侯晨陽(yáng)，胡艷玲，黃代政，毛宇昂

(廣西醫(yī)科大學(xué) 信息與管理學(xué)院，廣西 南寧 530000)

0 引言

在全世界女性隊(duì)列中，乳腺癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，死亡率高居第二位，且發(fā)病率和死亡率一直逐年上升，對(duì)女性的健康有著極大的隱患[1]。在分子水平上，乳腺癌是一種具有高異質(zhì)性的腫瘤，按照分子分型，乳腺癌分為四種亞型，即Luminal A型、Luminal B型、HER2過(guò)表達(dá)型、Basal-like型，且每一種亞型的乳腺癌患者的預(yù)后具有明顯差異[2]。此外，世界各地不同的地理環(huán)境也造成了乳腺癌患者預(yù)后和總體生存率具有差異。由于乳腺癌病因復(fù)雜，加上高度的異質(zhì)性，使得探究疾病預(yù)后成為一種挑戰(zhàn)。另外，乳腺癌治療手段的局限性的使然，開(kāi)發(fā)新的預(yù)后模型成為一種必然。

鐵死亡是一種鐵依賴(lài)性的，區(qū)別于細(xì)胞凋亡、細(xì)胞壞死、細(xì)胞自噬的新型的細(xì)胞程序性死亡方式，在致命的脂質(zhì)過(guò)氧化驅(qū)動(dòng)下，從而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[3-4]。近年來(lái)，相對(duì)于具有耐藥性腫瘤的傳統(tǒng)治療方法，通過(guò)鐵死亡機(jī)制，誘導(dǎo)腫瘤癌細(xì)胞死亡成為一種有前景的治療手段。除了鐵死亡的誘導(dǎo)因子外，許多基因也被確定為鐵死亡的標(biāo)志物。然而，這些和鐵死亡相關(guān)的基因與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系還尚不清楚。

在本研究中，首先從公共數(shù)據(jù)庫(kù)下載了乳腺癌患者的mRNA表達(dá)譜及相應(yīng)的臨床數(shù)據(jù)。然后，在TCGA隊(duì)列中通過(guò)鐵死亡相關(guān)的差異表達(dá)基因構(gòu)建了一個(gè)多基因預(yù)后模型，并在METABRIC隊(duì)列中驗(yàn)證此模型。最后，筆者進(jìn)一步進(jìn)行了功能富集分析，以探討其潛在的生物學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)下載

本研究在TCGA(https://portal.gdc.cancer.gov/repository)數(shù)據(jù)庫(kù)下載了1 053名病人的乳腺癌mRNA數(shù)據(jù)及相應(yīng)的臨床信息，數(shù)據(jù)下載格式為標(biāo)準(zhǔn)化之后的FPKM格式。用于驗(yàn)證的數(shù)據(jù)來(lái)自于乳腺癌國(guó)際聯(lián)盟的分子分類(lèi)學(xué)(METABRIC)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.cbioportal.org/datasets)，包括1 904名乳腺癌病人的mRNA-seq數(shù)據(jù)及其相關(guān)的臨床信息，此數(shù)據(jù)的表達(dá)矩陣同樣是經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化之后的數(shù)據(jù)。METABRIC是一項(xiàng)加拿大與英國(guó)合作項(xiàng)目，旨在根據(jù)有助于確定最佳治療過(guò)程的分子特征將乳腺腫瘤分類(lèi)為更多的亞類(lèi)。TCGA和METABRIC的數(shù)據(jù)都是公開(kāi)可獲得的。因此，本研究無(wú)需獲得當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會(huì)的批準(zhǔn)。此外本研究遵守TCGA和METABRIC數(shù)據(jù)訪問(wèn)和使用準(zhǔn)則。

同樣，與鐵死亡相關(guān)的基因來(lái)自于鐵死亡數(shù)據(jù)庫(kù)(FerrDb)(http://www.zhounan.org/ferrdb)的基因標(biāo)志物和文獻(xiàn)檢索得到基因的并集，共計(jì)148個(gè)基因[5-7]。

