姚薇，曲明星，崔曉慧，夏潤璽，劉限

沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧 沈陽 110866

引起甜瓜枯萎病的尖孢鐮刀菌是既可侵染植物又可在土壤內(nèi)生存的兼性寄生真菌[1]，一般從植物根部入侵，在不同時(shí)期均可使甜瓜枯萎致死，從而造成甜瓜產(chǎn)量和品質(zhì)下降[2]。目前農(nóng)業(yè)上通常采用化學(xué)農(nóng)藥防治枯萎病，但長期過量施用化學(xué)農(nóng)藥將嚴(yán)重污染土壤，造成土壤生態(tài)環(huán)境失衡和病原菌產(chǎn)生抗藥性[3]。因此，生產(chǎn)上急需環(huán)境友好型且不易使病原菌產(chǎn)生抗藥性的生物殺菌劑。納米粒子由于其在大小、分散程度和形狀等方面的特性表現(xiàn)出新的優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)和食品等領(lǐng)域引起廣大學(xué)者的關(guān)注[4]。許多金屬納米粒子對病毒、細(xì)菌和真菌等微生物都具有較強(qiáng)的殺菌活性[5]，其中AgNPs是被廣泛研究利用的金屬納米粒子，可以作為抗微生物劑、抗癌劑、光催化劑、抗氧化劑和殺蚊劑[6]。AgNPs的合成因物理和化學(xué)法的生產(chǎn)成本高和高毒性物質(zhì)的副作用而轉(zhuǎn)向生物合成。以細(xì)菌、真菌等微生物代謝物和植物提取物為還原劑和穩(wěn)定劑生物合成AgNPs，具有綠色環(huán)保和高安全性的特點(diǎn)[7-10]，其中對金屬具有高抗性和高聚合能力的真菌[11]能夠分泌細(xì)胞外酶而廣泛用于AgNPs的合成。目前已有多種木霉菌用于合成AgNPs，主要有棘孢木霉Trichoderma asperellum[12]、綠色木霉T.viride[13]、哈茨木霉T.harzianum[14]、蓋木斯木霉T.gamsiiIPT853[15]和長枝木霉T.longibrachiatum[16]，但不同木霉菌合成AgNPs的條件不同[17-18]。

本研究以橘綠木霉T.citrinoviride和毛簇木霉T.velutinous發(fā)酵液為還原劑和穩(wěn)定劑合成AgNPs，以UV-vis光譜表征特征探究不同合成條件對不同木霉菌合成AgNPs影響，以期明確木霉菌合成AgNPs的最適條件。同時(shí)研究不同木霉菌合成的AgNPs對尖孢鐮刀菌的抑菌活性，為農(nóng)用新型藥劑的開發(fā)和甜瓜枯萎病的防控奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種

橘綠木霉T.citrinoviride和毛簇木霉T.velutinous，分離于柞樹根系，保存于沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室。

尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum分離于甜瓜枯萎病根系，保存于植物保護(hù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室。

1.2 供試培養(yǎng)基

PDA固體培養(yǎng)基：將馬鈴薯去皮洗凈，稱量200 g并切塊，加入蒸餾水煮沸20–30 min，用紗布過濾后，將其濾液倒入鍋中加熱，加入瓊脂條20 g，不斷攪拌，待瓊脂條完全溶解后加入葡萄糖20 g，攪拌均勻，稍冷卻后再添加蒸餾水至1 000 mL，分裝于錐形瓶中，滅菌后備用。

PDB培養(yǎng)基：制備方法同上，培養(yǎng)基中不加入瓊脂。

1.3 試劑

硝酸銀 (分析純AR)，西隴科學(xué)股份有限公司；氫氧化鈉 (分析純AR)，西隴科學(xué)股份有限公司；鹽酸 (分析純AR)，西隴科學(xué)股份有限公司。

1.4 銀納米粒子的合成

木霉菌在PDA培養(yǎng)基上活化后轉(zhuǎn)移到PDB培養(yǎng)基中，在28 ℃、150 r/min下振蕩培養(yǎng)3 d。然后用無菌Whatman濾紙1號過濾菌絲，收集濾液 (使用此濾液合成AgNPs方法命名為CL法)和木霉菌絲。木霉菌絲 (10 g) 用無菌去離子水洗滌2次以除去培養(yǎng)基，然后加入100 mL無菌去離子水中，振蕩培養(yǎng)3 d，使用無菌Whatman濾紙1號過濾收集濾液 (使用此濾液合成AgNPs方法命名為CW法)。將200 μL AgNO3(1 mol/L) 加入100 mL濾液 (CL法或CW法) 中并在光照或黑暗條件下反應(yīng)5 d。離心 (12 991×g，30 min)收集合成的AgNPs，用無菌水洗滌2次，再用75%乙醇洗滌1次。合成的AgNPs自然干燥后稱重，備用。

