劉雪，張濤，周笑琦，管倫，陳鵬

華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070

信使RNA (Messenger RNA，mRNA) 是遺傳信息表達(dá)的核心分子，mRNA作為蛋白質(zhì)合成的模板，其堿基序列決定著蛋白質(zhì)裝配時的氨基酸序列。中心法則中，遺傳信息表達(dá)的解碼過程需要轉(zhuǎn)運RNA (tRNA) 上的反密碼子和信使RNA(mRNA) 上的密碼子完成配對和攜帶入對應(yīng)的氨基酸摻入多肽鏈，由于修飾核苷的存在，即使是相同的核苷酸序列，也可最終表達(dá)出不同的遺傳信息。已有較多的研究證明，轉(zhuǎn)運RNA (tRNA)和核糖體RNA (rRNA) 的加工和成熟過程涉及大量的化學(xué)修飾，在某些情況下，這些額外的基團(tuán)修飾對其正常折疊和行使功能至關(guān)重要[1]。mRNA也可以像rRNA和tRNA一樣被修飾。目前已經(jīng)知道的RNA核苷修飾有170余種 (Modomics Database，http://modomics.genesilico.pl/modifications/)，其中大部分出現(xiàn)在tRNA和rRNA中，mRNA中已知的修飾僅有18種，其中大多為甲基化修飾 (圖1)。其中5種：1-甲基腺苷 (1-methyladenosine，m1A)、假尿嘧啶 (Pseudouridine，ψ)、5-羥甲基胞苷(5-hydroxymethylcytidine，hm5C)、6-甲酰腺苷(6-formyladenosine，(f6A) 以及6-羥甲基腺苷(6-hydroxymethyladenosine，hm6A) 發(fā)現(xiàn)較晚，目前還未被RNA Modification Database (https://mods.rna.albany.edu/) 收錄。

圖1 mRNA上分布的18種修飾核苷Fig.1 18 modified nucleosides found on mRNA.

不同的修飾核苷在mRNA上的分布不同(圖2)：7-甲基鳥苷 (7-methylguansoine，m7G) 主要分布于mRNA的5′帽子區(qū)域，在mRNA內(nèi)部也有分布[2]；6-methyladenosine (m6A) 在哺乳動物中主要分布在mRNA的終止密碼子附近，3′-UTR區(qū)域 (3′-untranslated regions) 以及長外顯子內(nèi)[3]，在植物mRNA的起始密碼子和poly A尾巴上游也有分布[4-5]；5-methylcytidine (m5C) 主要出現(xiàn)在mRNA的CDS (Coding sequence) 區(qū)[6]；m1A在mRNA的5′-UTR (5′-untranslated regions)、CDS、3′-UTR區(qū)域都存在[7-8]；ψ主要分布在mRNA的CDS和3′-UTR區(qū)域[9]；hm5C主要分布在mRNA的CDS區(qū)域[10]。DNA與RNA的主要差別在于核糖2′-C上分別是-OH和-H，一個基團(tuán)的不同卻使DNA和RNA在結(jié)構(gòu)和功能呈現(xiàn)巨大的差異，可見修飾基團(tuán)的存在對RNA結(jié)構(gòu)和功能的影響。由于RNA的不穩(wěn)定性、結(jié)構(gòu)復(fù)雜性以及檢測技術(shù)有限，表觀遺傳學(xué)中RNA來源核苷修飾的研究比DNA上的研究進(jìn)展慢。2011年第一個RNA去甲基化酶FTO(Fat-mass and obesity associated protein，m6A去甲基酶) 的發(fā)現(xiàn)揭示了RNA修飾的可逆性[11]，是RNA表觀遺傳學(xué)研究的里程碑。近些年，隨著meRIP等技術(shù)的快速發(fā)展，不同生物全轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)的RNA修飾譜圖得到揭示，越來越多的研究表明mRNA上表觀修飾對生物體生長發(fā)育具有重要的調(diào)控作用。本文針對研究較多的6種mRNA上的核苷修飾，包括ψ、m7G、m1A、m6A、m5C和hm5C，從其合成、分布和功能上進(jìn)行闡述和討論。

圖2 m7G、m1A、m6A、m5C、hm5C和ψ修飾核苷在mRNA上的區(qū)間分布Fig.2 Distribution of m7G,m1A,m6A,m5C,hm5C and ψ in mRNA.

