董晶晶 劉富崗 郝鵬飛

1 河南省鄭州市第六人民醫(yī)院藥務(wù)科 450000； 2 河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院； 3 南陽(yáng)理工學(xué)院 張仲景國(guó)醫(yī)國(guó)藥學(xué)院

瓜子金，系蕓香目遠(yuǎn)志科遠(yuǎn)志屬植物的帶根全草，氣微，味微辛苦[1]；始載于《植物名實(shí)圖考》，主要分布于華北、華中、西南等地，在河南南陽(yáng)桐柏山區(qū)也有發(fā)現(xiàn)；該藥材內(nèi)服主治活血散瘀，外用主治疔瘡癤腫，民間應(yīng)用較為廣泛，具有潛在的科研、經(jīng)濟(jì)價(jià)值[2]。本研究以瓜子金為研究對(duì)象，主要探討其不同萃取部位對(duì)人肝細(xì)胞(LO2)膽固醇、甘油三酯代謝的干預(yù)情況，為瓜子金藥材的臨床應(yīng)用提供初步理論基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Lambda 750型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(美國(guó)珀金埃爾默股份有限公司)；XH-100A型電腦微波萃取儀(北京祥鵠科技發(fā)展有限公司)；BT25S型分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；Synergy2酶標(biāo)儀(基因有限公司)；CKX31型倒置顯微鏡(奧林巴斯有限公司)；HCB-1300V型垂直層流潔凈工作臺(tái)(青島海爾特種電器有限公司)等。

1.2 試劑 小牛血清白蛋白、胎牛血清(杭州四季青有限公司)；油酸、膽固醇、25-羥膽固醇、洛伐他汀、非諾貝特(Sigma 公司)；總膽固醇測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所)。兔抗人SREBP-2、HMG-COA、LXRa一抗(Santa Cruz公司)；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗、LO2細(xì)胞(武漢博士德生物工程有限公司)；MTT、DMEM培養(yǎng)液、Western blot熒光檢測(cè)試劑盒(Hyclone-Pierce公司)；胰酶(Boster)；RAPI蛋白提取試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)。

1.3 試藥 瓜子金采自河南省南陽(yáng)市桐柏山區(qū)，經(jīng)南陽(yáng)理工學(xué)院張仲景國(guó)醫(yī)國(guó)藥學(xué)院黃顯章副教授鑒定為遠(yuǎn)志科遠(yuǎn)志屬植物瓜子金(Polygala japonica Houtt.)。

2 方法與步驟

2.1 供試品的制備 稱(chēng)取已粉碎的瓜子金干燥全草100g，置索氏提取器中，以80%的乙醇連續(xù)回流提取3h，得母液，而后回收溶劑至無(wú)醇味，得到浸膏；以適量水混懸浸膏，并分別用環(huán)己烷、二氯甲烷、水飽和正丁醇三種溶劑萃取，進(jìn)而得到環(huán)己烷部位、二氯甲烷部位、正丁醇部位及水部位；全部回收溶劑后，分別得到干燥固體：環(huán)己烷部位(Ⅰ)1.08g、二氯甲烷部位(Ⅱ)1.35g、正丁醇部位(Ⅲ)2.27g、水部位(Ⅳ)3.11g。

2.2 試劑的配置

2.2.1 藥物的配置：精密稱(chēng)?、?、Ⅱ、Ⅲ部位5.00mg分別溶于100μl DMSO中，精密稱(chēng)?、舨课?.00mg溶于100μl超純水中；各自混勻后0.22μm濾膜濾過(guò)細(xì)菌，分裝，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 陽(yáng)性對(duì)照藥的配置：取洛伐他汀、非諾貝特膠囊中粉末，研細(xì)后根據(jù)每粒膠囊所含成分，計(jì)算所需粉末質(zhì)量，最終濃度均為1×10-5mol/L。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1 細(xì)胞的培養(yǎng)：LO2細(xì)胞依傳統(tǒng)培養(yǎng)方法[3]，在37℃、5%CO2及飽和濕度條件下，培養(yǎng)于10%胎牛血清的DMEM中；當(dāng)細(xì)胞鋪滿(mǎn)細(xì)胞瓶后，用胰酶進(jìn)行消化傳代。

2.3.2 MTT檢測(cè)不同部位對(duì)LO2細(xì)胞增殖的影響：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LO2細(xì)胞，以0.25%的胰酶消化后，接種于96孔板，每孔約2×103個(gè)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24h；之后，加入不同濃度梯度的各萃取部位，分別為0.1、0.2、0.4、0.8、1.6mg/ml；另設(shè)空白組(無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基)、陰性對(duì)照組(溶劑組)；每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48h后，每孔加入10μl MTT試液，再次孵育4h，除去上清，每孔加入150μl DMSO，振蕩15min，并于酶標(biāo)儀測(cè)定490nm處OD值。再依據(jù)以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率：

