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尿素通道作為新型利尿藥靶點的研究進展

2020-04-14 03:29張順楊寶學(xué)
關(guān)鍵詞:滲透壓尿素紅細(xì)胞

張順,楊寶學(xué)

(北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系,天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室,北京 100191)

利尿藥是臨床上常用藥物,主要用于治療高血壓、心衰和各種水腫性疾病等。其作用靶點在腎,通過增加尿量發(fā)揮利尿作用。但由于傳統(tǒng)利尿藥通過排鈉排水利尿,會導(dǎo)致電解質(zhì)平衡紊亂等副作用??茖W(xué)家們一直在尋找新的利尿藥靶點,研發(fā)新型利尿藥。尿素通道(urea transports,UT)是一種新的利尿藥靶點,其抑制劑有望發(fā)展成為不引起電解質(zhì)平衡紊亂的新型利尿藥。本文擬總結(jié)UT為利尿藥靶點的理論基礎(chǔ)、UT 抑制劑的篩選和評價方法及目前已被發(fā)現(xiàn)的小分子UT 抑制劑,為后續(xù)的以UT為靶點的新型利尿藥研發(fā)提供參考。

1 尿素通道

UT 是一類選擇性通透尿素的膜通道蛋白,在維持腎內(nèi)尿素循環(huán),建立腎髓質(zhì)組織尿素濃度梯度和尿濃縮機制中發(fā)揮重要作用[1-5]。YOU 等[6]于1993 年首先克隆第一個UT-A2 的cDNA。迄今已克隆的UT 分為UT-A 和UT-B 2 個亞家族。UT-A亞家族由Slc14a2基因編碼,包括6 個成員UTA1~UT-A6,其中UT-A1 和UT-A3 表達(dá)在內(nèi)髓集合管末段的上皮細(xì)胞[7-8],UT-A2主要表達(dá)于髓袢降支細(xì)段[9],UT-A4在內(nèi)髓集合管末段表達(dá)(只在大鼠發(fā)現(xiàn))[7],UT-A5 表達(dá)于睪丸間充質(zhì)細(xì)胞[10],UT-A6 表達(dá)于人結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞[11]。UT-B 由Slc14a1基因編碼,廣泛表達(dá)于全身多個組織器官,在腎直小血管內(nèi)皮細(xì)胞、紅細(xì)胞、腦、心、脾、結(jié)腸、睪丸和膀胱等組織表達(dá)水平較高[12]。

1.1 尿素通道的作用

UT 在維持腎內(nèi)尿素循環(huán)和尿液濃縮中發(fā)揮重要作用。在腎集合管,精氨酸血管加壓素通過調(diào)節(jié)水通道蛋白2上膜,增加水的重吸收,而尿素因不能透過集合管近端大部分節(jié)段而不斷被濃縮,在內(nèi)髓集合管末端達(dá)較高濃度。UT-A1 和UT-A3 表達(dá)于內(nèi)髓集合管末端的上皮細(xì)胞,尿素通過UT-A1 和UT-A3進入內(nèi)髓間充質(zhì)組織,間充質(zhì)組織高濃度尿素通過內(nèi)皮細(xì)胞的微孔進入直小血管升支,隨血液向腎皮質(zhì)方向轉(zhuǎn)運,在血管內(nèi)外尿素濃度差的作用下,尿素從直小血管升支進入組織,通過UT-B進入直小血管降支,隨血流再返回內(nèi)髓,從而建立從腎外髓至內(nèi)髓的尿素濃度梯度,以維持從腎皮質(zhì)至腎髓質(zhì)的滲透壓梯度。因此,UT 在維持腎內(nèi)尿素循環(huán)和尿液濃縮機制中發(fā)揮重要作用[13-14](圖1)。

1.2 UT-B晶體結(jié)構(gòu)的解析

圖1 腎內(nèi)各尿素通道(UT)亞型的表達(dá)部位及腎內(nèi)尿素循環(huán)示意圖. DVR:直小血管降支;AVR:直小血管升支;?:尿素移動方向.

