陳燦金，葉在秉，阮煜，童洪飛，倪仲琳，趙亞新

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院/育英兒童醫(yī)院 外科，浙江 溫州 325027）

肝癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，臨床上以肝細(xì)胞癌最多見(jiàn)，其治療困難，又極易復(fù)發(fā)[1-2]。索拉非尼是治療晚期肝癌的重要藥物[3-4]。索拉非尼通過(guò)抑制絲氨酸/蘇氨酸激酶以及酪氨酸激酶受體來(lái)抑制腫瘤的血管生成和增殖[5]。然而，索拉非尼僅對(duì)大約30%的患者有益，并且通常在6個(gè)月內(nèi)發(fā)生獲得性耐藥[6-7]。肝細(xì)胞癌的索拉非尼耐藥性可能由多種因素介導(dǎo)，目前仍未被充分闡明。

自噬是一個(gè)進(jìn)化保守的過(guò)程，是將受損或無(wú)用的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)或其他細(xì)胞質(zhì)成分傳遞至溶酶體系統(tǒng)進(jìn)行降解的過(guò)程， 通過(guò)回收養(yǎng)分，以提供能量并再生細(xì)胞器[8-9]。研究表明，自噬通過(guò)維持腫瘤細(xì)胞在代謝和藥物治療下的存活而被認(rèn)為是耐藥性的重要機(jī)制[10]。自噬基因WIPI2（WD repeat domain，phosphoinositide interacting 2，WIPI2）是酵母ATG18基因（autophagy-related protein 18）的哺乳動(dòng)物同源物，在自噬中起關(guān)鍵作用。它結(jié)合ω-體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的磷脂酰肌醇3-磷酸[PI（3）P]富集域，而該域是成熟的自噬體形成的場(chǎng)所[11-12]。缺失WIPI2的細(xì)胞無(wú)法形成自噬體，對(duì)致病細(xì)菌（包括沙門氏菌）的吞噬也受到嚴(yán)重?fù)p害[13]。本研究選用人肝細(xì)胞癌Huh7細(xì)胞和索拉非尼誘導(dǎo)的耐藥細(xì)胞株Huh7-SR細(xì)胞，通過(guò)測(cè)定自噬基因WIPI2的表達(dá)情況，腫瘤細(xì)胞的克隆情況等，初步探究WIPI2基因與肝細(xì)胞癌耐藥的相關(guān)性，為肝細(xì)胞癌的治療尋找新的分子靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 材料

人肝細(xì)胞癌Huh7細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所），DMEM培養(yǎng)液、胰蛋白酶及胎牛血清（GIBCO公司），索拉非尼（美國(guó)Sigma公司），WIPI2抗體（杭州浩克生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：15432-1-AP，稀釋度：1:400），GADPH內(nèi)參抗體及二抗（Abcam公司），ECL試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司），NC-siRNA及WIPI2-siRNA（廣州市銳博生物科技有限公司），CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（日本DOJINDO公司），BCA蛋白測(cè)定試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司），凝膠成像儀（美國(guó)Bio-rad公司），熒光顯微鏡（日本Olympus公司），自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-tek公司） 。

1.2 方法

1.2.1 人肝細(xì)胞癌索拉非尼耐藥細(xì)胞株Huh7-SR的建立：選人肝細(xì)胞癌Huh7細(xì)胞為親本細(xì)胞，采用藥物濃度梯度遞增法，以索拉非尼為誘導(dǎo)藥物，建立索拉非尼耐藥細(xì)胞株Huh7-SR。索拉非尼藥物配制：將索拉非尼粉末加入適量二甲基亞砜（DMSO）溶液，配制成濃度為200 μmoL/L的索拉非尼工作液，-20 ℃保存；后再用10% FBS的DMEM培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。按照每周遞增索拉非尼0.25 μmol/L濃度，CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，歷時(shí)8個(gè)月后，自制細(xì)胞能在5 μmol/L索拉非尼濃度的培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長(zhǎng)，獲得穩(wěn)定的索拉非尼耐藥細(xì)胞株，誘導(dǎo)的耐藥細(xì)胞株命名為Huh7-SR。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)：人肝細(xì)胞癌Huh7細(xì)胞和人肝細(xì)胞癌索拉非尼耐藥Huh7-SR細(xì)胞，采用含10%新生胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。為維持Huh7-SR細(xì)胞的耐藥性，細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，加入2 μmol/L的索拉非尼，于實(shí)驗(yàn)前2周撤藥。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)Huh7與Huh7-SR細(xì)胞中WIPI2蛋白的表達(dá)情況：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Huh7細(xì)胞與Huh7-SR細(xì)胞，加裂解液裂解，離心收集上清，提取蛋白質(zhì)。采用Bradford法測(cè)定蛋白濃度，蛋白質(zhì)變性，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗孵育，TBST洗滌，二抗孵育，TBST洗滌，采用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行化學(xué)發(fā)光法顯影，以每條蛋白電泳帶的灰度值表示蛋白表達(dá)量，以GADPH為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算WIPI2蛋白相對(duì)表達(dá)值。