1 假尿嘧啶 (ψ)

假尿嘧啶是尿苷 (1-核糖尿苷) 的異構(gòu)體(5-核糖尿苷)，被認(rèn)為是第5種核苷酸。假尿嘧啶是非編碼RNA (Non-coding RNA) 中最豐富的一種修飾[12-14]，在tRNA和rRNA中也存在，具有穩(wěn)定RNA結(jié)構(gòu)的功能[15-17]。mRNA上的假尿嘧啶影響mRNA的剪切[13]。在酵母中改變rRNA的假尿嘧啶修飾可以影響其對于抗生素的敏感性[18-19]。在哺乳動物中，假尿嘧啶修飾與先天性胰島功能不良、核糖體合成紊亂以及癌癥的發(fā)生相關(guān)[20]。利用pseudo-seq、ψ-seq、PSI-seq和CeU-Seq技術(shù)可實現(xiàn)人或酵母mRNA上單堿基分辨率下ψ的位點鑒定，數(shù)據(jù)表明哺乳動物中ψ/U的相對豐度約為0.2%–0.4%[21]。

mRNA的假尿嘧啶修飾由位點特異的snoRNA引導(dǎo)的PUSs (假尿嘧啶合成酶) 催化形成，人類細(xì)胞中有23個蛋白含有PUS結(jié)構(gòu)域[22]，合成的ψ主要富集在mRNA的CDS和3′-UTR區(qū)域[9,21,23-24]。mRNA的假尿嘧啶修飾有3個主要功能：1) 改變密碼子；2) 影響轉(zhuǎn)錄本穩(wěn)定性；3) 應(yīng)激反應(yīng)應(yīng)答[23,25-26]。在酵母中尿嘧啶 (U) 被替換為假尿嘧啶 (ψ) 之后，原本的無義密碼便可改為編碼氨基酸。當(dāng)酵母受到熱激刺激時，由PUS7介導(dǎo)的假尿嘧啶位點突增；反之，PUS7缺失時含有這些ψ位點的mRNA水平下降[23]。在剛地弓形蟲中的研究發(fā)現(xiàn)，TgPUS1突變體中ψ位點比野生型寄生蟲中更穩(wěn)定[27]，由此推測mRNA的假尿嘧啶修飾可能具有雙向作用，在不同的生物體、基因或者不同條件下可能會增強mRNA的穩(wěn)定性或者降低其穩(wěn)定性。人類細(xì)胞在熱激或者是H2O2處理下mRNA上的假尿嘧啶修飾水平升高，而在饑餓刺激下則會下降；酵母在營養(yǎng)不足的情況下和人細(xì)胞處于血清饑餓的情況下，mRNA上的假尿嘧啶化修飾水平都發(fā)生變化，可見mRNA上的大多數(shù)假尿嘧啶修飾與細(xì)胞對環(huán)境信號的應(yīng)答有關(guān)[9]。

2 m7G

m7G甲基化是指RNA分子鳥嘌呤第7位氮原子上的甲基化修飾。m7G是目前發(fā)現(xiàn)的唯一一個在真核生物mRNA的5′端帽子結(jié)構(gòu)區(qū)域出現(xiàn)的核苷修飾[2]。mRNA的5′帽子結(jié)構(gòu)對于mRNA具有重要作用，5′帽子結(jié)構(gòu)可以促使mRNA與核糖體的結(jié)合，m7Gppp結(jié)構(gòu)使mRNA形成封閉的5′端，可有效防止mRNA的降解，此外5′帽子結(jié)構(gòu)還影響前體mRNA的剪切、3′末端的多聚腺苷酸化以及mRNA的出核運輸[28-32]。