UT-B 晶體結(jié)構(gòu)的解析為基于結(jié)構(gòu)尋找及優(yōu)化UT抑制劑提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。UT家族成員的氨基酸序列具有相似的結(jié)構(gòu)特征,通常包含10 個跨膜螺旋,其中UT-A1 包括20 個跨膜螺旋,由2 個UT結(jié)構(gòu)域串聯(lián)而成[15]。每個區(qū)域中前5 個跨膜螺旋與最后5 個跨膜螺旋具有明顯的同源性[16]。而UT 另一個明顯的結(jié)構(gòu)特征是每5個跨膜螺旋都包含一個保守結(jié)構(gòu)域,帶有LPXXTXPF 序列,該序列在選擇性通透尿素過程中發(fā)揮重要作用。研究表明,每個UT每秒可以通透1×104~1×106個尿素分子。UT-B 對甲酰胺和乙酰胺等小分子尿素類似物也具有選擇性通透功能[17]。UT-B 的晶體結(jié)構(gòu)已被解析,其以三聚體狀態(tài)存在于細(xì)胞膜,每一個UT-B 分子結(jié)構(gòu)相當(dāng)于2個結(jié)構(gòu)相似的半圓柱狀結(jié)構(gòu)域相向扣合而成的空心圓柱(圖2A)。UT-B分子圓柱狀結(jié)構(gòu)的中心孔道可選擇性通透尿素和乙酰胺等小分子尿素類似物。這一通道的兩端分別稱為So位點(向細(xì)胞外側(cè)開口)和Si位點(向細(xì)胞內(nèi)側(cè)開口),孔道的中央稱為Sm位點,位于So和Si之間;2個由3個氧原子組成的線性陣列的側(cè)鏈被稱為氧梯。在結(jié)晶過程中加入金原子能影響側(cè)鏈在晶體結(jié)構(gòu)中的位置[18](圖2B、2C)。UT-B的三維結(jié)構(gòu)使尿素分子部分脫水結(jié)合到孔道端口(So或Si位點),并可進一步徹底脫水移動到Sm位點,從而穿過孔道[19]。

2 尿素通道敲除小鼠模型

2.1 UT-B敲除小鼠模型

UT-B 功能性敲除導(dǎo)致尿素選擇性尿濃縮能力下降。2002年,YANG等[12]通過敲除Slc14a1基因的3~6 號外顯子建立了第一個UT-B 敲除小鼠模型。與野生型小鼠相比,UT-B 敲除小鼠的生長和發(fā)育無明顯差異,但尿量增加50%,同時使尿滲透壓降低25%[12]。UT-B敲除模型小鼠的腎內(nèi)髓組織尿素濃度和滲透壓降低,而鈉、鉀和氯等電解質(zhì)濃度正常,且尿濃縮能力下降并不影響其他腎功能和機體的電解質(zhì)平衡,提示UT 功能性缺失可提供阻斷腎內(nèi)尿素循環(huán)引起尿素選擇性利尿。UT-B 全身敲除會導(dǎo)致小鼠血尿素濃度升高[12],尿素在海馬蓄積可引起抑郁樣行為[20-21]。UT-B 的敲除導(dǎo)致了尿素在睪丸的蓄積和雄性生殖系統(tǒng)早熟。此外,UT-B敲除可誘導(dǎo)膀胱尿路上皮細(xì)胞DNA 損傷和凋亡[22-23]。

2.2 UT-A敲除小鼠模型

圖2 脫硫弧菌尿素通道(dvUT)的晶體結(jié)構(gòu)及氨基酸位點[18]. A:dvUT 三聚體結(jié)構(gòu),▲為晶體的3 次對稱軸;B:在N,N′-二甲基脲(DMU)與dvUT結(jié)合位點,金原子與dvUT發(fā)生共結(jié)晶;C:金原子影響氧梯側(cè)鏈在晶體結(jié)構(gòu)中的位置.