1.2 預(yù)后模型的構(gòu)建與驗(yàn)證

在TCGA隊(duì)列中，通過(guò)R包“l(fā)imma”對(duì)腫瘤組織和癌旁組織做基因的差異表達(dá)分析，篩選出與鐵死亡相關(guān)的差異基因(DEGs)。篩選閾值為|log2FC|>1，F(xiàn)DR<0.05。同時(shí)進(jìn)行的是對(duì)總生存率(overall survival, OS)的單因素Cox回歸分析，以篩選具有預(yù)后價(jià)值的鐵死亡相關(guān)基因。運(yùn)用R包“venn”對(duì)具有差異和預(yù)后價(jià)值的鐵死亡相關(guān)基因取交集，并且運(yùn)用STRING (version 11.0) 數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)[8]。為了達(dá)到最大化減小過(guò)度擬合風(fēng)險(xiǎn)的目的，筆者采用LASSO Cox 回歸分析并結(jié)合R包“glmnet”構(gòu)建預(yù)后模型[9-10]?；貧w分析中的自變量為差異和預(yù)后交集的基因表達(dá)量，因變量是TCGA隊(duì)列中乳腺癌患者的總體生存率和狀態(tài)，得出最優(yōu)模型的基因及對(duì)應(yīng)的回歸系數(shù)。根據(jù)每個(gè)基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)水平及其相應(yīng)的回歸系數(shù)計(jì)算每一個(gè)患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分[危險(xiǎn)得分=e^(基因1表達(dá)量×相應(yīng)的回歸系數(shù)+…+基因n表達(dá)量×相應(yīng)的回歸系數(shù)]。根據(jù)得到風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分求其中位數(shù)，將患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。在生存分析中，根據(jù)高、低風(fēng)險(xiǎn)兩組運(yùn)用R包“survminer”構(gòu)建生存曲線。同時(shí)使用R包“timeROC”進(jìn)行ROC曲線分析，評(píng)估其特征基因預(yù)后模型的預(yù)測(cè)能力。

1.3 功能富集分析

運(yùn)用R包“l(fā)imma”對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)患者組和低風(fēng)險(xiǎn)患者組做基因的差異表達(dá)分析，篩選出風(fēng)險(xiǎn)差異基因，篩選閾值為|log2FC|>1，F(xiàn)DR<0.05。通過(guò)R “clusterProfiler”對(duì)高、低風(fēng)險(xiǎn)兩組中的差異基因進(jìn)行基因本體(gene ontology, GO)、京都基因和基因組百科全書(shū)(kyoto encyclopedia of genes and genomics, KEGG)分析。此外，基于R包“gsva”，通過(guò)單樣本基因集富集分析(ssGSEA)對(duì)16個(gè)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)打分，分析13個(gè)免疫相關(guān)的通路[11]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

在腫瘤組織和癌旁組織差異分析時(shí)采用t檢驗(yàn)。高、低風(fēng)險(xiǎn)組間的總體生存率比較采用Kaplan-Meier法。采用單因素和多因素Cox回歸分析來(lái)確定總體生存期的獨(dú)立預(yù)后因子。所有的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析均基于R平臺(tái)(Version 4.0.2)。如果以上分析方法沒(méi)有進(jìn)行特殊說(shuō)明，則認(rèn)為P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且所有P值均為雙尾分布。

2 結(jié)果

通過(guò)篩選可用數(shù)據(jù)，本研究最終納入了1 012名來(lái)自TCGA隊(duì)列的乳腺癌患者和1 901名來(lái)自METABRIC隊(duì)列的乳腺癌患者。

2.1 確定與鐵死亡相關(guān)的差異預(yù)后基因

確定TCGA隊(duì)列中選擇的鐵死亡相關(guān)基因見(jiàn)圖1。在腫瘤組織和癌旁組織間做差異表達(dá)時(shí)，發(fā)現(xiàn)大部分與鐵死亡相關(guān)的基因都存在差異表達(dá)(117/148，79.1 %)[圖1(a)]。在單因素回歸分析中，有20個(gè)差異基因與總體生存的預(yù)后相關(guān)[圖1(b～c)]。因此，這20個(gè)基因被納入后續(xù)的預(yù)后分析，且所有的基因的FDR值均小于0.05。這些基因之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)圖表明TXRND1、CS、GPX4、G6PD為中心基因[圖1(d)]。此外，圖1(e)展示了這些基因之間的相關(guān)性。