1.2.4 用siRNA轉(zhuǎn)染法敲低Huh7-SR細(xì)胞中WIPI2基因表達(dá)：根據(jù)siRNA試劑說(shuō)明書要求，在轉(zhuǎn)染前1 d，將Huh7-SR細(xì)胞接種在培養(yǎng)板中，第2天細(xì)胞密度達(dá)到30%～50%時(shí)加入制備好的轉(zhuǎn)染復(fù)合物（轉(zhuǎn)染濃度為50 nmol/L）。分設(shè)兩組，其中對(duì)照組轉(zhuǎn)染NC-siRNA（si-NC），實(shí)驗(yàn)組（敲低組）轉(zhuǎn)染W(wǎng)IPI2-siRNA（si-WIPI2）。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)24～96 h后，采用蛋白質(zhì)印記法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中WIPI2蛋白的表達(dá)水平，驗(yàn)證基因敲低效率。實(shí)驗(yàn)所用siRNA序列見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)所用siRNA序列

1.2.5 用細(xì)胞平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同siRNA轉(zhuǎn)染后Huh7-SR細(xì)胞對(duì)索拉非尼敏感性改變：取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染siRNA的兩組Huh7-SR細(xì)胞（即轉(zhuǎn)染si-WIPI2組和轉(zhuǎn)染si-NC組），用胰酶消化并吹打成細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后按每孔500個(gè)細(xì)胞加入培養(yǎng)器皿中。兩組加入索拉非尼處理（維持濃度為0.75 μmol/L），同時(shí)兩組各對(duì)應(yīng)設(shè)置空白對(duì)照處理（未予索拉非尼處理，其余條件相同），培養(yǎng)10～14 d，當(dāng)培養(yǎng)器皿板中出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)，加4%多聚甲醛固定后加入結(jié)晶紫染液染色，將平皿倒置并疊加在帶網(wǎng)格的透明膠片上，肉眼直接計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料采用（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析；P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人肝細(xì)胞癌索拉非尼耐藥細(xì)胞株Huh7-SR的建立

Huh7親本細(xì)胞通過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的索拉非尼誘導(dǎo)后形成穩(wěn)定的索拉非尼耐藥細(xì)胞株Huh7-SR。Huh7-SR細(xì)胞能在5 μmol/L索拉非尼濃度下穩(wěn)定生長(zhǎng)增殖，光鏡下可見(jiàn)Huh7細(xì)胞與Huh7-SR細(xì)胞形態(tài)改變（圖1 A1，A2）。采用CCK8法測(cè)定細(xì)胞活力，結(jié)果顯示用不同濃度索拉非尼處理后的Huh7-SR細(xì)胞的細(xì)胞活力明顯高于親本組Huh7細(xì)胞的細(xì)胞活力（圖1 B1，B2，B3，B4）。其中Huh7-SR細(xì)胞在7.5 μmol/L、10 μmol/L、12.5 μmol/L濃度索拉非尼處理24 h后其細(xì)胞活力分別是（81.04±4.33）%，（ 76.65±3.87）%，（69.14±4.06）%，處理48 h后Huh7-SR細(xì)胞活力分別是（69.86±3.20）%，（ 59.92±3.73）%，（ 50.46±4.11）%，與親本細(xì)胞組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這表明Huh7-SR細(xì)胞已對(duì)索拉非尼表現(xiàn)出明顯的耐藥性，索拉非尼耐藥株Huh7-SR成功建立。

2.2 WIPI2蛋白在人肝細(xì)胞癌索拉非尼耐藥細(xì)胞株Huh7-SR中表達(dá)水平增加

采用Western blotting檢測(cè)Huh7細(xì)胞和Huh7-SR細(xì)胞中WIPI2蛋白的表達(dá)情況。在Huh7細(xì)胞中WIPI2蛋白呈低水平表達(dá)，其蛋白相對(duì)表達(dá)值為（1.02±0.07），在耐藥株Huh7-SR中WIPI2蛋白表達(dá)明顯升高，其蛋白相對(duì)表達(dá)值為（2.18±0.23），二者相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05，圖2 C1，C2）。提示W(wǎng)IPI2基因可能在肝細(xì)胞癌耐藥形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