UT-A1 在尿素選擇性尿濃縮機制中發(fā)揮重要作用。敲除Slc14a2基因10 號外顯子140 bp 大小的片段獲得UT-A1/A3雙敲除小鼠。與野生型小鼠相比,UT-A1/A3 敲除小鼠尿量增加2 倍,尿滲透壓降低70%。在UT-A1/A3 敲除小鼠中,血漿尿素濃度與正常小鼠無明顯差異,且除腎較小、睪丸較大外,未見其他明顯異常[24-25]。敲除Slc14a2基因位于第12內(nèi)含子的啟動子及部分13號外顯子的一個4 kb的基因片段,建立UT-A2敲除小鼠。在正常條件下或脫水條件下,UT-A2敲除小鼠與野生型小鼠相比,尿量及髓質(zhì)尿素濃度無明顯差異。而在低蛋白飲食(4%蛋白質(zhì))的情況下,UT-A2 敲除小鼠最大尿滲透壓及內(nèi)髓尿素濃度顯著降低[26]。在UT-A1/A3 雙敲除小鼠轉(zhuǎn)入UT-A1 基因,獲得了腎集合管末段只缺失UT-A3基因的小鼠,該小鼠的基礎(chǔ)尿素通透性及尿濃縮能力達(dá)到正常水平,提示UT-A1在腎集合管末段的重要性遠(yuǎn)大于UT-A3[27]。對UT-A1編碼基因Slc14a2的9號外顯子后的“gt”拼接信號進行同義突變,在不影響其他UT-A 成員轉(zhuǎn)錄和翻譯的同時,獲得UT-A1 特異性敲除小鼠。UT-A1敲除小鼠的尿量約為野生型小鼠尿量的3倍,其內(nèi)髓組織液尿素濃度明顯低于野生型小鼠,而Na+,K+和Cl-濃度與野生型小鼠相比無明顯差異。UT-A1敲除小鼠的生長發(fā)育、腎功能指標(biāo)、血電解質(zhì)水平及腎組織結(jié)構(gòu)方面均無明顯異常[28]。

2.3 全部尿素通道敲除小鼠模型

全部UT 敲除只降低尿濃縮能力,無明顯其他表型異常。JIANG 等[29]通過同時敲除Slc14a1和Slc14a2基因的大部分片段,成功構(gòu)建了全部UT敲除小鼠模型。與野生型小鼠相比,模型小鼠日尿量增加近3.5 倍,尿滲透降低約75%。由于敲除了所有UT,尿素在內(nèi)髓集合管末端進入內(nèi)髓組織和通過直小血管進入內(nèi)髓組織減少,髓組織尿素濃度顯著低于野生型小鼠,而內(nèi)髓Na+,K+和Cl-濃度與野生型小鼠無明顯差異,證實UT 功能性敲除通過破壞腎內(nèi)尿素循環(huán),減小內(nèi)髓組織尿素產(chǎn)生的滲透壓梯度,導(dǎo)致尿濃縮能力降低。

2.4 不同尿素通道敲除小鼠模型尿指標(biāo)比較

UT 亞型功能缺失小鼠的相對尿量比較結(jié)果顯示,全部UT 敲除小鼠>UT-A1/A3 雙敲除小鼠≥UT-A1 敲除小鼠>UT-B 敲除小鼠>UT-A3 缺失小鼠>UT-A2 敲除小鼠≥野生型小鼠;相對尿滲透壓排序為:UT-A1/A3 雙敲除小鼠≤全部UT 敲除小鼠