2.2 構(gòu)建預(yù)后模型

根據(jù)前期分析得到的20個(gè)基因的表達(dá)譜，采用LASSO Cox回歸分析構(gòu)建預(yù)后模型。經(jīng)過(guò)回歸分析，得出最優(yōu)的16個(gè)基因及其對(duì)應(yīng)的相關(guān)系數(shù)(圖2)。危險(xiǎn)評(píng)分計(jì)算公式為：e^(0.184×CISD1的表達(dá)量-0.189×AIFM2的表達(dá)量+0.132×ALOX15的表達(dá)量+0.196×NCOA4的表達(dá)量+0.061×CHAC1的表達(dá)量+0.215×CS的表達(dá)量-0.055×GPX4的表達(dá)量+0.033×SQLE的表達(dá)量-0.041×CAPG的表達(dá)量+0.179×G6PD的表達(dá)量+0.386×NGB的表達(dá)量+0.106×GCLC的表達(dá)量+0.013×HSBP1的表達(dá)量+0.053×PRDX1的表達(dá)量-0.167×SLC1A4的表達(dá)量+0.036×BNIP3的表達(dá)量)。根據(jù)危險(xiǎn)得分的中位值將患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組(506例)和低風(fēng)險(xiǎn)組(506例)，如圖2(a)。如圖2(b)所示，高風(fēng)險(xiǎn)組的早死概率高于低風(fēng)險(xiǎn)組的患者。在進(jìn)行生存分析時(shí)，Kaplan-Meier曲線顯示低風(fēng)險(xiǎn)組的存活率明顯高于高風(fēng)險(xiǎn)組，且P<0.001，如圖2(c)。采用ROC曲線評(píng)估總體生存風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的預(yù)測(cè)性能，曲線下面積(AUC)在1 a內(nèi)為0.65，2 a內(nèi)為0.70，3 a內(nèi)為0.67, 如圖2(d)。

(a) 用維恩圖來(lái)鑒定腫瘤間差異表達(dá)的基因以及與OS相關(guān)的鄰近正常組織

(b) 20個(gè)重疊基因在腫瘤組織中的表達(dá)情況

(c) 顯示單因素回歸分析結(jié)果的森林圖，包括基因表達(dá)與OS的Cox回歸分析

(d) 從STRING數(shù)據(jù)庫(kù)下載的基因間互作網(wǎng)絡(luò)顯示了候選基因之間的相互作用

(e) 候選基因的相關(guān)網(wǎng)絡(luò)，相關(guān)系數(shù)用不同的顏色表示

(a) TCGA隊(duì)列中風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的分布和中值

(b) TCGA隊(duì)列中OS狀態(tài)、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的分布

(c) Kaplan-Meier曲線, TCGA隊(duì)列中高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組患者的生存率

(d) ROC曲線下面積(AUC)評(píng)測(cè)預(yù)后模型

2.3 驗(yàn)證預(yù)后模型

為了驗(yàn)證TCGA隊(duì)列構(gòu)建預(yù)后模型的穩(wěn)健性，本研究將METABRIC隊(duì)列的患者按照與TCGA隊(duì)列相同的危險(xiǎn)得分公式進(jìn)行計(jì)算，并將計(jì)算的中值分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組,如圖3(a)。與TCGA結(jié)果相似，高風(fēng)險(xiǎn)組的患者早死概率高于低風(fēng)險(xiǎn)組的患者,如圖3(b)。同樣地，生存曲線顯示低風(fēng)險(xiǎn)組的存活率明顯高于高風(fēng)險(xiǎn)組，且P<0.001，如圖3(c)。此外，ROC曲線顯示AUC在1 a內(nèi)為0.66，2 a內(nèi)為0.62，3 a內(nèi)為0.62，如圖3(d)。

(a) METABRIC隊(duì)列中風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的分布和中值

(b) METABRIC隊(duì)列中OS狀態(tài)、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的分布

(c) Kaplan-Meier曲線, METABRIC隊(duì)列中高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組患者的生存率