1.5 銀納米粒子合成條件的優(yōu)化

1.5.1 不同反應(yīng)條件對合成銀納米粒子的影響

分別設(shè)置靜置暗反應(yīng)、靜置光照、振蕩暗反應(yīng)、振蕩光照4個(gè)反應(yīng)條件，每12 h進(jìn)行紫外可見光分光光度計(jì)全波長 (300–800 nm) 掃描，綜合分析利于AgNPs合成的條件。

1.5.2 底物AgNO3濃度對合成銀納米粒子的影響

根據(jù)前面試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置100 mL反應(yīng)液中AgNO3(1 mol/L) 的終濃度分別為1.0 mmol/L、2.0 mmol/L、3.0 mmol/L，于靜置光照條件下反應(yīng)24 h，分析反應(yīng)液中AgNO3濃度對AgNPs合成的影響。

1.5.3 不同pH對合成銀納米粒子的影響

根據(jù)前面試驗(yàn)結(jié)果，反應(yīng)液的pH分別調(diào)整為3、5、7、9，AgNO3濃度為2.0 mmol/L，于靜置光照條件下反應(yīng)24 h，分析pH對AgNPs合成的影響。

1.5.4 不同溫度對合成銀納米粒子的影響

根據(jù)前面試驗(yàn)結(jié)果，將反應(yīng)液 (pH：7；AgNO3濃度為2.0 mmol/L) 分別于25 ℃、35 ℃、45 ℃、55 ℃，靜置光照條件下反應(yīng)24 h，分析溫度對AgNPs合成的影響。

1.6 AgNPs對尖孢鐮刀菌的抑制作用

AgNPs沉淀于滅菌水中用超聲波細(xì)胞破碎儀將其充分破碎分散后，制成AgNPs水溶液，然后加入PDA培養(yǎng)基中，使AgNPs最終濃度分別為0 mg/L、25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L和200 mg/L。然后倒入培養(yǎng)皿中，晾干后接鐮刀菌菌餅，28 ℃下倒置暗培養(yǎng)7 d，測量鐮刀菌菌落直徑，計(jì)算AgNPs對鐮刀菌生長的抑制作用。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用軟件Excel (Office 2010) 整理和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 四種反應(yīng)條件下橘綠木霉T.citrinoviride CW法合成AgNPs的比較

橘綠木霉在靜置暗反應(yīng)、靜置光照、振蕩暗反應(yīng)、振蕩光照4個(gè)反應(yīng)條件下，采用CW法合成AgNPs，合成過程中每12 h進(jìn)行紫外可見光分光光度計(jì)全波長掃描。掃描結(jié)果表明，在靜置暗培養(yǎng)條件下從0–72 h、在400–500 nm范圍內(nèi)無寬吸收峰且波長位置幾乎重合，且反應(yīng)液顏色一直呈淡黃色 (圖1A)。在靜置光照條件下培養(yǎng)12 h后，438 nm處出現(xiàn)吸收峰，72 h達(dá)到最大值，且吸收峰位置基本保持不變，該特征吸收峰與文獻(xiàn)中報(bào)道的納米銀的UV-vis光譜吸收峰是一致的；反應(yīng)液顏色0 h時(shí)呈淡黃色，12 h變成棕色，72 h時(shí)顏色變深至黑褐色 (圖1B)。振蕩暗反應(yīng)和振蕩光照在0–48 h全波長掃描結(jié)果波形位置基本一致，60–72 h在400–500 nm之間吸收峰位置變高，反應(yīng)液在0–48 h顏色幾乎無變化，60–72 h變?yōu)樯铧S色 (圖1C和1D)。因此，T.citrinovirideCW法合成AgNPs過程中靜置光照的反應(yīng)條件是最好的，吸光度達(dá)到2.6 。

圖1 4種反應(yīng)條件對橘綠木霉CW法合成AgNPs的比較Fig.1 Effect of 4 reaction parameters on synthesis of AgNPs by T.citrinoviride with CW method.(A) Standing and dark.(B) Standing and light.(C) Shaking and dark.(D) Shaking and light.

