王一春，王麗娟，劉萍△

近年來，糖尿病（diabetes mellitus，DM）發(fā)病率逐年升高，已成為危害人類健康的主要慢性疾病之一［1］。國(guó)際糖尿病聯(lián)盟研究項(xiàng)目報(bào)道，2017 年全球糖尿病患者約有4.51億，預(yù)計(jì)2045年全球糖尿病患者 將 達(dá) 到 6.93 億［2］。 糖 尿 病 心 肌 病（diabetic cardiomyopathy，DCM）作為糖尿病并發(fā)癥之一，主要病理改變?yōu)樾募〖?xì)胞凋亡和左心室肥厚，間質(zhì)和血管周圍組織纖維化，最終發(fā)展為心力衰竭，已成為糖尿病患者的主要致死原因［3］。DCM發(fā)病機(jī)制尚不清楚，高血糖、炎癥反應(yīng)、心肌細(xì)胞肥大及纖維化、氧化應(yīng)激、血管內(nèi)皮損傷等多種因素均可能參與DCM的發(fā)生發(fā)展［4-5］，因此，尋找安全、有效控制 DCM 的藥物，已成為研究的焦點(diǎn)。阿魏酸（ferulic acid）是從阿魏、川芎、木賊、升麻等多種中藥提取出的有效單體，具有較強(qiáng)的抗氧化能力，在抗腫瘤、抗氧化、解毒、保肝等方面發(fā)揮著巨大的作用，因其性質(zhì)穩(wěn)定、毒性低受到人們的廣泛關(guān)注［6］。有研究報(bào)道，阿魏酸具有抗氧化和降血糖作用，對(duì)大鼠氧化應(yīng)激介導(dǎo)的糖尿病心肌病有一定的治療作用［7］。本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，探討阿魏酸對(duì)2 型糖尿病小鼠心肌損傷的保護(hù)作用及其作用機(jī)制，為阿魏酸臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 阿魏酸（128707）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，糖基化終末代謝產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）ELISA 試劑盒（JYM0171MO）購(gòu)自武漢基因美生物技術(shù)有限公司，Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR-4）抗體（ab22048）、核轉(zhuǎn)錄因子-?B（nuclear factor kappa B，NF-?B）抗體（ab16502）均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3抗體（NACHT-LRR-PYD-containing protein 3，NALP3，A12694）購(gòu)自中國(guó)ABclonal公司，β-actin抗體均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）抗體（ZB-2301）、兔二步法試劑盒（PV-6001）均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，蛋白提取試劑盒（R0050）、Masson試劑盒（G1345）均購(gòu)自北京索萊寶生物技術(shù)有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（K1622）、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（32106）均購(gòu)自賽默飛世爾生物技術(shù)有限公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Q-PCR）試劑盒（RR820A）購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司，全自動(dòng)生化分析儀（IDEXX Cataiyst One）購(gòu)自愛德士緬因生物制品貿(mào)易（上海）有限公司，Q-PCR儀（CFX96）、濕轉(zhuǎn)印儀、垂直電泳儀均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 2 型糖尿病db/db 小鼠和正常db/m小鼠均購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，體質(zhì)量18～21 g，4～6周齡，雄性，SPF級(jí)。飼養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)均在寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。db/db 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，檢測(cè)血糖，篩選出糖尿病小鼠20只，按小鼠體質(zhì)量進(jìn)行編號(hào)，隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組和阿魏酸組，每組10只；采用相同方法隨機(jī)抽取10只同周齡的db/m小鼠作為對(duì)照組。對(duì)照組和模型組灌胃蒸餾水，阿魏酸組灌胃阿魏酸（30 mg/kg）至8周，每天灌胃1 次，8 周后處死［8］，取出完整小鼠心臟，稱量心臟質(zhì)量，計(jì)算心臟質(zhì)量指數(shù)（心臟質(zhì)量指數(shù)=小鼠心臟質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量）。

1.2.2 心肌HE 染色、Masson 染色 取相同部位心臟組織，10%福爾馬林固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，3 μm 連續(xù)切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，蒸餾水浸洗。常規(guī)HE、Masson染色，400倍光鏡下觀察心臟組織形態(tài)變化。

1.2.3 外周血血糖（BG）、肌酸激酶（CK）和肌酸激酶同工酶（CK-MB）、AGEs 檢測(cè) 末次給藥后，吸入麻醉小鼠，迅速摘取眼球取血，分離血清。用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清中BG、CK和CK-MB的水平，采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定AGEs表達(dá)水平。

