牟幼靈，呂京珂，趙瑞，韓麗萍，劉騫

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州 311402）

急性心肌梗死的發(fā)病率和致死率一直居高不下，目前公認的治療手段是恢復(fù)血流再灌注以減少梗死區(qū)心肌壞死，然而再灌注過程誘發(fā)的一系列心肌損傷卻缺少有效的臨床干預(yù)方法［1］。心肌缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷是多種病理機制共同作用的結(jié)果，主要包括炎癥［2］、線粒體障礙［3］、氧化應(yīng)激［4］和微血管障礙［5］等。心臟的高能量需求使得心肌細胞內(nèi)線粒體比例高于其他臟器，維持線粒體穩(wěn)態(tài)在心肌I/R損傷的治療中具有重要作用［6］。研究發(fā)現(xiàn)，心肌I/R損傷與線粒體分裂/融合動態(tài)平衡有密切關(guān)系［7］，再灌注階段動力相關(guān)蛋白1（dynamin-related protein 1，Drp1）激活并參與心肌細胞線粒體的過度分裂，導(dǎo)致線粒體片段化和功能障礙，進一步加重心肌細胞死亡［8］。因此，有效抑制線粒體過度分裂已成為I/R 損傷心肌保護的研究重點，探明線粒體穩(wěn)態(tài)在心肌I/R 損傷中的作用機制將有助于減少心肌細胞死亡提高心?；颊哳A(yù)后。

姜黃（Curcuma longaL.）原產(chǎn)于印度，除作為香料外，還廣泛應(yīng)用于咳嗽、糖尿病性潰瘍、肝膽疾病和關(guān)節(jié)炎等疾病的治療，屬于藥食兩用的藥材［8］。姜黃素（curcumin，Cur）是姜黃的活性成分之一，具有抗炎［9］、抗氧化［10］、降糖［11］、抗衰老［12］和抗腫瘤［13］等多種藥理活性。研究認為，Cur 可能通過抑制心肌細胞炎癥［14］、氧化應(yīng)激［15］和凋亡［16］維持心肌細胞結(jié)構(gòu)和功能，通過Notch［17］和沉默調(diào)節(jié)蛋白3（silent mating type information regulation 2 homolog 3，SIRT3）［18］等信號通路減輕心肌細胞損傷并改善I/R 后心功能。有報道Cur 可減輕星形膠質(zhì)細胞氧化應(yīng)激造成的線粒體損傷和功能障礙［19］，對I/R 后心肌細胞線粒體也有保護作用［20］，但對線粒體形態(tài)的影響仍有待進一步研究。因此，本研究擬通過大鼠心肌細胞H9c2 低氧復(fù)氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）損傷模型探討Cur是否通過抑制線粒體分裂維持線粒體完整性和功能，從而減輕細胞凋亡并發(fā)揮心肌細胞保護作用，以期進一步揭示Cur 對心肌I/R損傷保護的作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和主要儀器

Cur（CAS 號458-37-7，批號110823-201706，HPLC 純度≥98%，中國食品藥品檢定研究院）；胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基和胰蛋白酶（美國Gibco 公司）；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒和丙二醛（malondialdehyde，MDA）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；BCA蛋白濃度測定試劑盒、DAPI熒光探針、ATP檢測試劑盒、兔抗大鼠電壓依賴性陰離子通道蛋白1（voltage-dependent anion channel protein1，VDAC1）單克隆抗體、兔抗大鼠β 肌動蛋白單克隆抗體和辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（H+L）抗體（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；DHE 熒光探針、Mito-Tracker熒光探針和JC-1熒光探針（美國Invitrogen公司）；Calcein-AM 熒光探針（美國Life Technologies公司）；TUNEL檢測試劑盒（美國Roche公司）；兔抗大鼠細胞色素c 單克隆抗體（美國Abcam 公司）；兔抗大鼠活化胱天蛋白酶3 單克隆抗體、兔抗大鼠Drp1 單克隆抗體和兔抗大鼠絲氨酸616 位點磷酸化Drp1（phospho-Drp1，p-Drp1）單克隆抗體（美國Cell Signaling Technology 公司）；Spectra-Max 190 全波長酶標儀（美國MD 公司）；Olympus IX71 熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）；LSM 880共聚焦激光掃描顯微鏡（德國Carl Zeiss公司）。

