劉 潔 彭 微 劉 懷 徐筱紅 李媛彬 羅庚求

1 湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部，湖南省株洲市 412000； 2 中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系

結(jié)腸癌是我國(guó)最常見消化道腫瘤之一，隨著飲食習(xí)慣的改變，近幾年來結(jié)腸癌的發(fā)病率與死亡率逐年上升，且越來越年輕化。近年來miRNA的研究已成為腫瘤學(xué)領(lǐng)域的新熱點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究表明在結(jié)腸癌患者組織miR-21呈高表達(dá)，并其表達(dá)與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，揭示miR-21作為一個(gè)致癌miRNA，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用[1-2]。

目前治療惡性腫瘤的主要手段仍然是手術(shù)和化療，但是有部分患者對(duì)化療藥物不敏感，從而使化療的療效不明顯。因此，提高惡性腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性已經(jīng)成為腫瘤研究一個(gè)重要方面，也是提高化療療效的主要方法。多項(xiàng)研究表明在多種腫瘤中包括結(jié)腸癌中miR-21高表達(dá)與治療療效不佳、預(yù)后差顯著相關(guān)，抑制腫瘤細(xì)胞中miR-21的表達(dá)可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療的敏感性。而我們前期研究也證實(shí)結(jié)腸癌晚期患者血漿中 miR-21 表達(dá)水平不同對(duì)化療藥物的療效也不相同，提示血漿 miR-21 有望成為預(yù)測(cè)化療藥物療效的敏感性指標(biāo)。另外在多種癌中，已證實(shí)miR-21作用于靶基因PTEN，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散及侵襲[3]。同時(shí)miR-21通過作用于其靶基因PTEN在許多腫瘤細(xì)胞的耐藥中發(fā)揮作用[4]。

因此，我們?cè)谇捌谝延泄ぷ骰A(chǔ)上從臨床和細(xì)胞學(xué)兩個(gè)方面進(jìn)行研究，旨在提示結(jié)腸癌中miR-21和PTEN聯(lián)合檢測(cè)可成為有效的輔助預(yù)測(cè)化療療效的敏感指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本采集:經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審查通過收集株洲市中心醫(yī)院經(jīng)病理組織和影像學(xué)檢查診斷為Ⅲ期結(jié)腸癌患者40例，其中男24例，女16例，年齡45～75歲，中位年齡58歲。這40例患者術(shù)前均未接受過任何治療。在患者填寫知情同意書后，采集這40例結(jié)腸癌患者化療前的病理組織切片。所有患者入院后進(jìn)行FOLFOX4方案化療，化療方案每2周重復(fù)10次，6個(gè)周期化療后進(jìn)行療效評(píng)估。

1.1.2 細(xì)胞來源：結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫)。

1.1.3 試劑：10%小牛血清的RPMI-1640、DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)；Lipofectamine TM 2000轉(zhuǎn)染試劑(美國(guó)Invitr-ogen公司)；引物及U6內(nèi)參(上海生工生物工程公司)；總RNA提取試劑盒(日本TaKaRa公司)；qPCR QuantitationKit試劑盒(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)；PTEN抗體(美國(guó)Cell Signaling公司)；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗、兔抗人β-actin(美國(guó)Santa Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 qRT-PCR法檢測(cè)結(jié)腸癌組織miR-21表達(dá)：按試劑盒說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，然后開展熒光定量PCR。所有標(biāo)本檢測(cè)3次。以U6作為內(nèi)參基因。

1.2.2 免疫組化測(cè)定PTEN表達(dá)：用已知陽性切片作陽性對(duì)照，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。PTEN 表達(dá)于細(xì)胞核或質(zhì)中，按照每個(gè)視野中陽性細(xì)胞數(shù)占全部細(xì)胞數(shù)的比例將判斷標(biāo)準(zhǔn)分4級(jí)：≤10%為-，> 10%且≤50%為+，>50%且≤75 %為++，>75%為+++。

1.2.3 細(xì)胞的分組及處理：對(duì)數(shù)增殖期的SW480細(xì)胞，用濃度(0.06μg/ml)作用48h后棄去含藥的培養(yǎng)液，加入新鮮的培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)：待其恢復(fù)正常，消化傳代后繼續(xù)用0.06μg/ml的藥物濃度處理48h，如此反復(fù)，每個(gè)濃度重復(fù)3～5次,然后提高濃度梯度，最終使細(xì)胞耐受濃度為0.8μg/ml，并將該株細(xì)胞始終處于0.8μg/ml順鉑作用下，以穩(wěn)定耐藥性能；細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟如下：SW480細(xì)胞經(jīng)過0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對(duì)數(shù)增殖期細(xì)胞2×105個(gè)接種于6孔板，用250μl無血清RPMI-1640稀釋LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑8μl和miR-21抑制劑12.5μl，室溫靜置5min，然后將轉(zhuǎn)染試劑與稀釋miR-21抑制劑混合，室溫下靜置20min后，分別鋪到6孔板中，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.2.4 Western blot(免疫印跡)檢測(cè)PTEN蛋白:首先進(jìn)行總蛋白的提取。用Bio-Rad凝膠成像顯色儀行發(fā)光檢測(cè)，Quantity One軟件顯色凝膠圖像的光吸光度。以β-actin蛋白為內(nèi)參照，以PTEN條帶與β-actin條帶吸光度值的比值表示。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定各組細(xì)胞凋亡率:首先消化細(xì)胞，再用培養(yǎng)基洗脫細(xì)胞，1 000r/min離心10min收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，75%乙醇(冰預(yù)冷)固定，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞的凋亡率。