1.2.4 Q-PCR檢測(cè) 采用Trizol一步法從心臟組織中提取總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL作為模板，應(yīng)用 Q-PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增。TLR-4、NF-?B 和NALP3部分片段的引物采用Premier 5.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，引物序列見表1。反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s共40個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，-20 ℃保存，以GAPDH 為內(nèi)參，每組樣本設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，采用2-ΔΔCt法表示TLR-4、NF-?B、NALP3 mRNA相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.5 免疫組化染色檢測(cè) 石蠟包埋的心臟組織經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，蒸餾水浸洗，抗原修復(fù)后，滴加TLR-4（1∶50）、NF-?B（1∶200）、NALP3（1∶100）4 ℃孵育過夜；室溫復(fù)溫漂洗后，滴加相對(duì)應(yīng)的二抗37 ℃孵育30 min，4 ℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3 次，DAB 顯色，蒸餾水沖洗終止反應(yīng)，復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯使切片透明，中性樹膠封片，400倍光鏡下觀察TLR-4、NF-?B、NALP3表達(dá)情況，陽(yáng)性反應(yīng)為棕黃色或黃色顆粒。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0 圖像處理系統(tǒng)測(cè)量TLR-4、NF-?B、NALP3蛋白的平均光密度值。

1.2.6 Western blot 檢測(cè) 提取100 mg小鼠心臟組織，加入1mL RIPA裂解液、5 μL磷酸酶抑制劑、5 μL蛋白酶抑制劑，震蕩離心30 s，冰上靜置 5 min，重復(fù)4 次，12 000 r/min 離心15 min后取上清液，BCA法測(cè)定總蛋白濃度。定量上樣蛋白60 μg，加5×上樣緩沖液，蛋白變性、電泳、轉(zhuǎn)膜，含5%脫脂牛奶的 PBST 封閉緩沖液封閉 2 h，加入 TLR-4（1∶500）、NF-?B（1∶1 000）、NALP3（1∶500）、β-actin（1∶1 000）抗體，4 ℃孵育過夜，TBST 漂洗 3 次，對(duì)應(yīng)的二抗（1∶5 000）溫室孵育 1 h，TBST 漂洗3 次，加入超敏ECL 化學(xué)發(fā)光劑顯影。采用Image J圖像處理系統(tǒng)計(jì)算樣本條帶灰度值。

Tab.1 Primer sequence表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組樣本均數(shù)間的比較采用方差分析，組間多重比較采LSD-t法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠心臟質(zhì)量指數(shù)比較 模型組小鼠體質(zhì)量、心臟質(zhì)量和心臟質(zhì)量指數(shù)較對(duì)照組明顯增高（均P＜0.05），阿魏酸干預(yù)后，體質(zhì)量、心臟質(zhì)量和心臟質(zhì)量指數(shù)較模型組明顯降低（均P＜0.05），見表2。

Tab.2 Heart mass index of three groups of mice表2 各組小鼠心臟質(zhì)量指數(shù) （n=10，）

Tab.2 Heart mass index of three groups of mice表2 各組小鼠心臟質(zhì)量指數(shù) （n=10，）

＊＊P＜0.01；a與對(duì)照組相比較，b與模型組相比較，P＜0.05

組別對(duì)照組模型組阿魏酸組F體質(zhì)量（g）22.819±1.725 44.835±2.575a 41.049±1.911ab 313.578＊＊心臟質(zhì)量（mg）92.477±6.486 216.930±22.641a 172.607±22.475ab 112.630＊＊心臟質(zhì)量指數(shù)（mg/g）4.057±0.157 4.830±0.282a 4.194±0.370b 21.156＊＊

2.2 各組小鼠心臟組織形態(tài)學(xué)改變 HE和Masson染色顯示，對(duì)照組心肌細(xì)胞形態(tài)完整，心肌纖維排列整齊，橫紋清晰，細(xì)胞核大小一致，無明顯結(jié)構(gòu)改變和間質(zhì)纖維化。模型組心肌細(xì)胞腫脹肥大，心肌纖維排列紊亂，細(xì)胞核大小不一，可見明顯纖維增生。阿魏酸組心肌細(xì)胞腫脹情況較模型組明顯減輕，細(xì)胞形態(tài)較完整，心肌纖維排列較整齊，心肌纖維增生情況明顯好轉(zhuǎn)，見圖1。

2.3 各組小鼠血清BG、CK、CK-MB、AGEs 水平比較 模型組血清BG、CK、CK-MB、AGEs表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（均P＜0.05），阿魏酸干預(yù)后，血清BG、CK、CK-MB、AGEs 表達(dá)水平較模型組明顯降低（均P＜0.05），見表3。