3 尿素通道抑制劑的篩選方法

3.1 紅細(xì)胞裂解篩選模型

由于紅細(xì)胞較易獲得且天然高表達(dá)水通道蛋白1(aquaporin-1,AQP1)和UT-B,紅細(xì)胞裂解篩選模型適用于高通量篩選UT 抑制劑[31]。2007 年,VERKMAN 團隊[31]開發(fā)了一種應(yīng)用紅細(xì)胞裂解高通量篩選UT-B 抑制劑的實驗?zāi)P?,該模型的原理基于紅細(xì)胞膜上AQP1 對水的通透及UT-B對尿素的通透(圖3A)。該篩選模型操作簡單、方便。首先將紅細(xì)胞置于含2 mol·L-1尿素或尿素類似物乙酰胺的磷酸鹽緩沖溶液中孵育2 h,使紅細(xì)胞內(nèi)尿素濃度達(dá)到2 mol·L-1,再將紅細(xì)胞迅速置于等滲磷酸鹽緩沖溶液中。由于紅細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓差的作用,水通過AQP1 快速進入紅細(xì)胞,使紅細(xì)胞體積膨脹。而尿素則在細(xì)胞內(nèi)外尿素濃度差的作用下,快速通過UT-B 轉(zhuǎn)移至細(xì)胞外,使紅細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓迅速到達(dá)平衡,紅細(xì)胞體積恢復(fù)正常。如有UT 抑制劑存在,其將抑制尿素通過UT-B出細(xì)胞,細(xì)胞內(nèi)外保持高滲透壓差,促使水持續(xù)通過AQP1進入細(xì)胞,最終導(dǎo)致紅細(xì)胞脹破。通過檢測紅細(xì)胞破裂所產(chǎn)生的血紅蛋白的量,可發(fā)現(xiàn)對UT 有抑制作用的線索化合物。

3.2 停留實驗

停留實驗(stopped-flow)可用于研究溶液體系的毫秒級動力學(xué)過程,是驗證UT 抑制劑特異性和有效性的常用方法(圖3B)。將紅細(xì)胞懸液與高濃度尿素溶液在stopped-flow儀器混勻小室中快速接觸。細(xì)胞外高濃度尿素形成的高滲透壓促使細(xì)胞內(nèi)水通過AQP1快速流出,導(dǎo)致紅細(xì)胞皺縮,隨后尿素在細(xì)胞內(nèi)外濃度差的作用下進入細(xì)胞,使細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓差發(fā)生逆轉(zhuǎn),導(dǎo)致水回流入紅細(xì)胞中,使細(xì)胞膨脹。紅細(xì)胞的體積變化會影響穿過混勻小室的散射光的量,測量530 nm處90°散射光強度可定量分析細(xì)胞的體積變化,進而計算紅細(xì)胞細(xì)胞膜對尿素的通透性[32]。

3.3 細(xì)胞熒光指示法篩選模型

UT-A1 較UT-B 更適合作為利尿藥靶點,因此需要一種能高通量篩選UT-A1 抑制劑的細(xì)胞模型。FROHLICH 等[33]將UT-A1 基因克隆到pcDNA5/FRT 中,并轉(zhuǎn)染到具有完整翻轉(zhuǎn)酶(flippase,F(xiàn)lp)重組靶位點的Madin-Darby 犬腎細(xì)胞MDCK中。毛喉素和精氨酸血管加壓素可增加UT-A1的磷酸化,促進其從細(xì)胞內(nèi)囊泡轉(zhuǎn)移至質(zhì)膜,介導(dǎo)尿素的跨膜通透。利用14C標(biāo)記的尿素分子觀察穩(wěn)定表達(dá)UT-A1的MDCK細(xì)胞對尿素的通透速率,可檢測UT抑制劑對UT-A1的抑制作用。基于類似的原理,將黃色熒光蛋白YFP-H148Q/V163S,AQP1和UT-A1(或UT-B)基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入MDCK 細(xì)胞系,將MDCK細(xì)胞系培養(yǎng)于黑壁96孔培養(yǎng)板,對Cl-敏感的YFP-H148Q/V163S 能指示細(xì)胞體積的變化。減小細(xì)胞體積可使細(xì)胞內(nèi)Cl-濃度增加,從而導(dǎo)致YFP熒光降低(圖3C)。將細(xì)胞置于尿素溶液中,由于細(xì)胞外尿素濃度引起的滲透壓差變化會驅(qū)使水外流和細(xì)胞的皺縮,進而尿素和水進入細(xì)胞恢復(fù)細(xì)胞的正常體積??赏ㄟ^檢測不同濃度的尿素濃度梯度下熒光信號強度變化,計算細(xì)胞體積的改變速率,分析細(xì)胞膜對尿素通透性,篩選和評價UT-A1抑制劑的作用[34]。