1975年就有學(xué)者發(fā)現(xiàn)真核生物mRNA 5′帽子結(jié)構(gòu)區(qū)域的m7G修飾促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成，且消除m7G修飾后相對應(yīng)的mRNA就不能正常翻譯[33]。1976年在鹵蟲藻胚胎中發(fā)現(xiàn)，帽子綁定蛋白(Cap-binding protein) 可識別mRNA 5′端的m7GpppN的結(jié)構(gòu)，促進(jìn)mRNA與核糖體的結(jié)合，進(jìn)而影響翻譯進(jìn)程[34]。后來發(fā)現(xiàn)，m7G不僅僅存在于mRNA的5′端帽子結(jié)構(gòu)區(qū)域，在mRNA的內(nèi)部同樣存在。真核生物mRNA內(nèi)部m7G含量為0.4–5.3/105，5′帽子結(jié)構(gòu)區(qū)域m7G含量為1.0–4.9/104。植物mRNA的內(nèi)部m7G含量明顯高于哺乳動物。此外，研究還發(fā)現(xiàn)真核生物mRNA中的m7G修飾可以被動態(tài)調(diào)控。經(jīng)過鎘處理，水稻中m7G去帽基因表達(dá)量上升，mRNA 5′端帽子結(jié)構(gòu)和內(nèi)部的m7G水平均降低，內(nèi)部m7G含量在水稻不同發(fā)育階段變化趨勢相同，說明mRNA內(nèi)部m7G相對穩(wěn)定，而5′端帽子結(jié)構(gòu)的m7G與環(huán)境脅迫的應(yīng)答相關(guān)[2]。

3 m6A

m6A甲基化是指RNA分子腺嘌呤第6位氮原子上的甲基化修飾。20世紀(jì)70年代，在哺乳動物和植物中首次發(fā)現(xiàn)了mRNA上m6A的修飾，之后在病毒、果蠅、酵母等物種中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了m6A的存在[35-40]。已有研究表明，m6A修飾和mRNA的穩(wěn)定性、剪接加工、翻譯以及microRNA的加工有關(guān)，影響干細(xì)胞命運、生物節(jié)律等生物過程。隨著m6A-seq、MeRIP、miCLIP等新技術(shù)的產(chǎn)生，m6A在全轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)的分布越來越清晰。2012年Dominissini等利用m6A-seq技術(shù)發(fā)現(xiàn)人類細(xì)胞中mRNA和長鏈非編碼RNA (Long noncoding RNAs) 上有超過10 000個m6A修飾位點[3]，Meyer等利用MeRIP-seq技術(shù)發(fā)現(xiàn)7 676個哺乳類基因的mRNA上有m6A的修飾[41]。這些研究還表明mRNA上的m6A位點在人和鼠之間高度保守，主要富集在終止密碼子附近、3′-UTR區(qū)域、長外顯子內(nèi)以及可變剪切位點內(nèi)。在植物材料中，Bodi等發(fā)現(xiàn)擬南芥轉(zhuǎn)錄組中m6A修飾位點主要位于3′ poly A尾巴上游的100–150 nt的范圍內(nèi)[4]。Li等利用MeRIP-seq技術(shù)鑒定到水稻愈傷組織和葉片中8 138個和14 253個轉(zhuǎn)錄本上含有m6A修飾，并且修飾位點傾向分布于翻譯的起始位點和終止位點附近[5]。與哺乳動物m6A保守基序“GRACH”(R=A/G；H=A/U/C) 有區(qū)別的是，水稻愈傷組織中m6A保守基序為“RAGRA G”，而葉片中m6A保守基序為“UGUA MM”(M=C/A)[5]。水稻花序中m6A的保守基序與水稻葉片中的保守基序相似，為“UGWA MH”(W=U/A)[42]。擬南芥中m6A的保守基序與水稻也不同，為“RRACH”[43]。由此可見在不同物種、不同發(fā)育階段以及不同組織中m6A位點的合成和識別可能存在高度的物種和組織特異性。