1.2 細胞和分組

H9c2細胞（中國科學(xué)院細胞庫）置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。使用胰蛋白酶消化對數(shù)生長期細胞，以每孔5×103密度接種于96 孔板或以每孔5×104密度接種于6 孔板。細胞分為5組：細胞對照組、H/R組、H/R+Cur 1，5和10 μmol·L-1組；Cur預(yù)處理H9c2細胞12 h，在低氧小室內(nèi)以低氧條件（94%N2∶5%CO2∶1%O2）孵育16 h，再置于正常培養(yǎng)環(huán)境復(fù)氧培養(yǎng)2 h，建立H/R損傷模型。

1.3 CCK-8法檢測細胞存活率

取1.2 分組細胞，加CCK-8 溶液至每孔終濃度為10%，繼續(xù)孵育2 h，酶標儀測定450 nm 處吸光度（A450nm）值，計算細胞存活率。細胞存活率（%）=（實驗組A450nm-空白組A450nm）/（細胞對照組A450nm-空白組A450nm）×100%。

1.4 LDH漏出量、SOD活性和MDA含量檢測

取1.2 分組細胞，分別按試劑盒檢測說明書測定細胞培養(yǎng)液中LDH 漏出量、細胞SOD 活性和MDA含量。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定各孔細胞總蛋白量，以每g 蛋白樣品中SOD 活性和MDA含量進行統(tǒng)計分析。

1.5 DHE 探針檢測細胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平

取1.2分組細胞，加DHE 熒光探針10 μmol·L-1避光孵育30 min。經(jīng)PBS潤洗后，熒光顯微鏡隨機視野拍照并統(tǒng)計熒光強度。

1.6 MitoTracker探針檢測線粒體形態(tài)、長度和密度

細胞分為3 組：細胞對照、H/R 組和H/R+Cur 10 μmol·L-1組，加MitoTracker熒光探針100 μmol·L-1染色線粒體30 min，PBS 潤洗后，激光共聚焦顯微鏡觀察各組細胞線粒體形態(tài)并拍照，檢測線粒體平均長度（μm）和密度（每100 μm2內(nèi)線粒體數(shù)量）。

1.7 Calcein-AM 探針熒光強度評價線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放程度

按1.6 分組細胞，加Calcein-AM 熒光探針1 μmol·L-1和氯化鈷2 mmol·L-1孵育20 min，PBS潤洗后，熒光顯微鏡隨機視野拍照并統(tǒng)計Calcein綠色熒光強度，用熒光強度表示線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放。

1.8 JC-1探針檢測線粒體膜電位

按1.6 分組細胞，加JC-1 熒光探針2.5 mg·L-1孵育20 min，PBS 潤洗后，熒光顯微鏡隨機視野拍照，JC-1 聚合體（紅色）/JC-1 單體（綠色）熒光強度比值表示線粒體膜電位。

1.9 細胞內(nèi)ATP含量測定

按1.6分組細胞，按試劑盒檢測說明測定細胞內(nèi)ATP含量。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定細胞總蛋白量，以每mg蛋白樣品中ATP含量進行統(tǒng)計分析。

1.10 TUNEL染色檢測細胞凋亡

取1.6 分組細胞，按照試劑盒檢測說明測定TUNEL 陽性細胞數(shù)量，同時加DAPI 熒光探針5 mg·L-1孵育5 min，PBS潤洗后，熒光顯微鏡隨機視野拍照并統(tǒng)計TUNEL 陽性細胞和DAPI 陽性細胞，計算細胞凋亡率。細胞凋亡率（%）=TUNEL 和DAPI雙陽性細胞數(shù)/DAPI陽性細胞數(shù)×100%。