4 已發(fā)現(xiàn)的尿素通道抑制劑

4.1 尿素類似物

適合臨床的新型利尿藥還需進一步研究。1970 年,MACEY 和FARMER[35]研究發(fā)現(xiàn),根皮素可在不顯著改變水滲透系數(shù)的情況下,抑制尿素的滲透系數(shù)。硫脲類等尿素類似物在50~100 mmol·L-1的濃度下可有效改變紅細(xì)胞對尿素的通透速率,也可抑制離體內(nèi)髓集合管對尿素的通透[31,36]。但這些UT 抑制劑的半數(shù)有效劑量過大,缺乏成藥性。2012 年,CIL 等[37]發(fā)現(xiàn),使用尿素類似物二甲基硫脲(圖4A)對UT-A1和UT-B抑制作用的IC50值分別為6.6和3.9 mmol·L-1,可顯著增加尿量,降低尿滲透壓。二甲基硫脲作用迅速、持續(xù)和可逆,對低蛋白飲食的大鼠利尿作用較差,且對血漿Na+,K+和Cl-的水平無明顯影響,提示二甲基硫脲可用于確認(rèn)UT作為利尿藥靶點,但有效劑量太高,不適于新型利尿藥的開發(fā)[31]。隨后,ESTEVA-FONT等[38]測量了36個硫脲類似物對UT-A1和UT-B抑制活性,發(fā)現(xiàn)3-硝基苯基-硫脲(圖4B)對UT-A1 和UT-B 的抑制作用的IC50均為0.2 mmol·L-1;而4-硝基-苯基硫脲是一種選擇性UT-A1 抑制劑,對UT-A1 和UT-B 抑制作用的IC50分別為1.3 和10 mmol·L-1。然而,以上化合物的藥理學(xué)特性較差,在臨床上不適合研發(fā)成為新型利尿藥。

4.2 UT-B小分子抑制劑

圖3 尿素通道抑制劑的篩選和藥效學(xué)評價實驗?zāi)P?A:紅細(xì)胞裂解模型;B:停留實驗(stopped-flow)模型;紅細(xì)胞懸液溶于等滲PBS溶液,而高濃度尿素溶于等滲PBS溶液制成高滲溶液;C:熒光指示方法篩選模型;RBC:紅細(xì)胞;AQP1:水通道蛋白1;YFP:黃色熒光蛋白;→:移動方向.

圖4 已發(fā)現(xiàn)的尿素通道抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu).