1.2.6 療效評(píng)估標(biāo)準(zhǔn):按照WHO制定的實(shí)體瘤客觀療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)分為完全緩解(Complete response,CR)、部分緩解(Partial response,PR)、疾病穩(wěn)定(Stable disease,SD)、疾病進(jìn)展(Progressive disease,PD)?？傆行蔙R為(CR+PR)%。CR或PR者4周后復(fù)查CT進(jìn)行療效確認(rèn)。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌組織中miR-21和PTEN的表達(dá)情況 miR-21在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織(P<0.05)，見表1。PTEN表達(dá)于細(xì)胞核或漿中，呈棕黃色。PTEN在結(jié)腸癌組織中陽性率顯著低于癌旁組織(P<0.05)，見表1，而且miR-21與PTEN的表達(dá)之間呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)；另外miR-21在40例結(jié)腸癌患者的表達(dá)與腫瘤的分化程度有關(guān)(P<0.05)。

表1 miR-2和PTEN在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)情況

注:癌旁正常組織與結(jié)腸癌組織比較,*P<0.05。

2.2 結(jié)腸癌組織中miR-21和PTEN表達(dá)與化療藥物療效的相關(guān)性 結(jié)腸癌組織化療前miR-21的表達(dá)在(CR+PR)組的表達(dá)量低于(PD+SD)組，而PTEN在(CR+PR)組的陽性率高于(PD+SD)組，P<0.001。見表2。

表2 化療前組織中miR-21和PTEN表達(dá)與化療藥物療效的相關(guān)性分析

注：兩組相比，*P<0.05。

2.3 qRT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞miR-21的表達(dá) 結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480組(對(duì)照組)、轉(zhuǎn)染miR-21抑制劑抑制組以及耐藥細(xì)胞組，發(fā)現(xiàn)耐藥細(xì)胞組miR-21表達(dá)高于對(duì)照組(P<0.001)，明顯高于轉(zhuǎn)染抑制組(P<0.001)，而對(duì)照組miR-21表達(dá)高于轉(zhuǎn)染抑制組(P<0.001)。見表3。

表3 qRT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞miR-21的表達(dá)

注：與對(duì)照組相比，*P<0.001;與對(duì)照組和抑制組相比，#P<0.001。

2.4 Western blot檢測(cè)各組PTEN的表達(dá) PTEN 蛋白在轉(zhuǎn)染抑制組表達(dá)量為1.65±0.07，顯著高于對(duì)照組的1.00±0.05(P<0.001),耐藥細(xì)胞組中的表達(dá)量為0.60±0.10,顯著低于對(duì)照組和轉(zhuǎn)染抑制組(P<0.001)。見圖1。

圖1 Western blot檢測(cè)各組PTEN的表達(dá)

2.5 流式細(xì)胞儀測(cè)定各組細(xì)胞的凋亡率 耐藥組細(xì)胞凋亡率明顯低于轉(zhuǎn)染抑制組(P<0.001)，也低于對(duì)照組(P<0.001)，而對(duì)照組細(xì)胞凋亡率明顯低于轉(zhuǎn)染抑制組(P<0.001)。見表4。

表4 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定各組細(xì)胞凋亡率的比較結(jié)果

注：與對(duì)照組相比，*P<0.001;與對(duì)照組和抑制組相比，#P<0.001。

3 討論

結(jié)腸癌是我國(guó)十大惡性腫瘤之一，其常見的治療手段之一就是化療，但很多結(jié)腸癌尤其是中晚期結(jié)腸癌患者的化療效果不佳，主要原因是對(duì)化療藥物不敏感，因此提高化療藥物敏感性是當(dāng)前醫(yī)療工作者急需解決的問題。

miR-21作為microRNA的一個(gè)重要分子，在多種腫瘤中表達(dá)均增高，并與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和凋亡有密切關(guān)系。而同時(shí)發(fā)現(xiàn)miR-21與腫瘤的耐藥也有密切關(guān)系，在多種耐藥的腫瘤細(xì)胞中miR-21的表達(dá)增高。PTEN是重要的抑癌基因之一，它能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)、侵襲及轉(zhuǎn)移，同時(shí)其也是miR-21重要的靶基因之一。抑制腫瘤細(xì)胞中miR-21的表達(dá)，PTEN表達(dá)會(huì)相應(yīng)上調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤細(xì)胞中，miR-21通過下調(diào)PTEN表達(dá)水平增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥[5-9]。

本研究從臨床和細(xì)胞學(xué)兩個(gè)方面進(jìn)行研究：發(fā)現(xiàn)miR-21和PTEN的表達(dá)在結(jié)腸癌組織和癌旁組織中有差異，而且在結(jié)腸癌組織中miR-21與PTEN的表達(dá)之間呈負(fù)相關(guān)；結(jié)腸癌晚期患者進(jìn)行化療后療效評(píng)估，發(fā)現(xiàn)化療前組織miR-21的表達(dá)和PTEN的表達(dá)在(CR+PR)組的表達(dá)量不同于(PD+SD)組；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組、轉(zhuǎn)染抑制組以及耐藥細(xì)胞組，各組細(xì)胞miR-21、PTEN的表達(dá)、細(xì)胞凋亡率都存在差異，當(dāng)抑制miR-21表達(dá)時(shí)PTEN表達(dá)增高，并且耐藥細(xì)胞組中miR-21表達(dá)明顯高于對(duì)照組，PTEN表達(dá)則明顯低于對(duì)照組，凋亡率也是耐藥組最低。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果再次證實(shí)PTEN為miR-21的靶基因，另外也表明miR-21可能通過作用于PTEN來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡從而參與結(jié)腸癌細(xì)胞的耐藥，提示結(jié)腸癌中miR-21和PTEN聯(lián)合檢測(cè)可成為有效的輔助預(yù)測(cè)化療療效的敏感指標(biāo)，為耐藥的腫瘤患者帶來福音，可能為腫瘤的治療提供新的途徑。