m6A是目前所知的唯一由合成蛋白 (m6A writer)、去除蛋白 (m6A eraser) 和識別蛋白 (m6A reader) 構(gòu)成的甲基組系統(tǒng)。近年來有多篇綜述報道了mRNA上m6A修飾強大的調(diào)控功能[44-46]，下面簡要介紹下影響m6A合成及分布的這3類蛋白。

3.1 合成蛋白 (m6A writer)

在哺乳動物中，m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體由甲基轉(zhuǎn)移酶類3 (methyltransferase-like3，METTL3)、甲基轉(zhuǎn)移酶類14 (METTL14)、Wilm腫瘤關(guān)聯(lián)蛋白 (Wilm’s tumor 1-associating protein，WTAP)、KIAA1429/VIRMA、HAKAI、RNA結(jié)合蛋白15(RNA Binding Motif Protein15，RBM15) 和鋅指蛋白C3H結(jié)構(gòu)域蛋白13 (Zinc finger CCCH domaincontaining protein 13，ZC3H13) 組成。WTAP、METTL3和METTL14主要富集在核小點處，METTL3是甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體的催化中心，METTL14序列上與METTL3相似，但是METTL14不具有獨立的體外甲基化酶活性，主要負(fù)責(zé)活化METTL3和招募RNA與METTL3反應(yīng)[47-49]。WTAP是甲基化酶的構(gòu)架蛋白，主要起穩(wěn)定METTL類蛋白之間的互作，既可影響轉(zhuǎn)錄，也可影響RNA的剪切[50]。KIAA1429和RBM15主要起識別甲基化靶向位點的作用。擬南芥中發(fā)現(xiàn)HAKAI蛋白調(diào)控m6A的合成，動物細(xì)胞中HAKAI突變也造成m6A的合成受阻[51]。ZC3H13通過與WTAP、VIR和HAKAI形成蛋白復(fù)合體，將整個m6A合成復(fù)合體錨定于細(xì)胞核內(nèi)[52-53]。

多個研究發(fā)現(xiàn)m6A writer的突變可導(dǎo)致不同的表型甚至胚胎致死 (表1)。例如釀酒酵母，只有在減數(shù)分裂時期的mRNA才具有m6A修飾，IME4/METTL3的缺失影響酵母的出芽和減數(shù)分裂過程[54-55]。酵母中Kar4/METTL14的突變造成單倍體配子融合失敗[56-57]。斑馬魚中METTL3和WTAP的表達(dá)富集于腦部，基因敲除導(dǎo)致胚胎細(xì)胞凋亡增加，斑馬魚頭部和腦部發(fā)育缺陷，生育能力下降[58]。果蠅的METTL3和METTL14突變體在傳代能力、飛行技能、神經(jīng)發(fā)育和性別決定等方面表現(xiàn)出不同程度的缺陷[59-64]。果蠅的m6A標(biāo)記影響XIST和Sxl等母本mRNA的特異選擇和剪切，從而影響性別的決定[65]。小鼠METTL3、WTAP或RBM15的缺失導(dǎo)致胚胎干細(xì)胞失去分化能力并導(dǎo)致胚胎致死[50,66-68]；METTL14的突變影響精細(xì)胞發(fā)育和個體的育性[69]。人類細(xì)胞中METTL3缺失抑制胚胎干細(xì)胞分化，造成生物鐘周期延長，METTL3可以促進(jìn)癌癥細(xì)胞中蛋白質(zhì)的翻譯，從而影響多種腫瘤疾病進(jìn)程[70-72]。擬南芥MTA (METTL3的同系物) 突變體和VIR突變體都是在胚胎的球形期停止發(fā)育，其中MTA突變體中m6A水平減少了將近90%，突變體花器官異常、無頂端優(yōu)勢，生長模式發(fā)生改變[4,41]。擬南芥FIP37 (WTAP的同系物) 突變體m6A水平減少約85%，頂端分生組織過度繁殖，植株生長不正常[73]。擬南芥hakai突變體中m6A水平相對野生型降低35%，但沒有明顯的表型[51]。因此，擬南芥中除了HAKAI，其他m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體成員缺失對于胚胎發(fā)育都至關(guān)重要，但是各組分對于植物發(fā)育的影響強度又各有不同。

