制備的量子點(diǎn)均為圓形，顆粒均勻，具有良好的分散性。其中碲化鎘量子點(diǎn)的粒徑約為10 nm，碳量子點(diǎn)粒徑在5 nm以內(nèi)。HR-TEM插圖顯示兩種量子點(diǎn)均具有明顯的晶格條紋，CdTe QDs的晶格間距為0.34 nm，對應(yīng)晶面(111)，C QDs的晶格間距為0.21 nm，對應(yīng)晶面(100)。

(a) 碲化鎘量子點(diǎn)的透射電鏡圖

(b) 碳量子點(diǎn)的透射電鏡圖

2.2 量子點(diǎn)偶聯(lián)抗原/抗體

2.2.1 量子點(diǎn)與牛血清白蛋白抗原/抗體的偶聯(lián)

圖2(a)是碲化鎘量子點(diǎn)標(biāo)記牛血清白蛋白抗體前和標(biāo)記后的紫外吸收對比圖，圖2(b)是碳量子點(diǎn)標(biāo)記牛血清白蛋白抗原前和標(biāo)記后的紫外吸收對比圖，可以觀察到偶聯(lián)蛋白后的量子點(diǎn)相對偶聯(lián)前量子點(diǎn)的紫外最大吸收波長發(fā)生了移動(dòng)，說明量子點(diǎn)和蛋白偶聯(lián)時(shí)一定程度上改變了量子點(diǎn)理化性質(zhì)和表面結(jié)構(gòu)，證實(shí)了二者的成功偶聯(lián)[19]。

(a) 碲化鎘量子點(diǎn)的紫外吸收光譜

(b) 碳量子點(diǎn)的紫外吸收光譜

2.2.2 碲化鎘量子點(diǎn)標(biāo)記牛血清白蛋白抗體

① pH值的影響

由于蛋白質(zhì)表面離子化側(cè)鏈可以被滴定，會有一個(gè)相應(yīng)的pH值使對應(yīng)的蛋白表面靜電荷為零，這個(gè)pH值即為蛋白的等電點(diǎn)(protein isoelectric point，PI)[20]。當(dāng)溶液的pH值小于蛋白質(zhì)的PI值，蛋白帶正電，易與CdTe QDs表面的羧基反應(yīng)產(chǎn)生沉淀。

由圖3可以觀察到固定加入體系中的反應(yīng)物的量，使用不同pH值的PBS緩沖液做溶劑偶聯(lián)碲化鎘量子點(diǎn)與牛血清白蛋白抗體，當(dāng)PBS緩沖液偏酸性時(shí)，CdTe QDs與牛血清白蛋白抗體會團(tuán)聚產(chǎn)生沉淀，溶液無熒光；當(dāng)PBS緩沖溶液的pH=9時(shí)，體系CdTe QDs熒光強(qiáng)度最大，且體系發(fā)光較穩(wěn)定，因此本實(shí)驗(yàn)選擇pH=9的PBS緩沖液對CdTe QDs與IgG進(jìn)行偶聯(lián)。

(a) pH值對CdTe QDs-IgG熒光光譜的影響

(b) pH值對CdTe QDs-IgG在550 nm處熒光光譜的影響

圖4 EDC用量對CdTe QDs-IgG影響的熒光光譜圖Fig.4 Fluorescence spectra of effect of EDC concentration on CdTe QDs-IgG

② EDC用量的影響

蛋白質(zhì)與量子點(diǎn)的結(jié)合有多種方式，其中最廣泛使用的是使用EDC以及NHS或sulfo NHS將抗體上的氨基或羧基與量子點(diǎn)的游離羧基或氨基進(jìn)行交聯(lián)，EDC先與量子點(diǎn)上的羧基結(jié)合，隨后與抗體表面上存在的氨基形成酰胺鍵[21]。為此，本文通過調(diào)節(jié)EDC的用量，研究了EDC對活化CdTe QDs的影響。

圖4為不同配比EDC活化CdTe QDs使其與IgG偶聯(lián)的熒光光譜。將相同量的CdTe QDs、 IgG和不同量的濃度為4.2 mg/mL的EDC溶液混合。當(dāng)EDC加入量過多時(shí)，會導(dǎo)致量子點(diǎn)團(tuán)聚沉淀，使其熒光強(qiáng)度大大降低，因此為了更好地活化量子點(diǎn)以提高酰胺鍵的轉(zhuǎn)化率，我們后續(xù)進(jìn)行CdTe QDs標(biāo)記IgG時(shí)CdTe QDs與EDC的反應(yīng)質(zhì)量比為1∶2。

2.3 構(gòu)建生物傳感檢測牛血清白蛋白

由公式(1)可知生物傳感的熒光淬滅效率直接取決于C QDs-BSA和CdTe QDs-IgG的比例。圖5為使用熒光分光光度計(jì)測試體積比分別為1∶10，2∶10，3∶10，4∶10，1∶2，1∶1，2∶1的C QDs-BSA和CdTe QDs-IgG偶聯(lián)物的淬滅效率。由圖5可以觀察到，隨著C QDs-BSA與CdTe QDs-IgG比例的增加，淬滅效率逐漸增大，當(dāng)比例達(dá)到1∶2時(shí)，淬滅效率最大，當(dāng)C QDs-BSA與CdTe QDs-IgG的比例大于1∶2時(shí)，過量的C QDs-BSA不參與免疫復(fù)合物的形成，淬滅效率增大到最大后保持恒定。如圖6所示，在C QDs-BSA與CdTe QDs-IgG的比例為1∶10至1∶2時(shí)，根據(jù)公式(1)得出Stern-Volmer曲線是線性的，說明此生物傳感的淬滅為單一類型的淬滅。