2.4 Q-PCR 檢 測(cè) 心 臟 組 織 中 TLR-4、NF- ?B、NALP3 mRNA 表達(dá)情況 模型組TLR-4、NF-?B、NALP3 mRNA 表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高（均P＜0.05），阿魏酸干預(yù)后，TLR-4、NF-?B、NALP3 mRNA表達(dá)水平較模型組明顯降低（均P＜0.05），見表4，圖2。

2.5 免疫組化染色檢測(cè) TLR-4、NF-?B、NALP3 蛋白表達(dá)情況 模型組TLR-4、NF-?B、NALP3蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（均P＜0.05），阿魏酸干預(yù)后，TLR-4、NF-?B、NALP3 蛋白表達(dá)水平較模型組明顯降低（均P＜0.05），見表5，圖3。

2.6 Western blot 檢測(cè) TLR-4、NF-?B、NALP3 蛋白表達(dá)情況 模型組TLR-4、NF-?B、NALP3蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（均P＜0.05），阿魏酸干預(yù)后，TLR-4、NF-?B、NALP3蛋白表達(dá)水平較模型組明顯降低（均P＜0.05），見表6，圖4。

Tab.3 Expression levels of serum BG,CK,CK-MB and AGEs in three groups of mice表3 各組小鼠血清中BG、CK、CK-MB、AGEs水平 （n=5，）

Tab.3 Expression levels of serum BG,CK,CK-MB and AGEs in three groups of mice表3 各組小鼠血清中BG、CK、CK-MB、AGEs水平 （n=5，）

＊＊P＜0.01；a與對(duì)照組相比較，b與模型組相比較，P＜0.05

組別對(duì)照組模型組阿魏酸組F BG（mmol/L）5.031±0.535 21.250±0.652a 15.711±0.591ab 961.327＊＊CK（U/L）504.080±17.266 691.963±26.148a 583.520±21.194ab 93.240＊＊CK-MB（U/L）106.877±9.969 221.625±15.053a 148.489±13.074ab 101.872＊＊AGEs（ng/L）123.270±13.074 206.493±12.128a 167.403±14.515ab 49.188＊＊

Tab.4 The expressions of TLR-4,NF-?B and NALP3 mRNA in heart cells detected by Q-PCR表4 Q-PCR檢測(cè)心臟組織TLR-4、NF-?B、NALP3 mRNA表達(dá)情況 （）

Tab.4 The expressions of TLR-4,NF-?B and NALP3 mRNA in heart cells detected by Q-PCR表4 Q-PCR檢測(cè)心臟組織TLR-4、NF-?B、NALP3 mRNA表達(dá)情況 （）

＊＊P＜0.01；a與對(duì)照組相比較，b與模型組相比較，P＜0.05

組別對(duì)照組模型組阿魏酸組F n3 3 3 TLR-4 1 4.670±0.288a 0.788±0.052b 499.890＊＊NF-?B 1 5.027±0.248a 0.883±0.024b 807.922＊＊NALP3 1 4.520±0.727a 0.673±0.079b 76.555＊＊

Tab.5 The expressions of TLR-4,NF-?B and NALP3 protein in heart tissues detected by immunohistochemical staining表5 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)心臟組織中TLR-4、NF-?B、NALP3蛋白表達(dá)情況 （）

Tab.5 The expressions of TLR-4,NF-?B and NALP3 protein in heart tissues detected by immunohistochemical staining表5 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)心臟組織中TLR-4、NF-?B、NALP3蛋白表達(dá)情況 （）

＊＊P＜0.01；a與對(duì)照組相比較，b與模型組相比較，P＜0.05

組別對(duì)照組模型組阿魏酸組F n3 3 3 TLR-4 0.348±0.020 0.613±0.022a 0.441±0.007ab 176.664＊＊NF-?B 0.305±0.020 0.552±0.020a 0.467±0.024ab 102.435＊＊NALP3 0.272±0.038 0.580±0.044a 0.418±0.055ab 33.140＊＊

Tab.6 The expressions of TLR-4,NF-?B and NALP3 protein in heart tissues detected by Western blot assay表6 Western blot 法檢測(cè)心臟組織中TLR-4、NF-?B、NALP3蛋白表達(dá)情況 （）

Tab.6 The expressions of TLR-4,NF-?B and NALP3 protein in heart tissues detected by Western blot assay表6 Western blot 法檢測(cè)心臟組織中TLR-4、NF-?B、NALP3蛋白表達(dá)情況 （）