(d) ROC曲線下面積(AUC)評(píng)測(cè)預(yù)后模型

2.4 16個(gè)基因的獨(dú)立預(yù)后分析

對(duì)可用得臨床指標(biāo)進(jìn)行單因素和多因素Cox回歸分析，以確定風(fēng)險(xiǎn)得分是否可以作為總體生存的獨(dú)立預(yù)后預(yù)測(cè)因子。在單因素Cox回歸分析中，年齡組(>=60 vs<60歲)顯示HR=2.485，95 % CI=1.732～3.566，P<0.001; Stage組(Ⅲ/Ⅳ vs Ⅰ/Ⅱ)顯示HR= 2.429，95 % CI=1.694～3.483，P<0.001；風(fēng)險(xiǎn)得分組(High vs Low)顯示HR= 4.508，95 % CI=2.982～6.816，P<0.001，如圖4(a)。在多因素Cox回歸分析中，年齡組(>=60 vs<60歲)顯示HR= 2.383，95 % CI=1.658～3.425，P<0.001; Stage組(Ⅲ/Ⅳ vs Ⅰ/Ⅱ)顯示HR= 2.229，95 % CI=1.547～3.212，P<0.001；危險(xiǎn)得分組(High vs Low)顯示HR= 3.838，95 % CI=2.541～5.797，P<0.001，如圖4(b)。由此可見(jiàn)，在校正了其他混雜因素后，年齡、Stage、危險(xiǎn)得分均可以作為獨(dú)立的預(yù)后因子。

(a) 單因素回歸分析

(b) 多因素回歸分析

2.5 功能分析

為了探索與風(fēng)險(xiǎn)得分相關(guān)基因的生物學(xué)功能和機(jī)制，本研究采用高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組之間的差異基因進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析。在GO基因富集中，如圖說(shuō)是，差異基因富集在其中一個(gè)和鐵相關(guān)的通路：金屬離子的隔離。此外，還發(fā)現(xiàn)差異基因明顯富集在了與免疫和炎癥反應(yīng)相關(guān)的通路，比如：抗菌體液反應(yīng)，正向調(diào)節(jié)趨化性，白細(xì)胞趨化性，白細(xì)胞趨化的正調(diào)控，白細(xì)胞趨化的調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)趨化作用，并且所有的Padjust<0.05，如圖5(a)。在KEGG功能富集分析中，如圖5(b)所示，其中有3條和炎癥和免疫反應(yīng)機(jī)制相關(guān)的功能通路是明顯富集到的，包括IL-17信號(hào)通路，PPAR信號(hào)通路，補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)。

(b) KEGG分析

為了進(jìn)一步探索在高、低風(fēng)險(xiǎn)兩組間免疫相關(guān)的狀態(tài)是否存在差異，通過(guò)ssGSEA分析對(duì)不同的免疫細(xì)胞和相關(guān)免疫通路進(jìn)行免疫打分(圖6)。如圖6所示，在抗原呈遞過(guò)程方面，發(fā)現(xiàn)aDCs、樹(shù)突狀細(xì)胞(DCs)、巨噬細(xì)胞(Macrophages)、APC_co_inhibition、APC_co_stimulation、MHC_class_I在高、低風(fēng)險(xiǎn)組之間存在顯著差異，且高風(fēng)險(xiǎn)組的免疫得分高于低風(fēng)險(xiǎn)組。此外，ssGSEA分析中，炎癥促進(jìn)(Inflammation-promoting)和副炎癥(Parainflammation)在高風(fēng)險(xiǎn)組的得分明顯高于低風(fēng)險(xiǎn)組，這與KEGG富集在三條炎癥相關(guān)的通路相對(duì)應(yīng)?？傊诰哂酗@著差異的結(jié)果中，除了Mast_cells和Type_II_IFN_Reponse在高風(fēng)險(xiǎn)組的評(píng)分低于低風(fēng)險(xiǎn)組，其他在高風(fēng)險(xiǎn)組的評(píng)分均高于低風(fēng)險(xiǎn)組。