2.2 四種反應(yīng)條件下毛簇木霉T.velutinous CW法合成AgNPs的比較

毛簇木霉在4種反應(yīng)條件下CW法合成AgNPs情況與橘綠木霉基本一致，也是在靜置光照條件下合成效果最好。研究發(fā)現(xiàn)，靜置光照條件下培養(yǎng)12 h后，438 nm處出現(xiàn)吸收峰，72 h達(dá)到最大值，且吸收峰位置基本保持不變 (圖2B)。因此，T.velutinousCW法合成AgNPs中靜置光照反應(yīng)條件下合成AgNPs效果最佳，吸光度達(dá)到2.7。

圖2 4種反應(yīng)條件對毛簇木霉CW法合成AgNPs的比較 (A：靜置暗反應(yīng)；B：靜置光照；C：振蕩暗反應(yīng)；D：振蕩光照)Fig.2 Effect of 4 reaction parameters on synthesis of AgNPs by T.velutinous with CW method.(A) Standing and dark.(B) Standing and light.(C) Shaking and dark.(D) Shaking and light.

2.3 四種反應(yīng)條件下橘綠木霉T.citrinoviride CL法合成AgNPs的比較

在4種反應(yīng)條件下，橘綠木霉T.citrinoviride合成AgNPs CL法明顯好于CW法，4種反應(yīng)條件下顏色變化明顯，都有AgNPs的生成。其中靜置光照條件下反應(yīng)顏色均在12 h開始變化，72 h時(shí)達(dá)到黑褐色，合成量明顯增加 (圖3)。結(jié)果顯示，靜置光照條件下培養(yǎng)12 h后，437 nm處出現(xiàn)吸收峰，72 h達(dá)到最大值，為10.2。根據(jù)反應(yīng)顏色變化及紫外掃描得出結(jié)論T.citrinovirideCL法在靜置光照條件下合成AgNPs合成效果好。

圖3 4種反應(yīng)條件對橘綠木霉CL法合成AgNPs的比較 (A：靜置暗反應(yīng)；B：靜置光照；C：振蕩暗反應(yīng)；D：振蕩光照)Fig.3 Effect of 4 reaction parameters on synthesis of AgNPs by T.citrinoviride with CL method.(A) Standing and dark.(B) Standing and light.(C) Shaking and dark.(D) Shaking and light.

2.4 四種反應(yīng)條件下毛簇木霉T.velutinous CL法合成AgNPs的比較

毛簇木霉CL法合成AgNPs與T.citrinovirideCL法合成AgNPs基本一致，但最佳合成條件下吸收峰在24 h達(dá)到最高，為3.2，隨著時(shí)間的延長吸收峰降低，推測可能是木霉菌發(fā)酵液中的部分還原性成分被破壞，發(fā)酵液的還原能力降低，AgNPs合成量降低。反應(yīng)顏色均在12 h開始變化 (圖4)，且光照培養(yǎng)顏色變化均明顯好于暗培養(yǎng)條件。根據(jù)反應(yīng)顏色變化及紫外掃描得出結(jié)論：T.velutinousCL法合成AgNPs在采用靜置光照條件合成AgNPs時(shí)合成效果最好。

圖4 4種反應(yīng)條件對毛簇木霉CL法合成AgNPs的比較Fig.4 Effect of 4 reaction parameters on synthesis of AgNPs by T.velutinous with CL method.(A) Standing and dark.(B) Standing and light.(C) Shaking and dark.(D) Shaking and light.

綜合兩種木霉菌在兩種合成方法和4種反應(yīng)條件下合成AgNPs的情況，木霉菌合成AgNPs以靜置光照下合成效果最佳，橘綠木霉的合成量高于毛簇木霉的。

2.5 硝酸銀濃度對木霉菌發(fā)酵液合成AgNPs的影響

反應(yīng)液中AgNO3濃度對兩種木霉菌發(fā)酵液合成AgNPs的影響見圖5。反應(yīng)液中AgNO3濃度為1.0 mmol/L時(shí)，兩種木霉菌都幾乎無吸收峰出現(xiàn)，而其他兩種濃度均在440 nm處出現(xiàn)吸收峰，說明合成了AgNPs。反應(yīng)液中AgNO3的濃度為2.0 mmol/L時(shí)，合成AgNPs的特征吸收峰的峰值最高。橘綠木霉合成AgNPs的量高于毛簇木霉。

圖5 反應(yīng)液中AgNO3濃度對木霉菌合成AgNPs的影響Fig.5 Effect of AgNO3 concentration in the reaction solution on the synthesis of AgNPs by Trichoderma strains.