＊＊P＜0.01；a與對(duì)照組相比較，b與模型組相比較，P＜0.05

組別對(duì)照組模型組阿魏酸組F n3 3 3 TLR-4 0.333±0.014 0.516±0.021a 0.397±0.008ab 109.000＊＊NF-?B 0.926±0.018 1.021±0.017a 0.818±0.009ab 138.511＊＊NALP3 0.892±0.008 1.028±0.018a 0.877±0.047b 23.970＊＊

3 討論

3.1 阿魏酸對(duì)糖尿病進(jìn)展影響的研究現(xiàn)狀 近年來，糖尿病發(fā)病率逐年上升，已成為除腫瘤、冠心病、腦血管病之外第四大威脅人類健康的慢性疾?。?］，可引起心肌細(xì)胞代謝紊亂、心肌細(xì)胞壞死及組織纖維化，最終導(dǎo)致糖尿病心肌病的發(fā)生［10］，糖尿病患者心血管疾病和心力衰竭的發(fā)病率是非糖尿病患者的2～3 倍［11］。阿魏酸在保護(hù)心肌缺血、增加冠脈血流量等方面發(fā)揮著重要的作用［6］。糖尿病心肌病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，高血糖導(dǎo)致的氧化應(yīng)激引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞損傷是糖尿病心肌病形成的關(guān)鍵，長(zhǎng)期高血糖狀態(tài)會(huì)抑制心肌細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用，促進(jìn)脂肪酸氧化，進(jìn)而引起心肌細(xì)胞損傷［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，阿魏酸干預(yù)后，糖尿病小鼠血糖水平明顯降低，提示阿魏酸可能具有一定的降糖作用。

3.2 阿魏酸對(duì)2 型糖尿病小鼠心肌損傷的保護(hù)作用 本研究顯示，糖尿病可導(dǎo)致小鼠心臟質(zhì)量指數(shù)升高、心肌細(xì)胞肥大和心肌纖維化，而阿魏酸干預(yù)后，心臟質(zhì)量指數(shù)明顯降低，心肌細(xì)胞腫脹和纖維增生情況明顯好轉(zhuǎn)，提示阿魏酸可能緩解2 型糖尿病造成的心肌細(xì)胞纖維化，對(duì)心肌細(xì)胞損傷具有一定的治療作用，這與Chowdhury 等［7］的研究結(jié)果一致，但本研究并未探討阿魏酸對(duì)糖尿病小鼠心肌肥厚情況的影響，有待進(jìn)一步研究。CK、CK-MB 是特異性心肌酶，被廣泛認(rèn)為是心肌損傷的重要標(biāo)志物，其升高程度與心肌損傷程度密切相關(guān)，可以反映心肌細(xì)胞損傷程度［13］。高血糖環(huán)境下AGEs 產(chǎn)生增多，AGEs會(huì)引起心肌細(xì)胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，而心肌細(xì)胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)是糖尿病心肌病發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，AGEs在糖尿病心肌病中發(fā)揮著重要的作用［14-15］。本研究發(fā)現(xiàn)阿魏酸對(duì)糖尿病引起的心肌損傷具有一定的治療作用，它可能通過抑制AGEs表達(dá)，阻止AGEs對(duì)心臟血管的損害，進(jìn)而達(dá)到改善糖尿病小鼠心肌損傷的作用，。

3.3 阿魏酸對(duì)2 型糖尿病小鼠心肌組織中TLR-4、NF-?B、NALP3 表達(dá)的影響 TLR-4 作為一種模式識(shí)別受體，在心血管內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞中廣泛分布。大量研究表明，TLR-4/NF-?B 信號(hào)通路與心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)，TLR-4 可經(jīng)細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)通路進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，激活NF-κB，誘導(dǎo)細(xì)胞釋放大量炎性因子，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生，引起心肌細(xì)胞壞死、心肌梗死面積增大、心功能降低［16］。本研究提示阿魏酸可能通過抑制TLR-4/NF-?B/NALP3信號(hào)通路，使心肌細(xì)胞中TLR-4、NF-?B、NALP3 活性降低，抑制炎癥反應(yīng)，減少心肌損害，進(jìn)而達(dá)到保護(hù)心肌的作用。此外，本研究并未檢測(cè)小鼠血清中炎癥因子的表達(dá)情況，TLR-4/NF-?B/NALP3信號(hào)通路在心肌損傷保護(hù)作用中的具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，阿魏酸具有改善2 型糖尿病小鼠血糖水平，減輕心肌細(xì)胞損傷及心肌纖維化的作用，它可能通過抑制TLR-4/NF-?B/NALP3信號(hào)通路，抑制炎癥反應(yīng)，減少心肌損害，進(jìn)而達(dá)到保護(hù)心肌的作用。