(a) 16個(gè)免疫細(xì)胞

(b) 13個(gè)相關(guān)免疫功能

3 討論

在本研究中，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘和文獻(xiàn)檢索整合了148個(gè)和鐵死亡相關(guān)的基因，并系統(tǒng)地研究了這148個(gè)鐵死亡相關(guān)基因在乳腺癌腫瘤組織中的表達(dá)情況及其與生存預(yù)后的關(guān)系。關(guān)于16個(gè)鐵死亡相關(guān)基因的預(yù)后模型首次被構(gòu)建并在一個(gè)外部隊(duì)列中被驗(yàn)證。此外，在功能分析中，發(fā)現(xiàn)了與免疫相關(guān)的通路被富集。

一些基因可能通過(guò)調(diào)節(jié)某種抑制劑來(lái)誘導(dǎo)或抑制腫瘤的鐵死亡，但它們與患者生存預(yù)后的相關(guān)性仍不清楚。值得注意是，大約79.1 %的鐵死亡相關(guān)的基因在乳腺腫瘤組織和癌旁組織之間有差異表達(dá)，且在這些差異基因中，有20.6 %的基因在單因素回歸COX分析中具有顯著差異，也就是說(shuō)與生存預(yù)后相關(guān)。這表明了鐵死亡在乳腺癌中具有潛在的作用，因此，通過(guò)鐵死亡相關(guān)的基因建立乳腺癌預(yù)后模型是有意義的。

本研究構(gòu)建的預(yù)后模型是由16個(gè)鐵死亡相關(guān)的基因組成，包括CISD1、AIFM2、ALOX15、NCOA4、CHAC1、CS、GPX4、SQLE、CAPG、G6PD、NGB、GCLC、HSBP1、PRDX1、SLC1A4、BNIP3。

CISD1有調(diào)節(jié)線粒體中的鐵和活性氧穩(wěn)態(tài)的作用，通過(guò)調(diào)控mitoNEET蛋白維持線粒體穩(wěn)態(tài)和促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，對(duì)人類(lèi)乳腺癌細(xì)胞增殖起著重要作用[12]。AIFM2在erastin等誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡的過(guò)程中起到了阻斷作用[13]。ALOX15在c-MYC直接調(diào)控下，在腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞中表達(dá)，其抑制作用可阻斷原瘤基因的表達(dá)[14]。NCOA4負(fù)責(zé)將鐵蛋白FTH招募到自噬小體從而使溶酶體降解鐵蛋白、釋放鐵的運(yùn)載蛋白從而可以抑制鐵死亡[5]，并且NCOA4又是乳腺癌的癌基因[15]。CHAC1通過(guò) GCN2-eIF2α-ATF4 pathway通路利用降解谷胱甘肽來(lái)增強(qiáng)胱氨酸饑餓誘導(dǎo)三陰性乳腺癌細(xì)胞的壞死和鐵死亡[16]。CS幾乎存在于所有能進(jìn)行氧化代謝的細(xì)胞中，在erastin誘導(dǎo)鐵死亡中發(fā)生作用，主要是阻止其erastin誘導(dǎo)鐵死亡[17]。由于GPX4具有將脂質(zhì)過(guò)氧化氫轉(zhuǎn)化為無(wú)毒脂質(zhì)醇的作用，因此在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)，GPX4一直被認(rèn)為是抑制鐵死亡作用的主要酶[18]。SQLE可能是乳腺癌的重要預(yù)后因子[19]。CAPG通過(guò)調(diào)節(jié)STC-1轉(zhuǎn)錄過(guò)程，增強(qiáng)乳腺癌轉(zhuǎn)移發(fā)生率[20]。G6PD通過(guò)阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起自噬并且G6PD通過(guò)抑制細(xì)胞自噬影響拉帕替尼對(duì)癌細(xì)胞的作用，此外與患者不良結(jié)局相關(guān)[21-22]。NGB的表達(dá)水平可作為 MCF-7乳腺癌細(xì)胞氧化應(yīng)激的標(biāo)志[23]。GCLC在功能上足以自主地產(chǎn)生他莫昔芬抗性代謝表型，比如：線粒體生物發(fā)生增加；ATP生產(chǎn)增加；谷胱甘肽水平降低。因此，藥物抑制GCLC可能是解決乳腺癌患者對(duì)他莫昔芬產(chǎn)生耐藥性的關(guān)鍵[24]。HSBP1在腫瘤組織中高表達(dá)影響了乳腺腫瘤的侵襲與遷徙，并且與患者的不良預(yù)后有關(guān)[25]。有研究表明，PRDX1下調(diào)可顯著降低MCF-7和ZR-75-1乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)速度[26]。雄激素受體信號(hào)通過(guò)增加谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)體SLC1A4的表達(dá)促進(jìn)谷氨酰胺代謝，這個(gè)基因在乳腺癌中經(jīng)常過(guò)表達(dá)[27]。BNIP3在乳腺腫瘤發(fā)生中起抑癌作用，同時(shí)在某些乳腺癌的亞型中，也可作為腫瘤轉(zhuǎn)移進(jìn)展的預(yù)后指標(biāo)[28]。