1.11 Western 印跡法檢測細胞內(nèi)Drp1、p-Drp1、活化胱天蛋白酶3、胞漿細胞色素c 和線粒體內(nèi)細胞色素c蛋白表達

取1.6 分組細胞，使用含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解液于冰上裂解H9c2 細胞，BCA 法測定蛋白濃度。各實驗組以等量總蛋白進行SDS-PAGE分離，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。經(jīng)10%脫脂牛奶封閉后，分別使用Drp1（1∶1000）、p-Drp1（1∶1000）、細胞色素c（1∶1000）及活化胱天蛋白酶3（1∶1000）一抗和相應(yīng)二抗（1∶4000）檢測目的蛋白，β 肌動蛋白作為細胞總蛋白的內(nèi)參，VDAC1 作為線粒體總蛋白的內(nèi)參，以目標蛋白與內(nèi)參積分吸光度值比值表示蛋白相對表達水平。

1.12 統(tǒng)計學(xué)分析

所有實驗均獨立重復(fù)3次，使用Minitab 14 軟件進行數(shù)據(jù)分析，實驗結(jié)果數(shù)據(jù)以表示，進行單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Cur對H/R誘導(dǎo)H9c2細胞存活率的影響

如表1 所示，與細胞對照比較，H/R處理后細胞存活率顯著下降（P<0.01）；與H/R組比較，H/R+Cur 5和10 μmol·L-1組細胞存活率顯著提升（P<0.01）。

Tab.1 Effect of curcumin（Cur）on cell viability of H9c2 cells exposed to hypoxia/reoxygenation（H/R）injury by CCK-8 kit

2.2 Cur 對H/R 誘導(dǎo)H9c2 細胞LDH 漏出量、SOD活性和MDA含量的影響

如表2 所示，與細胞對照比較，H/R 處理后H9c2細胞LDH漏出增多（P<0.01），SOD活性降低（P<0.01），MDA 含量增加（P<0.01）；與H/R 組比較，H/R+Cur 5 μmol·L-1組LDH 漏出顯著降低（P<0.05），MDA含量顯著降低（P<0.05）；H/R+Cur 10 μmol·L-1組LDH 漏出顯著降低（P<0.01），SOD活性顯著升高（P<0.01），MDA 含量顯著降低（P<0.01），提示Cur 10 μmol·L-1能顯著減輕細胞損傷和氧化應(yīng)激。

Tab.2 Effect of Cur on lactate dehydrogenase（LDH）leakage，superoxide dismutase（SOD）activity，and malondialdehyde（MDA）content in H9c2 cells exposed to H/R injury

2.3 Cur對H/R誘導(dǎo)H9c2細胞內(nèi)ROS水平的影響

如圖1 結(jié)果所示，與細胞對照（260±28）比較，H/R組細胞內(nèi)ROS水平顯著增加（P<0.01）；與H/R組比較，H/R+Cur 5 和10 μmol·L-1組細胞內(nèi)ROS水平顯著降低（P<0.05，P<0.01）。結(jié)合2.1 和2.2實驗結(jié)果，Cur 10 μmol·L-1表現(xiàn)出顯著細胞保護和抗氧化作用，因此，后續(xù)實驗選擇Cur 10 μmol·L-1研究其對H9c2細胞線粒體形態(tài)和功能的影響及作用機制。

Fig.1 Effect of Cur on reactive oxygen species（ROS）level in H9c2 cells exposed to H/R injury by DHE staining.See Tab.1 for the cell treatment.B was the semiquantitative result of A. ，n=6.＊＊P<0.01，compared with cell control group；#P<0.05，##P<0.01，compared with H/R group.