2.6 pH對木霉菌發(fā)酵液合成AgNPs的影響

不同pH對兩種木霉菌發(fā)酵液合成AgNPs的影響見圖6。當(dāng)pH為3時(shí)，合成AgNPs吸收峰峰值較低，說明此條件下合成能力較弱；pH為7時(shí)，合成AgNPs的特征吸收峰的峰值最高，說明合成能力最好。在酸性條件下，合成的納米銀的特征吸收峰發(fā)生紅移(圖6)。當(dāng)pH為5–9時(shí)，兩種木霉菌發(fā)酵液合成AgNPs的量基本沒有影響。

圖6 pH對木霉菌合成AgNPs的影響Fig.6 Effect of pH on the synthesis of AgNPs by Trichoderma strains.

2.7 溫度對木霉菌發(fā)酵液合成AgNPs的影響

不同溫度對兩種木霉菌合成AgNPs的影響見圖7。45 ℃和55 ℃的特征吸收峰的峰值較高，55 ℃形成的是寬峰，說明AgNPs的粒徑較大；45 ℃形成的是窄峰，說明納米銀的粒徑較小。與45 ℃的特征吸收峰相比，其他條件下吸收峰發(fā)生紅移。因此，木霉菌合成AgNPs的最適反應(yīng)溫度為45 ℃。溫度對兩種木霉菌發(fā)酵液合成AgNPs的量基本沒有影響。

圖7 溫度對木霉菌發(fā)酵液合成AgNPs的影響Fig.7 Effect of temperature on the synthesis of AgNPs by Trichoderma strains.

2.8 AgNPs對尖孢鐮刀菌的抑制作用

兩種木霉菌均采用CL法合成AgNPs溶液，設(shè)置了0、25、50、100、200 mg/L五種不同的濃度，觀察對尖孢鐮刀菌的抑制效果。木霉菌合成的AgNPs對鐮刀菌都有抑制作用，在相同濃度下，兩種木霉菌合成的AgNPs對尖孢鐮刀菌沒有顯著性差異。不同濃度的AgNPs對尖孢鐮刀菌的抑制情況也有所不同。隨著濃度的增加，抑制效果越好。兩種木霉菌合成AgNPs都是在200 mg/L時(shí)抑制效果最好 (表1)。