總之，這些基因在一定程度上對(duì)乳腺癌的進(jìn)展有促進(jìn)或者抑制的作用，但大部分基因是否通過(guò)鐵死亡機(jī)制來(lái)影響乳腺癌患者的預(yù)后還尚不明確。

在以往的文獻(xiàn)報(bào)道中，腫瘤對(duì)鐵死亡易感性的機(jī)制一直是一個(gè)熱門(mén)的研究領(lǐng)域，但腫瘤免疫與鐵死亡之間的潛在調(diào)節(jié)機(jī)制仍不清楚。筆者對(duì)高、低風(fēng)險(xiǎn)間的差異基因進(jìn)行了GO分析和KEGG分析，發(fā)現(xiàn)許多免疫相關(guān)的生物學(xué)通路和功能被富集。由此可推斷，腫瘤免疫和鐵死亡有密切的聯(lián)系，或者說(shuō)鐵死亡很可能通過(guò)免疫機(jī)制影響了乳腺癌的進(jìn)展。在ssGSEA分析中，發(fā)現(xiàn)抗原呈遞過(guò)程在高、低風(fēng)險(xiǎn)組之間存在顯著差異，這可能是鐵死亡的細(xì)胞，通過(guò)釋放一些信號(hào)，吸引抗原呈遞細(xì)胞，從而發(fā)生抗原呈遞過(guò)程激活免疫應(yīng)激反應(yīng)造成的[29]。此外，在高風(fēng)險(xiǎn)組中，Treg細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及免疫檢查點(diǎn)的評(píng)分顯著增高，這可能是Treg細(xì)胞在乳腺腫瘤組織中逐漸分化，浸潤(rùn)的Treg細(xì)胞的豐度越來(lái)越高，腫瘤惡化程度越來(lái)越深[30]，而在惡性腫瘤中，既往研究已經(jīng)證實(shí)，Treg細(xì)胞是其中重要的免疫抑制細(xì)胞[31]；巨噬細(xì)胞的高評(píng)分可能是能夠被吸附進(jìn)入乳腺乳管中誘發(fā)一系列反應(yīng)，將早期乳腺癌細(xì)胞離開(kāi)乳腺組織擴(kuò)散到機(jī)體其他部位，促進(jìn)早期乳腺癌轉(zhuǎn)移及進(jìn)一步惡化的原因[32]，還有研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞的新型亞群，稱(chēng)為表達(dá)平足蛋白的巨噬細(xì)胞(PoEMs)，它可以改變腫瘤附近的組織，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的擴(kuò)散[33]；免疫檢查點(diǎn)的高評(píng)分可能是乳腺腫瘤細(xì)胞能夠利用被激活的免疫檢查點(diǎn)通路來(lái)逃避免疫系統(tǒng)的識(shí)別，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的惡化[34]。由此可見(jiàn)，Treg細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及免疫檢查點(diǎn)可能與乳腺癌的不良預(yù)后有關(guān)。

本研究還存在著一些局限性。首先，本文所建立的預(yù)后模型，受種族，地域，樣本量等因素限制，因此，模型的穩(wěn)健性還需進(jìn)一步提高。其次，由于臨床數(shù)據(jù)的限制，本文的研究沒(méi)有涉及到乳腺癌的亞型研究，因此對(duì)于指導(dǎo)具體亞型的治療策略的意義有待進(jìn)一步研究。

總之，本研究通過(guò)構(gòu)建16個(gè)與鐵死亡相關(guān)基因預(yù)后模型，并確定了獨(dú)立的預(yù)后因子，這為乳腺癌患者的治療和預(yù)后提供了參考。