2.3.3 LO2高膽固醇細(xì)胞模型的建立[4]：細(xì)胞正常傳代后，于10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后，棄去原培養(yǎng)基，改以1% BSA培養(yǎng)，同時(shí)加入10μg/ml膽固醇+1μg/ml 25-羥膽固醇作用24h后即得。

2.3.4 LO2高甘油三酯細(xì)胞模型的建立[4]：細(xì)胞正常傳代后，于10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后，棄去原培養(yǎng)基，改以1% BSA 培養(yǎng)，同時(shí)加入50μmol/L的油酸作用24h后即得。

2.3.5 藥物對(duì)LO2細(xì)胞脂代謝的影響：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LO2細(xì)胞，以0.25%的胰酶消化后，接種于96孔板，每孔約2×103個(gè)，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24h；依照“2.3.3”“2.3.4”項(xiàng)下方法造模完成之后，加入不同濃度的各萃取部位，另設(shè)空白組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組(高膽固醇模型選洛伐他汀、高甘油三酯模型選非諾貝特)；培養(yǎng)24h后，傾去上清液，以PBS清洗2次后，以裂解液裂解，裂解好的液體不離心直接分別按照總膽固醇、總甘油三酯測(cè)定試劑盒操作步驟進(jìn)行加樣，然后于酶標(biāo)儀下比色，記錄數(shù)值后按照下列公式分別計(jì)算總膽固醇、總甘油三酯含量：

÷待測(cè)樣本蛋白濃度

L)÷待測(cè)樣本蛋白濃度

2.3.6 藥物對(duì)HMG-COA還原酶、SREBP-2、LXRa的影響：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LO2細(xì)胞，分別設(shè)置空白組、模型組和各萃取部位組，給藥培養(yǎng)24h后，以RAPI試劑盒提取總蛋白，BCA法對(duì)總蛋白進(jìn)行定量；然后配膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，再用相應(yīng)的一抗4℃孵育過(guò)夜，TBST溶液洗滌后換對(duì)應(yīng)的二抗，于搖床上低溫低速搖動(dòng)1h，再次用TBST洗膜3次；取ECL 發(fā)光試劑A液、B液按1∶1混勻，均勻滴加至膜上，除去多余發(fā)光液，待NC膜晾干后顯影、定影，最后將NC膜放入成像儀中采集圖像，以軟件Quantity One分析條帶灰度值。

3 結(jié)果

3.1 各萃取部位對(duì)LO2細(xì)胞增殖的影響 由圖1可知，各萃取部位對(duì)LO2細(xì)胞增殖的影響隨濃度的上升而逐漸加大，其中Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ萃取部位隨濃度變化較緩，而Ⅰ部位對(duì)其影響在0.8mg/ml時(shí)呈現(xiàn)顯著性差異，故Ⅰ部位的給藥濃度應(yīng)該控制在0.4mg/ml以下。而根據(jù)該結(jié)果，選取細(xì)胞存活率約90%時(shí)的藥物濃度為中濃度，以其1/2倍濃度為低濃度，以其2倍濃度為高濃度；最終選定Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ萃取部位中濃度為0.4mg/ml，而Ⅰ部位中濃度為0.2mg/ml。

圖1 各萃取部位對(duì)LO2細(xì)胞增殖的影響

3.2 各萃取部位對(duì)LO2細(xì)胞膽固醇代謝的影響 由圖2可知，模型組總膽固醇量較空白組呈顯著性差異，表明造模成功；而陽(yáng)性對(duì)照藥洛伐他汀對(duì)LO2細(xì)胞高膽固醇模型有降低作用，相較模型組呈現(xiàn)顯著性差異；而在各萃取部位中，Ⅰ、Ⅱ部位的降膽固醇作用僅在高劑量呈現(xiàn)顯著性差異，低、中劑量無(wú)顯著性差異；Ⅲ部位的作用在中劑量時(shí)就表現(xiàn)出顯著性差異，并且隨著劑量加大，其降膽固醇的作用越明顯；Ⅳ部位各劑量下均未呈現(xiàn)顯著性差異。

圖2 各萃取部位對(duì)LO2膽固醇代謝的影響

3.3 各萃取部位對(duì)LO2細(xì)胞甘油三酯代謝的影響 由圖3可知，模型組總甘油三酯量較空白組呈顯著性差異，表明造模成功；陽(yáng)性對(duì)照藥非諾貝特對(duì)LO2細(xì)胞高甘油三酯模型有降低作用，相較模型組呈現(xiàn)顯著性差異；在各萃取部位中，Ⅰ、Ⅳ部位在各劑量下對(duì)LO2細(xì)胞的高甘油三酯模型的降低作用均未呈現(xiàn)顯著性差異；而Ⅱ、Ⅲ部位在中、高劑量時(shí)，對(duì)高甘油三酯模型的降低作用呈現(xiàn)顯著性差異，且Ⅱ部位的效果優(yōu)于Ⅲ部位。