表1 mRNA常見修飾核苷的分布和功能Table 1 Distribution and function of modified nucleosides commonly found on mRNA

3.2 去除蛋白 (m6A eraser)

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的m6A eraser包括FTO和ALKBH5，它們都屬于ALKBH家族，可以去除包括DNA和mRNA上的m6A修飾[11,74-76]。最早的ALKBH蛋白是大腸桿菌中鑒定出來的，它通過氧化反應(yīng)去除雙鏈DNA上的m1A甲基基團(tuán)，參與修復(fù)DNA烷基化損傷[74]。人類細(xì)胞中ALKBH家族蛋白有9個，包括ALKBH 1-8和FTO。在大鼠中，ALKBH5在睪丸中表達(dá)量最高，其突變會影響精母細(xì)胞的減數(shù)分裂和大鼠育性[76-77]。早期研究顯示FTO與人類肥胖疾病相關(guān)，且影響人體內(nèi)多巴胺的水平，F(xiàn)TO缺失的小鼠脂肪組織減少，產(chǎn)后生長緩慢[78]。在其他動物細(xì)胞中的研究發(fā)現(xiàn)FTO與細(xì)胞分化及腫瘤的形成有關(guān)[75,79-82]。FTO主要定位于細(xì)胞核中，降低FTO的表達(dá)引起RNA上m6A水平的升高[11,83]。擬南芥中沒有發(fā)現(xiàn)FTO同源蛋白，但是有13個ALKBH蛋白。ALKBH家族蛋白種類多、分布廣，有可能識別單鏈或雙鏈DNA、單鏈RNA或雙鏈RNA，也有可能作為蛋白上的去甲基酶，不僅可以去除m6A，還有可能去除其他種類的甲基化修飾。ALKBH9B和ALKBH10B被證實有體外去甲基化的功能，ALKBH10B具有體內(nèi)去甲基化活性[84]。被AMV侵染的擬南芥中ALKBH9B活性降低，病毒胞內(nèi)復(fù)制減慢，推測可能和ALKBH9B與病毒粒子結(jié)合后去除了病毒RNA上的m6A有關(guān)[85]。擬南芥alkbh10突變體營養(yǎng)生長受到抑制，開花延遲[84]。與ALKBH類蛋白類似，F(xiàn)TO蛋白不僅能去除m6A和m6Am，還能識別除mRNA外的其他底物，關(guān)于m6A eraser還有很多問題尚待研究。

3.3 識別蛋白 (m6A reader)