UT-B 小分子抑制劑還需進一步改進。迄今,通過對不同小分子化合物庫的高通量篩選,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種具有明顯UT-B 抑制活性的小分子化合物[34]。利用紅細(xì)胞裂解篩選模型,VERKMAN 團隊[31]發(fā)現(xiàn)了近30種小分子UT-B抑制劑,主要包括苯磺酰唑類(圖4C)、苯磺酰胺類(圖4D)、氨基酞嗪類(圖4E)和氨基苯并咪唑類活性化合物(圖4F)。具有苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的化合物(ureainh)-201 對人UT-B 的抑制活性達(dá)微摩爾以下水平(IC50=0.3 μmol·L-1),但對小鼠和大鼠UT-B 的抑制作用弱,藥物濃度25 μmol·L-1仍未顯示出抑制作用,限制了其進一步的動物實驗研究[31]。氨基酞嗪類化合物PU1424,對人和小鼠UT-B 的IC50值分別為0.02和0.69 μmol·L-1,該化合物抑制作用部位在UT-B的So位點,對UT 通透尿素的抑制作用是可逆的[39]。但這些化合物在體內(nèi)均無利尿活性。隨后,YAO等[40]通過紅細(xì)胞裂解模型從10萬個化合物中發(fā)現(xiàn)三唑并噻吩并嘧啶類化合物具有明顯的UT-B抑制活性,其中抑制率最高的化合物為UTBinh-14(圖4G),該化合物對人UT-B和大鼠UT-B的IC50分別為10 和25 nmol·L-1,可完全可逆地抑制尿素的轉(zhuǎn)運。UTBinh-14通過作用于UT-B 通道的細(xì)胞內(nèi)位點,對尿素的轉(zhuǎn)運產(chǎn)生競爭性抑制作用。同時研究發(fā)現(xiàn),UTBinh-14 對UT-B 具有高度選擇性,即使在較高濃度下,對UT-A1也無抑制作用。UTBinh-14由于其在肝微粒體中的快速代謝且對UT-A1 無活性而不適合作為臨床應(yīng)用的利尿藥[34,41]。

4.3 UT-A1小分子抑制劑

已發(fā)現(xiàn)的UT-A1抑制劑雖具有體外抑制活性,但多數(shù)在體內(nèi)無明顯的利尿作用。ESTEVAFONT 等[34]使用YFP,UT-A1 和AQP1 共轉(zhuǎn)染的MDCK細(xì)胞高通量篩選UT-A1小分子抑制劑,發(fā)現(xiàn)了具有UT-A1選擇性或UT-A1/UT-B非選擇性抑制活性的小分子,包括8-羥基喹啉類(圖4H)、氨基噻唑啉類(圖4I)和[1,3,5]三嗪類(圖4J),其非競爭性地抑制對尿素通透。同時,它們對競爭性抑制尿素轉(zhuǎn)運功能的三唑并噻吩并嘧啶類化合物進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化后得到化合物UTA1inh-D1,對UT-A1有較高的選擇性,抑制UT-A1 和UT-B 的IC50值分別為3.8和15 μmol·L-1。同時,他們的研究結(jié)果表明,8-羥基喹啉類、氨基噻唑啉類抑制劑的結(jié)合位點位于細(xì)胞內(nèi)通透尿素的孔隙附近,而[1,3,5]-三嗪類藥物則位于細(xì)胞外通透尿素的孔隙附近。LEE 等[42]發(fā)現(xiàn)的2,7-雙取代芴酮(圖4K)是一種新型的UT-A和UT-B抑制劑,它們與UT-A1在胞質(zhì)的區(qū)域結(jié)合,可非競爭性地、可逆地抑制UT-A1活性。上述抑制劑雖具有體外抑制活性,但在體內(nèi)均無明顯的利尿作用。2018年,LEE等[43]通過高通量篩選發(fā)現(xiàn)了強效的UT-A1 選擇性抑制劑1,2,4-三唑喹喔啉類化合物,其對UT-A1具有強效的抑制作用。其中活性最強的化合物8ay通過芳基醚連接1,2,4-三唑[4,3-α]喹喔啉與苯磺酰胺,以一種非競爭性機制快速、可逆地抑制UT-A1對尿素的通透,其對UT-A1的IC50約為150 nmol·L-1,對UT-B的IC50約為2 μmol·L-1。在8ay體外代謝實驗中發(fā)現(xiàn),喹喔啉環(huán)氧化后產(chǎn)生一種代謝穩(wěn)定的7,8-二氟喹喔啉類似物8bl(圖4L),靜脈注射8bl 4 mg·kg-1可使小鼠尿量增加,尿滲透壓降低。