3 討論

近年來，隨著綠色環(huán)保概念的普及，與傳統(tǒng)的化學(xué)、物理合成法相比，生物合成銀納米粒子的備受關(guān)注。許多生物已經(jīng)被用于合成金屬納米顆粒[19]，而微生物尤其是真菌可產(chǎn)生大量生物活性成分，這些成分在生物合成AgNPs過程中常被用作輔助劑、封端劑和穩(wěn)定劑，從而更有利于金屬納米粒子的合成[20]。本試驗(yàn)使用T.citrinoviride和T.velutinous合成AgNPs，通過改變反應(yīng)合成條件，發(fā)現(xiàn)T.citrinoviride和T.velutinous發(fā)酵液均可用于合成AgNPs，合成最適條件為CL法靜置光照培養(yǎng)，反應(yīng)液中AgNO3濃度為2.0 mmol/L，pH為7，反應(yīng)溫度為45 ℃。AgNPs的尺寸、形狀、形態(tài)、組成和介電環(huán)境決定了AgNPs的顏色，因此可借助UV-vis識別AgNPs的形成[21]。木霉菌發(fā)酵液和無色的AgNO3溶液于靜置光照下發(fā)生顏色變化，證實(shí)了AgNPs的合成[22]。隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，反應(yīng)顏色加深，表明AgNPs的濃度增加，說明AgNPs的形成與反應(yīng)時(shí)間成正比[23]。所有合成的AgNPs都在400–500 nm的波長處被吸收，所形成的AgNPs電鏡觀察大多為球形或扭曲的球形 (另有論文發(fā)表)，這與Dauthal和Mukhopadhyay的推測結(jié)果基本一致[24]。微生物發(fā)酵液合成AgNPs的條件，不同文獻(xiàn)報(bào)道不甚相同，Elgorban等[13]利用綠色木霉T.viride在靜置暗培養(yǎng)條件下合成AgNPs；張杰等[25]利用鉤狀木霉T.hamatun在150 r/min暗反應(yīng)合成AgNPs；Omran等[17]利用長枝木霉T.longibrachiatum合成AgNPs時(shí)發(fā)現(xiàn)，在振蕩的條件下攪拌速度的增加會(huì)引起反應(yīng)混合液發(fā)生湍流，這可能會(huì)造成AgNPs產(chǎn)率的降低；而Gade等[26]利用側(cè)耳屬Pleurotusspp.合成AgNPs時(shí)發(fā)現(xiàn)，在有陽光的情況下，Ag+的還原迅速發(fā)生，而在黑暗時(shí)需24 h才能完全還原。本試驗(yàn)中，在設(shè)置的4個(gè)反應(yīng)條件中 (靜置暗反應(yīng)、靜置光照、振蕩暗反應(yīng)、振蕩光照)，靜置光照合成效果較好，由此看出AgNPs合成條件與不同的微生物有關(guān)；采取兩種合成方法 (CL法、CW法)，發(fā)現(xiàn)CL法合成AgNPs的效果更好，可能是由于CL法的發(fā)酵液濾液中含有更多的木霉菌合成的各種有機(jī)物質(zhì)，從而有利于納米銀的合成。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，金屬硝酸鹽可以通過暴露于陽光下產(chǎn)生的熱量而分解，而真菌發(fā)酵液中的芳香族化合物通過光活化，芳香族化合物和蛋白質(zhì)作為封端劑啟動(dòng)金屬納米粒子的合成，真菌發(fā)酵液的光敏芳香族化合物向Ag+提供電子還原以形成具有封端劑的金屬納米粒子[27]。此外，隨著底物濃度從1.0 mmol/L增加到3.0 mmol/L，AgNPs的SPR峰略紅移，這可能是在更高的底物濃度 (3.0 mmol/L)下形成了較大尺寸AgNPs。其中，使用2.0 mmol/L合成的AgNPs表現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性。在反應(yīng)體系中，酸性pH條件下AgNPs的SPR峰發(fā)生紅移，這表明AgNPs的粒徑變大。在酸性pH條件下，生物代謝物主要以陽離子形式存在，如NH3+-R-COOH。質(zhì)子化的胺基之間存在靜電排斥，但是NH3+基團(tuán)傾向于吸附到銀納米顆粒的表面，從而降低了NH3+基團(tuán)之間的靜電斥力，因此，它決定了-COOH基團(tuán)之間氫鍵的優(yōu)勢，并導(dǎo)致納米粒子的聚集，因此AgNPs發(fā)生聚集導(dǎo)致粒徑變大。而在中性pH和堿性pH條件下，生物代謝物組分帶負(fù)電，從而將電子轉(zhuǎn)移到Ag+最終還原Ag+導(dǎo)致形成了小尺寸的AgNPs[28]。隨溫度升高AgNPs濃度顯著升高，而在高溫 (45 ℃、55 ℃)下，SPR峰略紅移。隨著樣品溫度的升高，納米顆粒的體積由于熱膨脹而增加，溫度的升高會(huì)導(dǎo)致納米粒子中自由電子的濃度降低，并導(dǎo)致SPR峰的紅移[29]。

表1 AgNPs對尖孢鐮刀菌的抑制率Table 1 Inhibitory rate of silver nanoparticles against F.oxysporum

木霉菌發(fā)酵液合成的AgNPs能夠抑制尖孢鐮刀菌的生長，兩種木霉菌合成的AgNPs對尖孢鐮刀菌的抑制沒有顯著性差異；不同濃度的AgNPs對尖孢鐮刀菌的抑制性存在顯著性差異，且隨著濃度的不斷增大，抑制效果越好。納米銀對金黃色葡萄球菌[30]、大腸桿菌[30]、植物病原真菌[31](灰霉病菌、尖孢鐮刀菌、白皮腐霉) 等都有抑制作用，說明AgNPs具有廣譜抑菌作用。后續(xù)研究還需明確AgNPs對甜瓜枯萎病的防治效果和是否對甜瓜生長有影響。

4 結(jié)論

兩種木霉菌發(fā)酵液均可合成AgNPs，合成AgNPs的最適條件：CL法靜置光照培養(yǎng)，底物AgNO3濃度為2.0 mmol/L，pH為7，反應(yīng)溫度為45 ℃。UV-Vis顯示AgNPs表面等離子體共振發(fā)生在437 nm處，出現(xiàn)最大吸收峰。兩種木霉菌生物合成AgNPs對尖孢鐮刀菌都具有抑制效果，濃度越高，抑制效果越好。