如上文所述，m6A修飾水平的變化可引起生物體各種表型，可見m6A修飾對于生物的生長發(fā)育的重要性。細(xì)胞體內(nèi)m6A修飾的變化必須通過m6A reader，即m6A識別蛋白來發(fā)揮作用。目前發(fā)現(xiàn)的m6A reader主要是哺乳動物中的YTH蛋白家族。YTH是一類保守的蛋白家族，在人類、小鼠、酵母、果蠅、水稻、擬南芥中都存在，主要分為2個亞類：YTHDF和YTHDC。人類細(xì)胞的YTHDF2是第一個被鑒定的YTH蛋白，定位于細(xì)胞質(zhì)，該蛋白包含2個功能域：C端含YTH結(jié)構(gòu)域直接結(jié)合m6A；N端可使mRNA重新定位于P小體，促使其降解[86]。YTHDC1屬于細(xì)胞核定位的m6A識別蛋白，可以與pre-mRNA剪切因子SRSF3相互作用，抑制剪切因子SRSF10與mRNA的結(jié)合，影響mRNA的剪切，從而影響小鼠卵細(xì)胞的發(fā)育[87]。釀酒酵母的Mrb1屬于YTH蛋白家族；而Mmi1則是裂殖酵母中發(fā)現(xiàn)的YTH蛋白，調(diào)控酵母的生殖生長[88]。擬南芥中含有13個YTH類蛋白，其中ECT2、ECT3或ECT4的突變造成葉片表皮毛發(fā)育異常[89-90]。2018年Huang等利用RNA pull down及CLIP-seq等技術(shù)發(fā)現(xiàn)，人類細(xì)胞中的IGF2BP3也可結(jié)合含有GG(m6A)C基序的mRNA，這種結(jié)合增強mRNA的穩(wěn)定性，利于其在胞內(nèi)儲存[91]。

4 m1A

m1A甲基化是指RNA分子腺嘌呤第1位氮原子上的甲基化修飾。m1A是RNA修飾中比較重要且常見的一種修飾。m1A修飾不僅使腺嘌呤多了一個甲基，還使其在生理條件下附了一個正電荷，影響了RNA的結(jié)構(gòu)及與蛋白的互作。單個電荷的不同可以使蛋白和DNA之間的親和力相差100–1 000倍[92]。關(guān)于m1A修飾對tRNA結(jié)構(gòu)和功能的影響已有報道[93-95]，有研究顯示tRNA上的m1A修飾與環(huán)境脅迫相關(guān)[96-97]，而rRNA上的m1A修飾影響核糖體的合成和細(xì)菌對抗生素的耐受性[98-99]。

由于mRNA在胞內(nèi)豐度低，修飾檢測困難，因此mRNA上的修飾研究相對緩慢。在酵母、小鼠和人類等上千個轉(zhuǎn)錄組中都檢測到m1A的存在。TRMT6/TRMT61A復(fù)合體負(fù)責(zé)tRNA上m1A58 (第58位) 的甲基化，也可催化mRNA上m1A的形成，但需要與tRNA類似的基序GUUCRA和T-loop結(jié)構(gòu)的存在[100]。哺乳動物中m1A/A的相對豐度為0.015%–0.16%[7]，從分布上看，m1A在mRNA的5′-UTR、CDS、3′-UTR都存在，主要富集于起始密碼子附近及5′-UTR的GC富集區(qū)[7]。m1A修飾在不同物種中相對保守，由于其位于起始密碼子附近，因此可以促進(jìn)翻譯效率[7-8]。在堿性條件下，m1A可以發(fā)生化學(xué)重排，轉(zhuǎn)換成m6A[101]。人類細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)mRNA上的m1A修飾可以被ALKBH3去除[102-103]。m1A核苷修飾與翻譯的穩(wěn)定性及蛋白的合成相關(guān)，在不同的生理條件下 (如熱激、H2O2、饑餓狀態(tài))，m1A核苷修飾水平是動態(tài)變化的，但是其變化背后的調(diào)控機制尚不清楚。

5 m5C

m5C甲基化是指RNA分子胞嘧啶第5位氮原子上的甲基化修飾。早期研究發(fā)現(xiàn)DNA上的m5C修飾對于轉(zhuǎn)錄沉默和基因組印記具有重要作用[104-105]。RNA上m5C修飾的研究主要集中在tRNA和rRNA[6,104,106-107]，mRNA和lncRNA上的m5C修飾報道較晚[108-109]。tRNA中的m5C主要集中在可變環(huán)和反密碼子環(huán)，對于維持tRNA的二級結(jié)構(gòu)、密碼子的識別、tRNA的代謝以及對于氧化脅迫的感應(yīng)具有重要作用[102,104,110-114]。m5C修飾影響rRNA的加工、結(jié)構(gòu)，有研究報道rRNA上的m5C修飾與生物體壽命相關(guān)[115]。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)m5C修飾可以維持ncRNA的穩(wěn)定性[108]。