4.4 UT-A1和UT-B共同小分子抑制劑

UT-A1和UT-B共同小分子抑制劑的口服生物利用度有待提高。2013年,楊寶學(xué)課題組[32]通過高通量篩選發(fā)現(xiàn),噻吩并喹啉類化合物PU21對UT-B和UT-A1 都有抑制作用。計算機分子對接分析提示,PU21 與UT-B 分子的ASN289 形成氫鍵,與LEU285 和ALA327 形成很強的范德華力和疏水作用,分子動力學(xué)模擬預(yù)測PU21 以鉚釘方式結(jié)合在UT-B 的功能對接基團,抑制UT-B 通透尿素,從而發(fā)揮其對UT-B的抑制作用[44]。LI等[45]對噻吩并喹啉類化合物的類似物進行篩選,并經(jīng)結(jié)構(gòu)優(yōu)化后得到活性化合物PU14(圖4M),其對人、大鼠和小鼠的UT-B具有明顯的抑制活性。PU14對UT-B敲除小鼠紅細(xì)胞的尿素通透性無影響,說明PU14 對UT-B 介導(dǎo)的尿素通透性具有特異性的抑制作用。體內(nèi)藥效學(xué)結(jié)果表明,PU14 可劑量依賴性地增加大鼠尿量,降低尿滲透壓。PU14 可降低大鼠腎內(nèi)髓滲透壓及尿素濃度,而不影響非尿素溶質(zhì)的濃度,同時PU14 不影響血Na+,K+和Cl-的水平,說明PU14 在發(fā)揮利尿作用的同時不影響電解質(zhì)平衡[45]。REN 等[46]在對PU14 結(jié)構(gòu)優(yōu)化后,得到對UT-B 和UT-A1 抑制活性更強的化合物PU48(圖4N)。大鼠皮下注射PU48 后,出現(xiàn)劑量依賴性地尿量增多,PU48在大鼠體內(nèi)快速吸收和消除,并迅速到達(dá)其消化道、肝、腎和膀胱等靶器官[47-48]。但因其溶解度差、生物利用度低和無口服利尿活性等限制了PU48的進一步開發(fā)。通過對噻吩并喹啉的結(jié)構(gòu)修飾,ZHAO等[49]和LI等[50]獲得了新型特異性的UT 抑制劑噻吩并吡啶類化合物。通過結(jié)構(gòu)優(yōu)化,得到化合物8NP(圖4O)和CB-20(圖4P),其對UT-A1和UT-B 的抑制活性幾乎相同,且對大鼠有良好的利尿活性,其水溶性明顯優(yōu)于噻吩并喹啉類UT 抑制劑。給動物皮下注射后,CB-20 產(chǎn)生了良好的利尿活性,血中Na+,K+和Cl-未發(fā)生明顯的改變。長期服用CB-20 可持續(xù)穩(wěn)定地增加尿量。同時,CB-20在大鼠體內(nèi)吸收良好且清除速率較快。但也因其口服生物利用度過低,不宜于進行藥物開發(fā)。