圖3 各萃取部位對(duì)LO2甘油三酯代謝的影響

3.4 藥物在高膽固醇模型中對(duì)HMG-COA還原酶、SREBP-2、LXRa的影響 依據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，只有Ⅱ、Ⅲ部位對(duì)LO2細(xì)胞脂代謝的干預(yù)作用呈現(xiàn)顯著性差異，故而，該部分僅討論這兩個(gè)部位對(duì)HMG-COA還原酶、SREBP-2、LXRa的影響。

由圖4、6可知，在高膽固醇模型中，Ⅱ部位僅會(huì)降低HMG-COA的表達(dá)，且對(duì)其影響有顯著性差異；Ⅲ部位除了降低HMG-COA、SREBP-2的表達(dá)之外，還可提高LXRa蛋白的含量，且三者均有顯著性差異。由圖5、7可知，在高甘油三酯模型中，Ⅱ部位、Ⅲ部位對(duì)于HMG-COA的表達(dá)均無(wú)影響，但兩者均可降低SREBP-2蛋白的表達(dá)，并呈顯著性差異；另Ⅱ部位還可顯著降低LXRa的表達(dá)。

圖4 高膽固醇模型Western-Blot結(jié)果圖

圖5 高甘油三酯模型Western-Blot結(jié)果圖

圖6 高膽固醇模型Western-Blot相對(duì)灰度

圖7 高甘油三酯模型Western-Blot相對(duì)灰度

4 討論

綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，Ⅱ部位和Ⅲ部位在不同的模型中，對(duì)HMG-COA、SREBP-2和LXRa的影響也是不同的：在高膽固醇模型中，Ⅱ部位和Ⅲ部位均可顯著降低細(xì)胞中HMG-COA還原酶蛋白的表達(dá)，Ⅱ部位對(duì)SREBP-2蛋白和LXRa的影響無(wú)顯著性差異，Ⅲ部位則表現(xiàn)出降低SREBP-2而升高LXRa的作用；在高甘油三酯模型中，Ⅱ部位和Ⅲ部位均對(duì)HMG-COA無(wú)影響且降低SREBP-2的表達(dá)，另Ⅱ部位對(duì)LXRa表達(dá)的降低呈顯著性差異。

HMG-COA還原酶是膽固醇合成過(guò)程的關(guān)鍵限速酶，許多調(diào)節(jié)膽固醇的藥物都是通過(guò)調(diào)節(jié)該酶達(dá)到治療效果，它的下調(diào)可直接導(dǎo)致膽固醇合成的減少[5-8]；SREBPs系列為膽固醇調(diào)節(jié)元件蛋白，通過(guò)Insig-Srebp-Scap途徑對(duì)細(xì)胞內(nèi)膽固醇進(jìn)行反饋調(diào)節(jié)，該蛋白的下調(diào)會(huì)通過(guò)HMG-COA及LDLR影響胞內(nèi)膽固醇的含量[9-12]；LXRa則屬于廣泛分布于肝細(xì)胞中的核受體，該受體主要參與糖脂代謝，與脂肪酸的合成及膽固醇的逆轉(zhuǎn)運(yùn)關(guān)系緊密，當(dāng)該受體被激活時(shí)，一方面會(huì)通過(guò)影響SREBPs而促使膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)以及加速生成膽汁酸促進(jìn)膽固醇的排放，從而降低胞內(nèi)膽固醇含量；另一方面會(huì)直接作用于FAS、ACC，而促進(jìn)脂肪酸的合成及釋放；故而當(dāng)藥物作用于這三者時(shí)，定將引起細(xì)胞內(nèi)脂代謝的一系列變化[13-15]。

Ⅱ部位、Ⅲ部位對(duì)LXRa的調(diào)節(jié)作用完全相反，筆者猜測(cè)可能是兩者作用于LXRa不同的上游因子所引起，抑或是作用于LXRa不同的受體所致；Ⅱ部位主要通過(guò)降低LXRa的含量繼而實(shí)現(xiàn)其較為強(qiáng)大的調(diào)節(jié)甘油三酯的能力，而Ⅲ部位主要通過(guò)升高LXRa的含量從而加速膽固醇的排出，為接下來(lái)的逆轉(zhuǎn)運(yùn)做好準(zhǔn)備；兩者對(duì)該受體不同的作用，導(dǎo)致兩者在LO2細(xì)胞中調(diào)節(jié)膽固醇、甘油三酯的能力的不同。而具體兩者作用于何種因子而誘發(fā)LXRa不同的表達(dá)，調(diào)節(jié)膽固醇和甘油三酯的機(jī)制又是如何，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)探索證實(shí)。