2.4 Cur對H/R誘導(dǎo)H9c2細胞線粒體形態(tài)、長度和密度的影響

如圖2結(jié)果所示，與細胞對照組比，H/R組細胞線粒體分裂增加，線粒體平均長度減少（P<0.01），線粒體密度顯著降低（P<0.01）；與H/R 組相比，H/R+Cur 10 μmol·L-1組線粒體平均長度增加（P<0.05），線粒體密度顯著增加（P<0.05）。

2.5 Cur 對H/R 誘導(dǎo)H9c2 細胞線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放程度的影響

如圖3所示，與細胞對照細胞比較（62±8），H/R組線粒體內(nèi)Calcein綠色熒光強度顯著降低（18±7，P<0.01），提示線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放增加；與H/R組相比，H/R+Cur 10 μmol·L-1組線粒體綠色熒光強度顯著增加（32±8，P<0.01），提示線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放程度降低。

2.6 Cur對H/R誘導(dǎo)H9c2細胞線粒體膜電位的影響

Fig.2 Effect of Cur on mitochondrial morphology，length and density in H9c2 cells exposed to H/R injury by MitoTracker staining.H9c2 cells were treated with Cur 10 μmol·L-1 before H/R injury，and mitochondrial morphology was detected by MitoTracker（green）.A was the representative fluorescence images of mitochondrial morphology.B and C were the semi-quantitative results of mitochondrial length and density，respectively.，n=60（cells from three biological replicates）.＊＊P<0.01，compared with cell control group；#P<0.05，compared with H/R group.

Fig.3 Effect of Cur on mitochondrial permeability transition pore opening in H9c2 cells exposed to H/R injury by Calcein-AM（green）.See Fig.2 for the cell treatment.

Fig.4 Effect of Cur on mitochondrial transmembrane potential in H9c2 cells exposed to H/R injury by JC-1 staining.See Fig.2 for the cell treatment.

如圖4 所示，與細胞對照比較（3.3±0.8），H/R組JC-1 紅色熒光/綠色熒光強度顯著降低（0.5±0.2，P<0.01），提示線粒體膜電位去極化（圖4）；與H/R 組相比，H/R+Cur 10 μmol·L-1組JC-1 紅色熒光/綠色熒光強度顯著增加（1.5±0.5，P<0.01），表明線粒體膜電位極化水平升高。

2.7 Cur對H/R誘導(dǎo)H9c2細胞ATP含量的影響

如表3 所示，與細胞對照組相比，H/R 組H9c2細胞內(nèi)ATP 含量顯著降低（P<0.01）；與H/R 組相比，H/R+Cur 10 μmol·L-1組ATP含量顯著增加（P<0.05）。

Tab.3 Effect of Cur on ATP content in H9c2 cells exposed to H/R injury

2.8 Cur對H/R誘導(dǎo)H9c2細胞凋亡的影響

如圖5 所示，與細胞對照組相比（3.3±1.8）%，H/R 組TUNEL 和DAPI 雙陽性細胞比例明顯增加〔（34.9±6.8）%，P<0.01〕，提示大量心肌細胞發(fā)生凋亡；與H/R 組比較，H/R+Cur 10 μmol·L-1組細胞凋亡率顯著降低〔（19.6±5.8）%，P<0.01〕。

Fig.5 Effect of Cur on apoptosis of H9c2 cells exposed to H/R injury by TUNEL staining.See Fig.3 for the cell treatment.

2.9 Cur 對H/R 誘導(dǎo)H9c2 細胞Drp1、p-Drp1、活化胱天蛋白酶3、胞漿細胞色素c 和線粒體細胞色素c蛋白表達的影響

如圖6 所示，與細胞對照組相比，H/R 組Drp1、p-Drp1和活化胱天蛋白酶3蛋白表達明顯升高（P<0.01），細胞色素c 從線粒體釋放到細胞漿顯著增加（P<0.01，P<0.05）；與H/R 組比較，H/R+Cur 10 μmol·L-1組Drp1、p-Drp1 和活化胱天蛋白酶3蛋白表達顯著降低（P<0.05），細胞色素c 由線粒體釋放到細胞漿顯著減少（P<0.05）。