2.3 用siRNA轉(zhuǎn)染法成功敲低Huh7-SR細(xì)胞中WIPI2基因表達(dá)

用蛋白質(zhì)印記法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，WIPI2蛋白在轉(zhuǎn)染si-WIPI2的Huh7-SR細(xì)胞中的為低表達(dá)，其蛋白相對(duì)表達(dá)值為（0.44±0.03），而在轉(zhuǎn)染si-NC的Huh7-SR細(xì)胞中仍為高表達(dá)，其蛋白相對(duì)表達(dá)值為（1.21±0.08） （圖3 D1，D2），兩組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），由此驗(yàn)證si-WIPI2轉(zhuǎn)染敲低了WIPI2基因在Huh7-SR細(xì)胞中的表達(dá)。

2.4 敲低WIPI2基因表達(dá)后Huh7-SR細(xì)胞對(duì)索拉非尼的敏感性升高

通過(guò)細(xì)胞平板克隆實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，兩不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞即敲低組（si-WIPI2）和對(duì)照組（si-NC），在給予索拉非尼處理后細(xì)胞克隆數(shù)有不同的變化。如圖4所示，在沒(méi)有給予索拉非尼處理的兩組細(xì)胞克隆數(shù)無(wú)明顯差異（P＞0.05）；而在索拉非尼處理下，敲低組（si-WIPI2）的細(xì)胞克隆數(shù)明顯低于對(duì)照組（si-NC）[（60±4）個(gè)vs（102±3）個(gè)，P＜0.05]，這說(shuō)明敲低WIPI2基因表達(dá)后可增加耐藥株Huh7-SR對(duì)索拉非尼的敏感性，進(jìn)一步提示W(wǎng)IPI2基因表達(dá)對(duì)人肝癌索拉非尼耐藥Huh7-SR細(xì)胞的耐藥性產(chǎn)生具有重要的意義。

3 討論

目前肝癌發(fā)病率和死亡率總體呈上升趨勢(shì)，我國(guó)每年約有38萬(wàn)人死于肝癌，占全球肝癌死亡病例數(shù)的51%[14]。肝癌具有生長(zhǎng)速度快、惡性程度高、易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及藥物耐受等特點(diǎn)，因此肝癌的預(yù)后較差[15]。索拉非尼作為目前唯一用于臨床的肝癌分子靶向治療藥物，其療效仍然有限，耐藥性的產(chǎn)生可能是導(dǎo)致其化療失敗的主要原因[16]。因此研究肝細(xì)胞癌的耐藥機(jī)制，對(duì)于提高其化療療效，指導(dǎo)臨床用藥有著重要的價(jià)值。

圖1 索拉非尼對(duì)Huh7細(xì)胞和Huh7-SR細(xì)胞的影響

基因的分子靶向治療是目前的研究熱點(diǎn)之一[17]，由于自噬與耐藥性的產(chǎn)生可能存在一定的聯(lián)系，而自噬基因WIPI2在細(xì)胞自噬小體和自噬通量形成中起重要作用[12-13]，因此我們開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證WIPI2基因與耐藥性的產(chǎn)生是否存在一定的關(guān)聯(lián)。本研究首先采用藥物濃度梯度法對(duì)索拉非尼敏感的親本細(xì)胞Huh7在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)成為耐藥株Huh7-SR。在實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)WIPI2在耐藥細(xì)胞株Huh7-SR中的表達(dá)明顯高于Huh7細(xì)胞，因此我們推測(cè)WIPI2與肝細(xì)胞癌化療過(guò)程中產(chǎn)生的耐藥性存在一定關(guān)系。為了證明這一假設(shè)，我們?cè)贖uh7-SR細(xì)胞中敲低WIPI2后，細(xì)胞的耐藥性降低，恢復(fù)了對(duì)索拉非尼的敏感性，進(jìn)一步證明了WIPI2與耐藥性的密切關(guān)系。該現(xiàn)象提示我們?cè)诟渭?xì)胞癌化療過(guò)程中，WIPI2可能是提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性的一個(gè)重要分子靶點(diǎn)。同時(shí)，考慮到這一現(xiàn)象的發(fā)生可能與自噬信號(hào)通路的激活相關(guān)，我們也將開展下一步實(shí)驗(yàn)探索其具體作用機(jī)制。

圖2 WIPI2蛋白在不同肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況

圖3 siRNA轉(zhuǎn)染后Huh7-SR細(xì)胞中WIPI2蛋白表達(dá)情況

圖4 不同條件下Huh7-SR細(xì)胞的克隆情況