圖5 不同體積比C QDs-BSA /CdTe QDs-IgG熒光淬滅效率Fig.5 Fluorescence quenching efficiency of CdTe for different Volume ratios of C QDs-BSA to CdTe QDs-IgG

圖6 Stern-Volmer曲線I0/I與碳量子點(diǎn)濃度函數(shù)曲線Fig.6 Stern-Volmer plot I0/I against C QDs concentration function curve

在本研究中，構(gòu)建了CdTe QDs-IgG/C QDs-BSA納米生物傳感檢測BSA。圖7為量子點(diǎn)構(gòu)建生物傳感檢測BSA的熒光圖譜，其中CdTe QDs-IgG的熒光發(fā)射強(qiáng)度約為130 000 a.u.，向其中添加C QDs-BSA形成免疫復(fù)合物后，該峰值降至80 000 a.u.左右，此為基線光譜。隨后，向免疫復(fù)合物中添加游離的BSA可使基線的CdTe QDs熒光發(fā)射強(qiáng)度增加。這是由于添加了游離抗原，復(fù)合物中C QDs-BSA部分被樣品中游離的BSA代替，C QDs-BSA對CdTe QDs-IgG的淬滅能力降低，導(dǎo)致了熒光曲線強(qiáng)度的恢復(fù)。

圖7 基于碲化鎘量子點(diǎn)的納米生物傳感的構(gòu)建Fig.7 Construction of nano biosensor based on CdTe quantum dots

為了評估開發(fā)的納米生物傳感檢測BSA的能力，使用BSA檢測其熒光變化，測試納米生物傳感的特異性。向CdTe QDs-IgG/C QDs-BSA免疫復(fù)合物中加入10 μL不同濃度的BSA(1.25、2.5、5、10、20、40 mg/mL)，CdTe QDs-IgG在λmax=550 nm附近的熒光強(qiáng)度恢復(fù)，由此得出體系中CdTe QDs-IgG的發(fā)射光譜變化與BSA的最終濃度直接相關(guān)(圖8)。在加入較低濃度BSA時(shí)，可觀察到隨BSA濃度的增加CdTe QDs熒光恢復(fù)較明顯，當(dāng)繼續(xù)加入較高濃度的BSA，CdTe QDs-IgG的熒光強(qiáng)度恢復(fù)較為緩慢，得到對應(yīng)的方程為y=2 985.6 ln(x)-4 715.1，其相關(guān)系數(shù)R2=0.949 9(圖9)，可對BSA進(jìn)行定量檢測。

圖8 BSA用量對納米生物傳感熒光強(qiáng)度的影響Fig.8 Effect of BSA concentration on fluorescence intensity of nano biosensor

圖9 CdTe QDs-IgG熒光強(qiáng)度隨BSA濃度變化曲線Fig.9 Linear relationship between fluorescence intensity of CdTe QDs-IgG and BSA concentration

3 結(jié)論

在本研究中，采用簡單的方法合成了CdTe QDs和C QDs，合成的兩種量子點(diǎn)顆粒大小相對均勻，紫外吸收波長與熒光發(fā)射波長均無重疊，可簡單區(qū)分二者，合成的兩種量子點(diǎn)可以分散在水中，方便進(jìn)行后續(xù)生物實(shí)驗(yàn)。

使用BSA和相應(yīng)的抗體IgG作為抗原-抗體系統(tǒng)，開發(fā)并證實(shí)了基于熒光淬滅及熒光恢復(fù)的CdTe QDs和C QDs檢測BSA的納米生物傳感器。使用CdTe QDs偶聯(lián)IgG，C QDs偶聯(lián)BSA后，將二者混合使其形成免疫復(fù)合物，構(gòu)建納米生物傳感檢測BSA。向免疫復(fù)合物中加入游離的BSA，溶液中C QDs-BSA部分可以被游離的BSA取代，C QDs-BSA對CdTe QDs-IgG的淬滅能力降低，通過觀察CdTe QDs的熒光強(qiáng)度變化，可以判斷溶液是否含有BSA。在較低濃度BSA存在下，CdTe QDs的熒光強(qiáng)度恢復(fù)明顯，當(dāng)繼續(xù)加入較高濃度的BSA，CdTe QDs的熒光強(qiáng)度恢復(fù)較為緩慢，得到對應(yīng)的方程為y=2 985.6 ln(x)-4 715.1，其相關(guān)系數(shù)R2=0.949 9。

構(gòu)建的納米生物傳感可有效檢測BSA，此方法操作簡便，對操作人員的技術(shù)要求不高，為后續(xù)拓展應(yīng)用于檢測其他物質(zhì)提供新思路。