Fig.6 Effects of Cur on protein expressions of dynaminrelated protein 1（Drp 1），phospho-Drp 1（P-Drp1），cleaved-caspase3，cytosolic cytochrome c（Cyt c）and mitochondrial Cyt c in H9c2 cells exposed to H/R injury by Western blotting.See Fig.2 for the cell treatment.A2，B2 and C2 were the semi-quantitative results of A1，B2 and C2，respectively.VDAC1：voltage-dependent anion chanel protein 1. ，n=3.＊P<0.05，＊＊P<0.01，compared with cell control group；#P<0.05，compared with H/R group.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，Cur可顯著增加細胞存活率，減少LDH 泄漏，顯著增加SOD 活性，降低細胞內(nèi)MDA和ROS 含量，提示Cur 能減輕心肌細胞H/R 損傷。Cur 可顯著增加線粒體長度和線粒體密度，抑制Drp1激活，降低線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放程度和細胞色素c 從線粒體到細胞漿的釋放，增加線粒體膜電位極化和細胞ATP 水平，顯著降低細胞凋亡率。提示Cur 可調(diào)控線粒體過度分裂，減輕線粒體功能障礙和細胞凋亡。

線粒體是細胞內(nèi)ROS的主要來源，受損的線粒體會形成“合成過量ROS-加劇線粒體損傷-ROS合成過量”的惡性循環(huán)，直至線粒體凋亡和細胞死亡。本研究發(fā)現(xiàn)，Cur可降低細胞氧化應(yīng)激損傷，此現(xiàn)象可能與線粒體保護作用有關(guān)。線粒體除作為細胞能量源外，還具有調(diào)節(jié)細胞免疫、鈣穩(wěn)態(tài)和自噬等作用，并通過調(diào)整其形態(tài)的分裂/融合動態(tài)平衡來發(fā)揮正常功能［21］。一旦線粒體分裂/融合動態(tài)失衡，過度分裂會導(dǎo)致線粒體片段化，從而造成線粒體功能障礙、細胞應(yīng)激以及細胞死亡［22］。本研究發(fā)現(xiàn)，Cur 可抑制線粒體過度片段化，維持線粒體長度，增加線粒體密度。有研究認為，線粒體分裂與Drp1 蛋白的激活密切相關(guān)［23］，Cur 可通過調(diào)節(jié)C2C12 成肌細胞［24］和衰老小鼠腦細胞［25］等多種細胞內(nèi)Drp1 表達以維持線粒體分裂/融合動態(tài)平衡。本研究發(fā)現(xiàn)，Cur 可下調(diào)H9c2 細胞Drp1 表達和磷酸化水平，表明Cur可參與調(diào)控H9c2細胞線粒體分裂進程。線粒體作為ATP合成的主要細胞器，細胞內(nèi)ATP水平是衡量線粒體功能的常用指標之一［26］，本研究發(fā)現(xiàn)，Cur可增加ATP含量，表明其對線粒體功能具有一定的保護作用。線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放程度對于維持線粒體功能具有重要作用，過度開放會導(dǎo)致線粒體膜電位去極化，造成線粒體功能障礙［27］。此外，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔過度開放還會導(dǎo)致細胞色素c 從線粒體釋放到細胞質(zhì)，誘導(dǎo)細胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，Cur 可降低線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放程度，維持線粒體膜電位極化，減少線粒體細胞色素c的釋放，降低細胞凋亡率。

綜上所述，Cur 可明顯改善H9c2 細胞H/R 損傷，其機制可能與抑制Drp1 介導(dǎo)的線粒體分裂，維持線粒體功能，減輕氧化應(yīng)激和細胞凋亡有關(guān)。但本研究均是在離體細胞中進行的，尚未在動物體內(nèi)進行驗證，并且是否與已報道的Notch 和SIRT3 等信號通路有關(guān)，或仍有其他調(diào)控機制的參與，還有待后續(xù)深入研究。