在HeLa細(xì)胞的2 243種RNA上發(fā)現(xiàn)5 399個m5C的修飾位點，其中94% (5 063/5 399) 的位點出現(xiàn)在mRNA上[6]。m5C位點主要集中在CDS區(qū)域 (約占總數(shù)的45%)，其中55%分布在CG富集區(qū)域，28%分布在CHG富集區(qū)域，17%分布在CHH富集區(qū)域 (H=A/C/U)[6]。在小鼠組織的3 904個mRNA中共發(fā)現(xiàn)9 788個m5C的修飾位點，小鼠組織mRNA的平均m5C水平達(dá)20.6%–23.2%，與人類HeLa細(xì)胞含量類似。小鼠中m5C位點分布與人類HeLa細(xì)胞相似，主要集中于CG富集區(qū)和CDS緊鄰翻譯起始位點下游區(qū)域[6,116]。mRNA上的m5C核苷修飾與ALYREF結(jié)合，介導(dǎo)mRNA的出核運動[6]。擬南芥mRNA中的m5C位點主要集中在3′-UTR[117]，預(yù)示著和動物中不同的調(diào)控模式。

在真核生物中有2種甲基轉(zhuǎn)移酶，催化mRNA和其他非編碼RNA上的m5C修飾：一種是TRDMT1，即已知的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT2)，參與動物、植物和裂殖酵母的tRNA修飾[107,118-120]；另一種是TRM4 (酵母) 或NSUN2(動物)[113,121-122]。NSUN2與哺乳動物癌細(xì)胞增殖，干細(xì)胞的自我更新及分化相關(guān)，nsun2–/–的小鼠雄性不育、體型變小、表皮分化缺陷，胚胎干細(xì)胞的自我更新和分化受影響[123-124]；人類研究中發(fā)現(xiàn)，NSUN2缺失的病人智力缺陷，體格小[125-128]。其他物種的研究發(fā)現(xiàn)，NSUN2突變的果蠅短期記憶能力缺陷[125]，而斑馬魚缺失DNMT2酶活性時，個體體型變小，胚胎的視網(wǎng)膜、肝臟和大腦發(fā)育缺陷[129]。

植物中m5C的相關(guān)報道很少。在擬南芥發(fā)現(xiàn)有TRM4A和TRM4B兩個同源基因[130-131]，其中trm4b突變體中mRNA的m5C修飾水平下降，根比較短，對于氧化脅迫更敏感，tRNA穩(wěn)定性降低[125]。

6 hm5C

hm5C是m5C的胞嘧啶第5位甲基發(fā)生氧化反應(yīng)，將一個H變?yōu)镺H后所得產(chǎn)物。該種核苷修飾于1978年首次從小麥幼苗的rRNA中發(fā)現(xiàn)[132]，但是直到最近人們才在mRNA中檢測到hm5C核苷修飾的存在[133]。2014年有學(xué)者發(fā)現(xiàn)Tet不僅可以使DNA形成hm5C修飾，也可催化RNA產(chǎn)生該種核苷修飾[133]。利用MeRIP-seq技術(shù)在果蠅中進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)，RNA中的hm5C修飾主要分布在CDS區(qū)，且在UC含量高的區(qū)域富集[10]。通過GO分析發(fā)現(xiàn)，mRNA上的hm5C修飾位點在與胚胎發(fā)育相關(guān)的基因中較豐富[10]，推測mRNA上的hm5C核苷修飾可能參與調(diào)控胚胎發(fā)育。翻譯活性較高的mRNA含有較多的hm5C修飾[10]，由此推測hm5C修飾可能參與調(diào)控基因的表達(dá)。缺少Tet的果蠅，RNA的羥甲基化水平下降，且果蠅的大腦發(fā)育受損[10]。但是由于檢測技術(shù)的限制，我們對于hm5C修飾的合成細(xì)節(jié)和調(diào)控模式還了解甚少，在植物中也未有關(guān)于mRNA的hm5C修飾的報道。