4.5 口服尿素通道小分子抑制劑

口服給藥是一種比較適于臨床長期治療的給藥方式,其具有給藥方式簡便快捷,由胃腸道吸收,不引起皮膚或黏膜損傷等優(yōu)點。為獲得具有口服活性的UT抑制劑,ZHANG等[51]根據(jù)藥物化學(xué)的原理篩選了1040 種具有疏水性結(jié)構(gòu)的小分子尿素類似物,并發(fā)現(xiàn)具有二芳基酰胺母核的新型UT 抑制劑,其中化合物1H 是目前發(fā)現(xiàn)的第一個具有口服利尿作用的UT 抑制劑。灌胃給予100 mg·kg-1的1H 后,大鼠尿量明顯增加而尿滲透壓明顯降低,給藥后第0~2 小時出現(xiàn)顯著性差異,給藥后第2~4 小時差異最明顯,利尿效果可持續(xù)6 h,而非尿素溶質(zhì)的排泄量無明顯變化。而連續(xù)給藥的結(jié)果顯示,1H可持續(xù)性地增加大鼠尿量、降低尿滲透壓,不影響非尿素溶質(zhì)的排泄量。1H連續(xù)給藥后,大鼠腎內(nèi)髓組織滲透壓和尿素濃度明顯降低,而非尿素溶質(zhì)的濃度無明顯變化,說明1H 主要是通過影響內(nèi)髓組織尿素濃度影響腎內(nèi)髓組織滲透壓梯度。1H 對大鼠UT-A1的IC50(0.097 μmol·L-1)明顯低于對UT-B的IC50(0.64 μmol·L-1),是UT-A1高選擇性的UT抑制劑。分別灌胃給予UT-A1敲除小鼠和UT-B 敲除小鼠100 mg·kg-1的1H,發(fā)現(xiàn)UT-B敲除小鼠在給藥后尿量明顯增加,而UT-A1敲除小鼠的尿量無顯著變化,驗證了1H對UT-A1的選擇性。使用Caco-2細(xì)胞模型發(fā)現(xiàn),1H具有良好的膜通透性,在人胃腸道中具有良好的吸收效果。大鼠體內(nèi)藥動學(xué)結(jié)果顯示,1H在大鼠胃腸中吸收良好,血藥濃度迅速達(dá)到有效水平。血清學(xué)指標(biāo)檢測發(fā)現(xiàn),1H不導(dǎo)致傳統(tǒng)利尿藥引起的低鉀血癥、低鈉血癥和高尿酸血癥等不良反應(yīng),也不影響正常腎功能及糖代謝、脂質(zhì)代謝等生理學(xué)過程。然而,1H的口服生物利用度為4.38%,需要通過改進劑型、結(jié)構(gòu)優(yōu)化等方式進一步改善其成藥性。

5 結(jié)語

綜上所述,由于目前臨床上常用的利尿藥普遍存在電解質(zhì)失衡等不良反應(yīng),研究人員正試圖以UT 為新的利尿藥靶點研發(fā)新型利尿藥。然而目前尚無UT 抑制劑在臨床上用于患者的治療。對UT抑制劑的研發(fā)存在一定的困難:由于UT-B 和UT-A1 結(jié)構(gòu)具有相似性,難以發(fā)現(xiàn)高選擇性抑制UT-A1 的UT 抑制劑;UT-A1 的晶體結(jié)構(gòu)尚未被解析,阻礙了基于結(jié)構(gòu)的UT 抑制劑的研發(fā);肝硬化、心衰等低鈉性水腫疾病模型的造模方法穩(wěn)定性較差,阻礙了UT抑制劑在疾病模型中的研究;尋找一種口服活性較好且生物利用度高的UT抑制劑是新型利尿藥研發(fā)的瓶頸。具有口服利尿活性的化合物1H 的發(fā)現(xiàn)為UT 抑制劑在臨床的應(yīng)用帶來了希望,然而1H仍存在血漿穩(wěn)定性差等缺點,尚需對其進行進一步的結(jié)構(gòu)優(yōu)化。隨著對UT-A1 結(jié)構(gòu)解析以及基于結(jié)構(gòu)的藥物篩選方法、化合物結(jié)構(gòu)優(yōu)化技術(shù)等不斷成熟,加之藥理學(xué)、藥物化學(xué)、藥動學(xué)和藥劑學(xué)等學(xué)科的不斷發(fā)展,必將會成功研發(fā)出以UT為靶點的新型利尿藥,其可用于治療充血性心衰、肝硬化腹水、腎病綜合征等低鈉性水腫相關(guān)疾病。

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