7 mRNA核苷修飾的檢測技術(shù)

隨著科技的進(jìn)步，mRNA核苷修飾的檢測技術(shù)也在快速發(fā)展。早期mRNA修飾常用放射性標(biāo)記技術(shù)[134-136]和薄層色譜法[137-138]來分析，但是這些方法成本高，操作過程繁瑣，且無法用于大規(guī)模的檢測和修飾位點的準(zhǔn)確定位。質(zhì)譜技術(shù)(LC-MS/MS，Liquid chromatography-tandem mass spectrometry) 和抗體免疫印跡法 (Dot-blotting)可實現(xiàn)修飾核苷的定量分析[11,76]，但是同樣也不能定位修飾位點。免疫沉淀法 (Immunoprecipitation，IP) 與二代測序技術(shù) (Next generation sequencing，NGS) 結(jié)合形成IP-seq技術(shù),應(yīng)用較多的有ChIP-seq[139]、PAR-CLIP[140-141]和MeRIP-seq[41]，前兩種技術(shù)用于檢測DNA/RNA與蛋白的結(jié)合，不能做定量分析，對于修飾位點的定位停留在數(shù)十個堿基到數(shù)百個堿基的區(qū)段，MeRIP-seq可以通過查找保守基序來確定修飾位點，但是該方法分析的是總RNA水平上的核苷修飾水平，且此方法的精確度受數(shù)據(jù)分析方法、序列比對軟件和測序深度等因素的影響較大。與MeRIP-seq相類似的另一種m6A修飾水平檢測方法m6A-seq[3]可檢測mRNA上的堿基修飾，分辨率在200 nt左右。miCLIP (m6A individual-nucleotide-resolution cross-linking and immunoprecipitation)[142]、SCARLET[143]、PA-m6A-seq (Photo-crosslinkingassisted m6A sequencing strategy)[144]等技術(shù)可達(dá)單核苷酸的分辨率，局限性包括：miCLIP對抗體的依賴性高；SCARLET無法實現(xiàn)高通量；PA-m6A-seq需要引入4-硫代尿苷 (4-thiouridine,4SU)，適用于動物細(xì)胞實驗。

8 總結(jié)與展望

近些年，RNA表觀遺傳學(xué)得到了越來越廣泛的關(guān)注，新的技術(shù)手段的出現(xiàn)大大加速了RNA修飾的研究進(jìn)展。但是目前仍有部分RNA修飾缺少直接有效的檢測手段，且在轉(zhuǎn)錄本層面的檢測精度有待提高?，F(xiàn)有的170余種RNA修飾中，mRNA修飾僅占18種，當(dāng)前的研究主要聚集在修飾位點的鑒定和修飾缺陷的表型分析。未來更大的挑戰(zhàn)是追蹤這些修飾位點的動態(tài)變化，以及從深層次揭示修飾的改變?nèi)绾斡绊懟?蛋白的表達(dá)和細(xì)胞的生命過程。

mRNA上部分修飾核苷，例如m6A和m5C的合成和去除，是動態(tài)可逆的，這種動態(tài)調(diào)控預(yù)示著在基因表達(dá)調(diào)控中的巨大潛能。哺乳動物中關(guān)于mRNA核苷修飾對mRNA加工、穩(wěn)定性、翻譯過程的影響，以及如何影響細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育、應(yīng)激反應(yīng)、癌癥發(fā)展和病毒感染等，已有很多研究成果，但植物中的相關(guān)研究還很有限，特別是大宗農(nóng)作物中幾乎未見報道。未來在植物中的工作將有助于我們對mRNA表觀修飾對真核生物的生長發(fā)育調(diào)控有更全面的理解。